Aufbau eines sensitiven Selektions-Systems

Durch in vitro Expression des Genotyps wird die KF DNA-Polymerase synthetisiert, die den Phänotyp repräsentiert. Die Rückkopplung auf den Genotyp erfolgt, wenn die gebildete Polymerase das biotinylierte Triphosphat als Substrat erkennt und am 3’-Ende des Konstrukts einbauen kann. Auf diese Weise wird der Genotyp als ‚Hit’ markiert. Inaktive Varianten der DNA-Polymerase, die die modifizierten Substrate nicht einbauen können, werden nicht in der Lage sein, ihr codierendes Gen mit dem Affinitätsmarker zu kennzeichnen.

Die Detektion der positiv markierten Genotypen, erfolgt durch Inkubation der Proben an der Streptavidin-Matrix. In einem Kontrollversuch wurde das Selektions-System überprüft. Dabei wurde auf die in vitro Expression und anschließende Primerverlängerung verzichtet und nur das Immobilisierungsverhalten von biotinyliertem und unbiotinyliertem Konstrukt beobachtet.

Dafür wurden vier unterschiedliche Proben bestehend aus radioaktiv markiertem Gen in Verbindung mit biotinyliertem und unbiotinyliertem Konstrukt vorbereitet. Nach Immobilisierung der Proben auf Streptavidin-Matrix mit anschließender UV-Behandlung sollte nur in einem Fall (siehe Abbildung 40, rechte Spalte) die Detektion von Radioaktivität möglich sein. Mit diesem Experiment sollte auch die Effizienz der Ligations-Reaktion des Gens mit dem Konstrukt überprüft werden.

Ergebnisse

Abbildung 40. Schematische Darstellung des Ablaufs der Überprüfung der Selektion über Affinitätschromatographie.

Die Auswertung der eluierten Proben am Scintillation Counter ergab ein sehr unspezifisches Bindungsverhalten der Proben an der Matrix. Die Ausmessung der Proben sind in Tabelle 6 aufgeführt. Auffällig ist, dass die Proben, bei denen eine Ligations-Reaktion von Konstrukt und Gen durchgeführt wurde besonders schlecht an der Streptavidin-Matrix gebunden haben, während die Proben, an denen keine Ligations-Reaktion durchgeführt wurde, sehr gut an der Matrix gebunden haben.

Ergebnisse

Tabelle 6. Messungen der Eluate aus der Immobilisierungs-Studie am Scintillations Counter Ohne Ligation Mit Ligation

biotinyliert biotinyliert Gen

rxn 1.327.357 1.416392 881.561 749.568 633.845

Durchfluss 34.530 247.176 445.984 400.770 266.810

Waschen 1-5 197.270 416.303 415.131 377.376 292.188 UV-Bestrahlung

In wieweit Sekundärstrukturen des Gens bzw. des Konstrukts oder Coulomb-Wechselwirkungen zwischen der überschüssigen, negativ geladenen DNA und der durch protonierte NH2-Grupppen positiv funktionalisierten Oberfläche der Streptavidin-Matrix Ursache der unspezifischen Bindungen war, konnte anhand dieser Ergebnisse nicht erklärt werden. Unter Berücksichtigung der problematischen Ergebnisse der Eintopfreaktion, wurde von weiteren Optimierungsarbeiten an dieser Stelle abgesehen.

3.2.3 Diskussion

Für den Aufbau dieses Selektions-Systems mussten mehrere Anforderungen erfüllt werden:

a) reproduzierbare Herstellung der Kompartimente, b) Expression aktiver DNA-Polymerasen durch den in vitro Translations/Transkriptionsmix mit anschließender Primerverlängerungsreaktion, c) Synthese des Selektionskonstrukts, d) Aufbau eines effizienten Selektions-Systems.

Die reproduzierbare Herstellung der Kompartimente mit einer Größe von 2 bis 3 µm Durchmesser gelang mit Hilfe eines Magnetrührers. Die Überprüfung der Zellen ergab einen durchschnittlichen Durchmesser von 2.3 µm bei einer Drehgeschwindigkeit von 1050 rpm.

Der zweite Punkt bestand in der Überprüfung der erfolgreichen Expression des KF-Gens durch den in vitro Transkriptions/Translations-Mix.

