6.5 Methoden Kapitel 3.1
6.5.8 Expression und Reinigung von Pfu DNA-Polymerase exo -
6.5.8.1 Expression
Es wurden Übernachtkulturen von vereinzelten Kolonien der entsprechenden E. coli Stämme hergestellt (LB-Medium, 100 µg/ml Carbenicillin, Chloramphenicol 34 µg/ml). Die Hauptkultur wurde 2 %ig mit Übernachtkultur angeimpft und bis zu exponentiellen Wachstumsphase bei 37 °C inkubiert (OD600 = 0.4-0.6). Die Expression wurde durch AHT induziert, die Kulturen nach 4h weiterer Inkubation bei 37 °C zentrifugiert und das Pellet bei -80 °C gelagert
Zur Herstellung der Mutantenbibliothek von Pfu exo- A486Y wurden BL21 (pLysS) Rosetta Zellen als Expressionsstamm verwendet. Übernachtkulturen und Expressionskulturen wurden in jeweils 2,2 ml-96-Deepwellmikrotiterplatten durchgeführt. Die Platten wurden zur Inkubation mit semipermeabler Folie verschlossen und bei 220 rpm geschüttelt. Die nicht zum Animpfen verwendeten Übernachtkulturreste wurden für Glycerinkulturen verwendet (siehe Kapitel 6.3.3).
6.5.9 SYBR Green Assay für die Präselektion
Für die Präselektion der Mutanten-Bibliothek auf Polymerase-Aktivität wurden jeweils 15 µl Reaktionsmischung in vorgekühlten (4 °C), schwarzen 384-Loch-Mikrotiterplatten vorgelegt.
Dazu wurden anschließend 5 µl gekühlte Lysatlösung aus 96 Deepwell-Mikrotiterplatten zupipettiert. Die vorgelegte Reaktionsmischung enthielt dabei alle für eine PCR-Reaktion essentiellen Bestandteile und SYBR Green I, einen Farbstoff, der in der kleinen Furche doppelsträngiger DNA bindet und dabei eine Fluoreszenzverstärkung bei 485 nm Anregung und 520 nm Emission erfährt.
Methoden
Echtzeit-PCR (20 µl)
Reagenz Endkonzentration
Primer (20 mer, FT20H) 750 nM
Primer (20 mer, F20-) 750 nM
Templat (90 mer, F90A) 60 pM
10x Reaktionspuffer: 1x
(200 mM Tris-HCl, pH 8.8, 100 mM (NH2)2SO4, 20 mM MgSO4, 100 mM KCl, 1 % Triton-X100, 1mg/ml BSA)
SYBR Green I (1000x in DMSO) unterschiedlich
dNTP 250 µM
Lysat 5 µl
6.6 Methoden Kapitel 3.2
6.6.1 Emulsion
Die Ölphase wurde durch Lösen der Detergenzien Span80 (4,5 % (v/v)) und Tween80 (0,5 % (v/v)) in Mineralöl hergestellt. Übliche Emulsionsansätze enthielten 50 µl wässrige Phase und 950 µl Ölphase. Der Emulgierprozess erfolgte in 2 ml Eppendorfgefäßen auf Eis durch Rühren mit einem Magnetkern bei 1050 rpm
6.6.2 In vitro Expression
Die gekoppelte in vitro Transkription/Translation des KF-Gens mit T7-Promotor erfolgte in 50 µl Ansätzen. Die Reaktionen wurden nach Vorschrift des Promega S30 Expressions-Kit durchgeführt.
Methoden
In vitro Transkription/Translation (50 µl)
Reagenz Volumen
H2O 0.75 µl
S30 Premix 20 µl
Aminosäuremix (ohne Methionin) 5 µl KF--Gen (10 fmol/µl) 8 µl
[35S]-Methionin 1.25 µl
S30 Extrakt 15 µl
Die Reaktion wurde 2 h bei 37 °C inkubiert und anschließend 5 min auf Eis gestellt.
6.6.3 Aktivitätstest
Als Aktivitätstest für das in vitro exprimierte KF-Enzym wurde eine radiometrischen Primerverlängerungsreaktion duchgeführt. Zum Reaktionsgemische wurden 4 µl der in vitro Transkriptions/Translations-Reaktion gegeben und 15 min bei 37 °C inkubiert.
Primerverlängerungsreaktion (50 µl)
Reagenz Volumen
H2O 11 µl
10x KF-Puffer 5 µl
Primer (T20H, 3 pmol/µl) 5 µl Templat (CS33A, 10 pmol/µl) 5 µl
dNTP Mix (0.4 mM) 20 µl
Enzym aus in vitro T/T-Reaktion 4 µl
6.6.4 Eintopfreaktion
Die in vitro Expression erfolgte nach Protokoll des Herstellers (Promega, TnT Quick Coupled Transcription/Translation Systems). Zusätzlich wurden noch 0.85 pmol Primer und 2.82 pmol Templat sowie dNTPs hinzugegeben. Die Reaktion wurde 90 min bei 37 °C inkubiert.
