Konstruktion einer Mutantenbibliothek der Pfu DNA-Polymerase

Die gerichtete Evolution von Enzymen basiert auf vier wesentlichen Schritten: a) dem Aufbau einer Mutantenbibliothek, b) der Verknüpfung von Genotyp und Phänotyp, c) der funktionalen Expression der Bibliothek, und d) der Entwicklung eines sensitiven Testsystems, um Mutanten mit den gewünschten Eigenschaften zu identifizieren¹¹⁵.

In den letzten Jahren wurde ein großes Repertoire an Methoden entwickelt, um eine hohe Diversität in Mutantenbibliotheken zu erzielen. Das reicht von randomisierten Oligonukleotid Kassetten und error-prone PCR bis hin zu Methoden für die Rekombination (DNA-shuffling) mutierter DNA-Fragmente¹¹⁶. In vielen Studien wurde gezeigt, dass Mutagenese durch

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Punktmutationen in DNA ist^44,117. Das Ziel war nach Erstellen einer Bibliothek ausgehend von der Mutante A486Y der Pfu DNA-Polymerasen, Varianten zu identifizieren, die verbesserte Eigenschaften in Bezug auf den Einbau von L-Nukleotiden aufweisen.

Ein Ansatz für die Konstruktion einer Mutantenbibliothek war die Randomisierung der DNA-Sequenz der Fingerdomäne, um diesen Bereich des Enzyms speziell zu untersuchen. Die Randomisierung des Fingerbereichs und der anschließende Einbau des Pools in das Pfu-Gen im Expressionsplasmid sollte durch PCR-Reaktionen in zwei Schritten erfolgen (Abbildung 24).

Im ersten Schritt wurde der Fingerbereich des Gens mittels error-prone PCR randomisiert.

Um eine Bevorzugung von Transitions-Mutationen zu vermeiden, wurden die dNTPs in der PCR in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet. Die Konzentrationen von dCTP und dATP blieben bei 0,2 mM, während die Konzentrationen für dGTP und dTTP um den Faktor fünf erhöht wurden.

Die natürliche Fehlerrate der Taq DNA-Polymerase (10^-4 bis 10^-5) kann durch Variation der Reaktionsbedingungen gesteigert werden. Durch Zugabe von Triton⁴⁵, DMSO⁴⁶ oder Manganionen¹¹⁸ kann bei der Vervielfältigung von DNA-Fragmenten der Länge 250-1200 bp eine Fehlerrate von bis zu 3.1 % erhalten werden. Die Anzahl der mutierten Gene kann durch Anzahl der effektiven Verdopplungen, also der Anzahl der PCR-Zyklen und durch die Ausgangsmenge an Templat beeinflusst werden.

Abbildung 24. Schema zur Herstellung des randomisierten Fingerbereichs mittels Megaprimer PCR. Im ersten Schritt wird der Fingerbereich über Error-prone PCR randomisiert. Im zweiten Schritt wird der Produkt-Pool als Megaprimer für die Amplifizierung des gesamten Plasmids eingesetzt.

Vor dem Einsatz in der zweiten PCR wurde das 224 bp Produkt durch Agarosegelelektrophorese gereinigt, um das als Templat eingesetzte Plasmid aus dem Gemisch zu entfernen. Im zweiten Schritt wurde das gereinigte Produkt als Megaprimer für die Amplifizierung des gesamten Plasmids eingesetzt. Ein Ansatz der Megaprimer-PCR zeigte bei der elektrophoretischen Auftrennung ein PCR-Produkt derselben Länge wie das als Längenmarker aufgetragene Expressionsplasmid (Abbildung 25B, Bahn 2 und 6), es war

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aber nicht möglich das erhaltene Produkt erfolgreich zu transformieren und die transformierten Zellen auf Agar-Platten zu vereinzeln.

Abbildung 25. 0,8 % Agarosegelelektrophorese. PCR-Reaktionen zur Herstellung einer Plasmidbibliothek mit der zweistufigen Megaprimer PCR. A Randomisierung des Fingerbereichs (224 bp) unter Verwendung der Taq DNA-Polymerase. Bahn M: Längenmarker. Bahn 1-3: PCR-Reaktionen mit 0.1, 0.5 und 1.0 ng Templat. B Megaprimer PCR (Whole Plasmid Amplification). Bahn M: Längenmarker. Bahn 1-2: PCR-Reaktionen mit jeweils 7 pmol Primer bei 40 °C (1) und 53,3 °C (2) Annealing Temperatur. Bahn 3-4: PCR-Reaktionen mit jeweils 14 pmol Primer bei 40 °C (3) und 53,3 °C (4) Annealing Temperatur. Bahn 5: Kontrolle ohne Primer. Bahn 6: Plasmid pET Pfu exo^-.

Auch nach Optimierungen der Megaprimer PCR, der Reinigungsschritte der PCR-Produkte und der Transformationsreaktion war es nicht möglich, mit dem erhaltenen PCR-Produkt eine Bibliothek aufzubauen. Nach der Transformation in Zellen konnte kein Wachstum der Kolonien auf Agar-Platten erzielt werden.

