Die Grundlage des Lebens beruht auf der Weitergabe der Erbinformation von einer Generation zur anderen. Dabei ist das gesamte Erbmaterial, das die Informationen für die Entwicklung und Fortpflanzung von Lebewesen enthält, in Form eines Polymers gespeichert, der Desoxyribonukleinsäure (DNA). Die Aufklärung der Doppelhelixstruktur der DNA im Jahre 1953 durch Watson und Crick1 führte zu ganz neuen Einsichten in die biologischen Vorgänge des Lebens und war ein entscheidender Schritt auf dem Weg zur Beantwortung der Frage „Wie funktioniert Leben?“. Rückblickend wurde mit dieser Entdeckung für viele Wissenschaftler das Zeitalter der molekularen Genetik eröffnet.
Die Doppelhelixstruktur der DNA besteht aus zwei Einzelsträngen, die sich umeinander winden. Jeder Einzelstrang ist aus zahlreichen aneinandergeknüpften Nukleotid-Bausteinen aufgebaut, die aus einer 2’-Desoxyribose-Einheit, einer Purin- oder Pyrimidin-Base und einer Phosphatgruppe bestehen. Natürliche DNA verwendet nur vier verschiedene Bausteine, Adenosin (A), Thymidin (T), Guanosin (G) und Cytidin (C), die sich ausschließlich in der Base unterscheiden. Die einzelnen Bausteine sind über eine Phosphodiesterbrücke miteinander verbunden. Die Zuckerphosphate bilden dabei das Rückgrat der DNA, während die Basen in das Innere der Helix zeigen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der DNA-Doppelhelix. Die beiden Stränge der DNA verlaufen ‚antiparallel’
und sind über Wasserstoffbrücken zwischen den Watson-Crick-Basenpaaren A-T und CG verbunden. Kugel = 2’-desoxy-Riboseeinheit
Einleitung
Die beiden Einzelstränge der Helix sind über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den gegenüberliegenden Basenpaaren verbunden. Dabei steht ein A immer einem T gegenüber und ein C immer einem G.
Die primäre Funktion der DNA besteht in der Speicherung der genetischen Information.
Diese ist durch die Reihenfolge (Sequenz) der Basen in den DNA-Strängen verschlüsselt.
Ein Block von drei Nukleotiden auf der DNA steht für eine Aminosäure im Protein und wird als Triplett oder Codon bezeichnet. Aus vier unterschiedlichen Nukleotiden lassen sich 43 = 64 Dreierkombinationen bilden, die die 20 natürlichen Aminosäuren kodieren.
Die Zuordnung, welches Triplett für welche Aminosäure kodiert, wurde in den sechziger Jahren des letzten Jahrhunderts geleistet. Durch die Entwicklung der chemischen Synthese von Nukleinsäuren durch Todd et al.2 gelang es Khorana et al. mit seinem Phosphodiesterverfahren, definierte Trimerblöcke und davon abgeleitete kurze repetitive DNA-Sequenzen zu synthetisieren, mit deren Hilfe die Entschlüsselung des genetischen Codes ermöglicht wurde3,4. Der experimentelle Durchbruch zur Beantwortung dieser Frage gelang 1961 durch Matthaei und Nirenberg, die das erste Codon (UUU → Phenylalanin) aufklären konnten5,6. Die vollständige Identifizierung aller 64 möglichen Tripletts stellte einen weiteren signifikanten Fortschritt in der Molekularbiologie dar.
Die Gesamtheit der DNA eines Organismus, das Genom, enthält den vollständigen Bauplan jedes Lebewesens. Die exakte Weitergabe der genetischen Information von Zelle zu Zelle und von Generation zu Generation ist daher von zentraler Bedeutung. Dieser
„Kopiervorgang“ des gesamten Erbmaterials wird als Replikation bezeichnet und erfolgt durch sukzessive, templatabhängige DNA-Synthese aus den vier natürlichen 2’-Desoxynukleotidtriphosphaten nach den Basenpaarungsregeln von Watson und Crick. Das für diesen Prozess verantwortliche Enzym wird als DNA-Polymerase bezeichnet.