Methoden
Reaktionsansatz (30 µl)
Reagenz Volumen
H2O 0.4 µl
Quick Master Mix 24 µl
Methionin [1 mM] 0.6 µl
PCR Enhancer 0.6 µl
Carrier DNA [15 nM] 2 µl
dNTP [ 2.5 nM] 1 µl
Primer/Templat-Komplex 1.4 µl
6.6.5 Ligations-Reaktion von KF-Gen und Haarnadelschlaufe
Für die Ligation wurden 80 pmol KF-Gen und 320 pmol Haarnadelschlaufe mit 8 mM ATP in 10 µl 1x Ligasepuffer 16 h bei 16 °C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion 20 min bei 65 °C hitzeinaktiviert. Das Reaktionsvolumen wurde mit Wasser auf 25 µl erhöht und die Reaktion über eine G25-Säule gereinigt.
6.6.6 Immobilisierung Biotin Streptavidin
Die DNA wurde 1 h bei 16 °C im Thermomixer (14000 rpm) auf 10 µl Streptavidin-Agarose immobilisiert. Anschließend wurde die Reaktion zentrifugiert (2000 rpm) und der Überstand verworfen. Die Matrix wurde 5x gewaschen (50 mM Hepes, 150 mMNaCl, 0.1 mM EDTA pH
= 7.0). Anschließend wurde die Reaktion 3 h bei 20 °C mit UV-Licht (365 nm) bestrahlt.
6.7 Methoden Kapitel 3.3
6.7.1 Circular Dichroismus-Spektroskopie
Zur Analyse der Nukleinsäure-Konformationen wurden Circulardichroismus-Messungen durchgeführt. Alle Circulardichroismus (CD)-Spektren wurden an einem JASCO J-720 Spektropolarimeter aufgenommen. Dafür wurden jeweils 350 µl einer Lösung des doppelsträngigen Oligonukleotides (15 µM in 20 mM KH2PO4 pH 7, 1 M NaCl) in einer 1 mm
Methoden
6.7.2 Thermische Denaturierungsstudien mit doppelsträngiger DNA
Schmelzkurven wurden auf einem Lamda 2 UV-Vis Spektrometer mit PTP-6 Temperaturkontrollgerät aufgenommen. Es wurden für jede Probe drei Heiz- und Kühlzyklen aufgenommen. Schmelzkurven wurden durch Subtraktion eines linearen Fits des unteren linearen Bereichs der erhaltenen sigmoidalen Kurve und anschliessende Normierung durch Division der resultierenden Kurve durch die Differenz aus oberer und unterer Fitgerade korrigiert. Schmelzpunkte (Tm in °C) wurden dem Wendepunkt der erhaltenen Schmelzkurve entnommen (A260 gegen Temperatur). Messungen wurden in 20 mM Tris-HCl pH = 7.5 und 20 mM NaCl aufgenommen und enthielten 600 nM Duplex DNA. Vor den Messungen wurden die Proben 5 min auf 95 °C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Eine Messung des Puffers ohne DNA wurde separat durchgeführt und von den Messungen der Proben vor der Auswertung subtrahiert.
6.8 Methoden Kapitel 3.4
6.8.1 Bindungsstudien
Für die Reaktion wurden 3 nM Primer und 4,5 nM Templat in einem Puffer aus 50 mM Tris HCl (pH 7.3), 10 mM MgCl2, 0.8 mM DTT und 10 % Glycerol für 5 min auf 95 °C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend wurde das Enzym in unterschiedlichen Konzentrationen der DNA-Mischung begefügt und 15 min bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Das Reaktionsvolumen betrug 15 µl. Für die elektrophoretische Auftrennung wurden die Proben mit 2 µl Ladepuffer versetzt und davon wurden 10 µl auf das Gel aufgetragen.
6.8.2 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Wechselwirkungen von Proteinen mit DNA wurden mit Hilfe von nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht. Dafür wurden 7 % Polyacrylamid Gele hergestellt (in 1.5 mm Dicke). Die hergestellte Gellösung wurde zwischen zwei gereinigte Glasplatten (12 cm max.
Lauflänge) gegossen, und die entsprechenden Kämme für die Geltaschen eingesetzt. Die Proben wurden mit einem Sechstel Volumen Ladepuffer gemischt und auf das nicht denaturierende Gel aufgetragen. Als Längenreferenz wurden die Farbstoffe Bromphenolblau und Xylencyanol verwendet. Die Trennung der freien DNA von DNA-Protein-Komplexen
Methoden
erfolgte bei einer Spannung von 63 V für 5 min und 48 V für 4 h bei 4 °C. Die Detektion erfolgte autoradiographisch.
7 % natives Polyacrylamid Gel
Reagenz 100 ml
Acrylamid 29:1 23,2 ml
10x TBE 10 ml
Wasser 66,8 ml
APS 720 µl
TEMED 40 µl
Laufpuffer
Reagenz Endkonzentration
Tris- HCl 25 mM
Borsäure 25 mM
MgCl2 2 mM
EDTA 0.5 mM
6x Ladepuffer
Reagenz 100 ml
Glycerol 30 ml
Wasser 70 ml
Bromphenolblau 0.25 %
Xylencyanol 0.25 %
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