Parallel zu diesem Ansatz wurde auch das gesamte Gen der Pfu DNA-Polymerase randomisiert. Der Optimierungsaufwand für diesen Ansatz war wesentlich geringer. Die Randomisierung des kompletten Gens der Polymerase erfolgte mittels error-prone PCR. Die mutierten PCR-Produkte wurden in das Expressionsplasmid kloniert und nach Transformation in E. coli Zellen mittels Elektroporation wurden die Plasmide auf Agar-Platten mit dem entsprechenden Selektionsantibiotikum vereinzelt. Jede Kolonie wurde von dort in eine separate Vertiefung einer 96-Loch-Platte zur Expression übertragen, um auf diese Weise eine räumliche Zuordnung des Genotyps mit dem Phänotyp zu ermöglichen (Abbildung 26).

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Abbildung 26. Schematische Darstellung zur Herstellung einer Bibliothek mutierter DNA-Polymerasen. Die Mutationen wurden in das Wildtyp-Enzym durch randomisierte Mutagenese über error-prone PCR eingeführt. Das PCR-Produkt wurde in den Expressionsvektor kloniert und in E. coli Zellen transformiert. Nach dem Ausstreichen auf Agar-Platten wurden die vereinzelten Kolonien, die jeweils eine Mutante enthalten, mit Zahnstochern gepickt und in 96-Loch-Platten mit LB-Medium übertragen. Dort erfolgte die Expression und die anschließende Lyse der einzelnen Klone, um sie dann im Screening auf neue Eigenschaften zu testen.

Die Mutationsrate muss bei der Generierung einer Bibliothek sehr sorgfältig eingestellt werden, da bei einer zu geringen Mutationsrate nur der Wildtyp wieder gefunden wird, und bei einer zu hohen Mutationsrate nur inaktive Enzyme erhalten werden. Der Literatur ist zu entnehmen, dass die Fehlerrate der Taq DNA-Polymerase von der Mangan-Konzentration, der Anzahl der PCR-Zyklen und der Menge an eingesetzter Templat-DNA bestimmt wird. Für den Aufbau der Mutantenbibliothek wurden Bedingungen gewählt unter denen ungefähr 50 % der erzeugten Mutanten aktiv sind (siehe Kapitel 6.5.3).

Das erhaltene PCR-Produkt hatte eine Länge von 2365 bp. Der doppelsträngige DNA-Pool wurde mit dem Restriktionsenzym BsmBI geschnitten und anschließend durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Um den randomisierten Pfu-ORF in den, für den Aufbau der Bibliothek verwendeten, Expressionsvektor pASK37plus zu klonieren, wurde dieser mit dem Restriktionsenzym BsaI verdaut und anschließend mit Antarctic Phosphatase dephosphoryliert. Es folgte die Ligation der beiden Fragmente mit T4 DNA-Ligase und Transformation des gereinigten Produkts in E. coli Zellen mittels Elektroporation.

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Abbildung 27. 0,8 % Agarosegelelektrophorese. PCR-Reaktionen zur Herstellung einer Plasmidbibliothek. A = error-prone PCR-Ansatz zur Herstellung des randomisierten ORF unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase.

Bahn M Längenmarker. Bahn 2: Produkt der PCR-Reaktion (2365 bp). Templat war Pfu exo^- A486 in pET30 Vektor B = Ligations-Reaktion. Bahn M: Längenmarker. Bahn 1: pASK-IBA 37plus-Vektor. Bahn 2: negativ Kontrolle, Ligation des verdauten Vektors ohne Insert. Bahn 3: Ligations-Reaktion. Verhältnis Vektor : Insert 5:1.

Bahn 4: Ligations-Reaktion. Verhältnis Vektor : Insert 5:1 mit Zusatz von Polyethylenglycol (PEG 400). Bahn 5:

pASK-IBA 37plus mit Pfu ORF als Längenvergleich. Experimentelle Details siehe 6.5.6. Oligonukleotidsequenzen siehe 8.1.

Zur direkten Überprüfung einzelner Bakterienkolonien auf erfolgreiche Klonierung des Inserts in den Vektor wurden Kolonie-PCRs durchgeführt. In Abhängigkeit von Vektor-Insert Verhältnis lag die Ligationsrate bei 80 %.

Abbildung 28. 0,8 % Agarosegelelektrophorese. PCR-Ansätze zur Kontrolle des Ligationserfolges. Gezeigt wird Kolonie-PCR. Bahn M: Längenmarker. Bahnen 1 bis 7: Ligationskontrolle durch PCR-Reaktion auf Bakterien-Kolonie als Templat mit Primern komplementär zum Pfu ORF. Die Banden bei ~2300 bp zeigen an, dass das Insert in den Vektor ligiert wurde. Bahn 8: negative Ligationskontrolle. Experimentelle Details siehe 6.5.7.

Oligonukleotidsequenzen siehe 8.1.

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