Es konnte gezeigt werden, dass die in vitro Expression der KF DNA-Polymerase in den wässrigen Kompartimenten der Wasser/Öl-Emulsion erfolgreich abläuft und das exprimierte

Ergebnisse

Enzym aktiv ist. Bei den Aktivitäts-Messungen der Polymerase wurde aber auch sichtbar, dass der Expressionsmix eine Polymerase-Hintergrundaktivität aufweist. In Primerverlängerungsreaktionen wurde die Verlängerung des Primers auch dann beobachtet, wenn dem Expressionsmix kein Polymerase-codierendes Templat zur Verfügung stand. Für die Selektion auf artifizielle Nukleotide stellte diese Hintergrundaktivität noch kein Problem dar. In den durchgeführten Eintopfreaktionen, bestehend aus der in vitro Expression der Polymerase und anschließender Primerverlängerungsreaktion, wurde aber auch eine Primerverlängerung beobachtet, wenn keine dNTPs dem Reaktionsgemisch beigefügt waren. Dieses Ergebnis könnte durch den Abbau des Primers durch den Expressionsmix verursacht worden sein. Für die Selektion von Polymerasen auf den Einbau künstlicher Substrate ist dieses Ergebnis aber sehr problematisch. Durch den Abbau des Primers stehen den Mutanten so viel natürliche dNTPs zur Verfügung, dass eine Selektion auf den Einbau modifizierter Substrate, die in Konkurrenz zu den natürlichen stehen, unmöglich wird. Um das System zu etablieren wäre es an dieser Stelle sehr wichtig herauszufinden, wie es zu der Verlängerung des Primers in der Reaktion ohne dNTPs kommen konnte.

Parallel dazu wurde an der Synthese des Selektionskonstrukts gearbeitet. Die Verbindung des Polymerase-codierenden Gens mit dem Haarnadelschleifen-Konstrukts ermöglicht durch den Einbau biotinylierter Substrate eine Markierung positiver Mutanten. Die Detektion positiver Mutanten sollte anschließend über Biotin-Streptavidin Affinitätschromatographie erfolgen. Dieses Konstrukt stellt damit einen Schlüsselpunkt des Selektions-Systems dar.

Die Verbindung des Gens mit der Haarnadelschlaufe erwies sich als schwierig. Es war nicht möglich dieses Konstrukt über PCR-Primer anzubringen, da der überhängende Einzelstrang bei der PCR-Reaktion als Templat verwendet wird und dadurch als Haarnadelschlaufe verloren geht. Bei den durchgeführten Ligationsreaktionen war es schwierig eine erfolgreiche Reaktion nachzuweisen, da der Größenunterschied zwischen Gen und Gen+Haarnadelschlaufe zu gering ist. Radiometrische Kontrollen mit ³²P-markiertem Konstrukt verursachten bei der elektrophoretischen Auftrennung stark verschmierte Banden und waren dadurch schwer zu interpretieren. Alternativ dazu wurde versucht die Ligation des Konstrukts mit dem Gen über die spezifische Bindung an der Streptavidin-Matrix nachzuweisen. Dafür wurde in Probeläufen mit radioaktiv markierten Genen in Kombination mit biotinyliertem Konstrukt durchgeführt. Es wurden vier verschiede Proben vorbereitet, zum einen Gen + Konstrukt und Gen + biotinyliertem Konstrukt, aber unligiert. Und zum anderen Gen + Konstrukt und Gen + biotinyliertem Konstrukt, ligiert. Aus den Ergebnissen der Messung der Proben am Scintillations Counter konnte durchaus ein Unterschied im Bindungsverhalten beobachtet werden zwischen den Proben, die vorher ligiert wurden, und den Proben, die ohne Ligations-Reaktion immobilisiert wurden. Die ligierten Proben, und im

Ergebnisse

speziellen die Reaktion mit biotinyliertem Konstrukt zeigten aber besonders schlechte Bindung an der Streptavidin-Matrix (< 5 %), wohingegen die Proben, ohne vorherige Reaktion sehr gut gebunden haben (> 60 %). Welchen Einfluss die Ligations-Reaktion auf die Struktur oder Konformation der DNA-Fragmente hatte, und damit das Bindungsverhalten der Proben beeinflusst, konnte in diesem Rahmen nicht geklärt werden.

Die Ursache der starken Bindung der DNA an der Matrix könnte in Coulomb-Wechselwirkungen begründet sein. Zur Herstellung der Streptavidinbeats werden die Oberflächen der Beats mit NH2-Grppen funktionalisiert, an denen das Streptavidin angebracht wird. Überschüssige Gruppen liegen in Lösung protoniert vor, und können mit der negativ geladenen DNA wechselwirken. Vielleicht ist das kombinierte Konstrukt aus Gen und biotinylierter Haarnadelschlaufe zu sperrig und groß für dieses Selektionssystem.

Obwohl dieses System im Vergleich zu dem unter 3.1.2.5 angewendeten System den Vorteil bietet theoretisch sehr große Bibliotheken exprimieren und testen zu können, ist es für die Selektion von DNA-Polymerasen auf ein erweitertes Substratspektrum noch nicht geeignet.

Die auftretende Hintergrund-Aktivität des angewendeten Reaktionsmixes erschwert die Identifizierung von DNA-Polymerasen mit den gesuchten Eigenschaften. Optimierungen an diesem System lohnen sich erst, wenn ein geeignetes Selektionssystem aufgebaut ist.

Ergebnisse