1.1.1 Nukleinsäuren als funktionale Werkzeuge
In den letzten Jahren wurden die Bemühungen intensiviert, Nukleinsäuren für diagnostische und therapeutische Zwecke zu nutzen. Die Synthese von DNA-Molekülen, die an regulatorischen Sequenzen innerhalb des Genoms binden können und somit die Expression bestimmter Gene verhindern, bietet die Möglichkeit der Entwicklung neuer Medikamente für Krankheiten, bei denen ein einzelnes Protein maßgeblich an der Entstehung einer Erkrankung beteiligt ist. Aber auch die Möglichkeit, auf diese Weise die Expression von Virus-DNA im menschlichen Organismus zu unterbinden, eröffnet einen neuartigen Ansatz zur Behandlung vieler Viruserkrankungen. Der Einsatz kurzer DNA-Fragmente als
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Therapeutika findet bereits in der Antigen- und Antisense-Therapie7 Anwendung, sowie in der Aptamer-Technologie8.
Die Expression von Proteinen erfolgt über zwei Schritte. Im ersten Schritt wird die DNA in mRNA transkribiert und im zweiten Schritt wird die mRNA in ein Protein translatiert.
Bei der Antigen-Strategie bindet ein von außen zugegebenes Oligonukleotid selektiv an einem Ziel-Gen und blockiert dadurch die Transkription der mRNA. Dadurch kann die Expression eines bestimmten Proteins verhindert werden. Bei der Antisense-Technologie erfolgt die Blockade auf RNA-Ebene. Ein von außen zugegebenes Oligonukleotid bindet selektiv an eine Ziel-mRNA und verhindert die Translation des dazugehörigen Proteins.
Auf diese Weise besteht prinzipiell die Möglichkeit jedes pathogene Molekül durch maßgeschneiderte DNA-Moleküle auszuschalten. Erste Medikamente, die auf dem Antisense-Ansatz beruhen, sind bereits auf dem Markt, beispielsweise gegen den viralen Erreger der Netzhautentzündung9.
Bei Aptameren handelt es sich um kurze, dreidimensional gefaltete DNA- oder RNA-Moleküle, die andere Nukleinsäuren oder Proteine, aber auch kleine organische Moleküle oder Metallionen hochspezifisch erkennen und daran binden können10-12.
Der Vorteil dieser Technologien besteht in der Möglichkeit des rationalen Designs der Oligomere, gemäß den Watson-Crick-Basenpaarungsregeln. Darüber hinaus sind Nukleinsäuren sehr einfach verfügbar und können mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit durch automatisierte Prozesse synthetisiert werden.
Wichtige Faktoren für die effektive Verwendung von therapeutischen Oligomeren sind Nukleaseresistenz. Das Problem bei der Nutzung natürlicher Oligomere in Zellen besteht im metabolischen Abbau. Um die Halbwertszeit der Oligonukleotide in vivo zu erhöhen, wird oftmals mit modifiziertem Phosphodiesterrückgrat (Thiophosphate, PNA, LNA) oder modifizierten Nukleosiden gearbeitet. Eine Alternative dazu bietet die Verwendung von L-Oligomeren, die durch ihren spiegelbildlichen Aufbau gegen den enzymatischen Abbau resistent sind. Dieser Ansatz wird in der Aptamer-Technologie bereits verfolgt13,14.
Auch von Seiten der Materialwissenschaften wuchs in den letzten Jahren das Interesse an DNA-Molekülen. Die flexible Struktur der DNA findet Anwendung in der Nanotechnologie15,16. Auf diesen Bereich wird jedoch in dieser Arbeit nicht weiter eingegangen.
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