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Diese Arbeit wurde angeleitet von Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht.
Promotionsgesuch eingereicht am: 24. November 2011 Tag der mündlichen Prüfung: 16. Dezember 2011
Prüfungsausschuss: Prof. Dr. Axel Jacobi von Wangelin (Vorsitzender)
Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht
Prof. Dr. Otto S. Wolfbeis
Prof. Dr. Joachim Wegener
Des is wia bei jeda Wissenschaft, am Schluss stellt sich dann heraus, dass alles ganz anders war.
Karl Valentin
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von September 2008 bis November 2011 am Institut für Organische Chemie der Universität Regensburg unter Anleitung von Herrn Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht angefertigt.
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht. Er ermöglichte mir die Promotion in seinem Arbeitskreis und den Zugang zu dem spannenden Gebiet der DNA-Chemie. Ebenso danke ich ihm für die hervorragende Betreuung und Unterstützung sowie für die wissenschaftliche Freiheit, die ich während dieser Zeit erfuhr.
Im speziellen möchte ich mich bedanken bei:
Herrn Prof. Dr. Wolfbeis für die Möglichkeit einer Kooperation mit Upconverion Nanopartikeln. In diesem Zusammenhang gilt mein besonderer Dank Daniela Achatz und Dr. Heike Mader für die Bereitstellung der Nanopartikel und der stets so hilfsbereiten Beantwortung aller meiner Fragen.
Herrn Prof. Dr. Wegener für die Möglichkeit unsere Ideen an Zellen zu verwirklichen. In diesem Zusammenhang gilt mein besonderer Dank Dr. Judith Stolwijk und Michaela Sperber für die Zellkulturen und Cytotoxizitätstests.
Herrn Prof. Dr. Gregory Harms für die Aufnahmen am Fluoreszenzmikroskop.
Herrn Prof. Dr. Witzgall und Herrn Prof. Dr. Göpferich für die Möglichkeit die entwickelte Fluoreszenzsonde bioanalytisch einzusetzen. In diesem Zusammenhang besonders Sabrina Kracher, die sämtliche Zellexperimente durchführte und mir die dort entstandenen Aufnahmen zur Verfügung stellte.
Heiko Sigmund vom Institut für Pathologie am Klinikum der Universität Regensburg sowie Herrn Dr. Schneider vom Laboratorium für Elektronenmikroskopie am KIT für die Anfertigung der TEM-Bilder.
Dr. Thomas Burgemeister und seinen Mitarbeitern der NMR-Abteilung der Universität Regensburg für die Messung und Interpretation meiner Proben.
Josef Kiermeier und Wolfgang Söllner für die Anfertigung und Interpretation der Massenspektren meiner Proben.
Frau Weck und Frau Sommer für ihre stetige Hilfsbereitschaft und Unterstützung in organisatorischen und verwaltungstechnischen Belangen.
Der Regensburger Chemiker-Bergsporttruppe (Wolfgang, Hias, Walter, Julian und Tom) für die herzliche Aufnahme und die schöne Zeit außerhalb des Labors.
Meinen Kollegen: Dr. Janez Barbaric, Sebastian Barrois, Effi Bätzner, Dr. Sina Berndl, Dr. Christoph Beyer, Peggy Bohländer, Andreas Dittmer, Dr. Thomas Ehrenschwender, Nadine Herzig, Carolin Holzhauser für die Bereitstellung des Thiazolrot, Annette Hochgesand, Fabio Krohm, Daniel Lachmann, Michaela Lutz, Dr. Florian Menacher, Alexander Penner, Dr. Christa Prunkl, Wolfgang Schmucker, Nico Seeleib, Sabrina Sezi, Claudia Stubinitzky, Dr. Reji Varghese, Dr. Claudia Wanninger-Weiß, Michael Weinberger, Christian Wellner und Ulrike Wenge für die schöne Zeit im AK Wagenknecht.
Meinen Laborkollegen Tom, Caro, Flo, Daniel, Christian und Gaudi Claudi, die mir nach drei schönen Jahren gute Freunde geworden sind.
Besonders möchte ich den beiden Menschen danken, ohne die weder diese Arbeit, noch vieles andere möglich geworden wäre. Meinen Eltern, die mir viel mehr mitgaben als DNA. Ich hoffe sie wissen wie dankbar ich ihnen für alles bin!
Zuletzt gilt mein Dank einer tollen Frau: Julia Baur, für die wunderbaren Jahre aber am meisten dafür, dass sie so ist wie sie ist.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Themenstellung ... 4
3 Theoretischer Hintergrund ... 6
3.1 Cyaninfarbstoffe und CyIQ ... 6
3.2 Fluoreszenzmarkierung von Oligonukleotiden / DNA Sonden ... 9
3.3 Excitonische Wechselwirkungen und Excimere ... 14
3.4 DNA-Nanopartikel ... 21
3.4.1 Nanopartikel und ihre Anwendungen ... 21
3.4.2 Upconversion Nanopartikel ... 23
3.4.3 Verknüpfung von DNA mit Nanopartikeln ... 27
3.4.4 Cytotoxizität ... 30
4 Entwicklung von DNA-Sonden mit CyIQ ... 34
4.1 Synthese und Klick-Konjugation ... 35
4.1.1 Synthese des Cyanin Farbstoffs CyIQ ... 35
4.1.2 Synthese des 2´-O-Propargyl-Uridins ... 36
4.1.3 Synthese modifizierter Oligonukleotide ... 39
4.1.4 Klick-Konjugation mit CyIQ ... 40
4.2 Untersuchung photophysikalischer und elektronischer Eigenschaften ... 43
4.2.1 Absorptions- und Fluoreszenzverhalten von CyIQ ... 43
4.2.2 Redoxeigenschaften ... 47
4.2.3 Photostabilität ... 52
4.3 Untersuchung von CyIQ-Monomeren ... 61
4.4 Untersuchung von Interstrang Dimeren ... 66
4.4.1 Homodimere ... 67
4.4.2 Heterodimere (FRET von CyIQ auf Thiazolrot) ... 75
Inhaltsverzeichnis
4.5 Untersuchung von Intrastrang-Dimeren ... 81
4.5.1 Heterodimere (FRET von CyIQ auf Thiazolrot) ... 82
4.5.2 Homodimere („ECHO-Sonden“) ... 86
5 Bioanalytische Anwendungen von CyIQ-DNA ... 94
5.1 Detektion von Punktmutationen ... 94
5.2 Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie ... 105
7 DNA-funktionalisierte Upconversion-Nanopartikel ... 112
7.1 Methodenentwicklung ... 114
7.2 Charakterisierung ... 119
8 Anwendungen von UCNP-DNA Konjugaten ... 122
8.1 Quervernetzung durch Ziel-DNA ... 122
8.2 Zelluläre Bildgebung ... 129
8.3 Untersuchungen zur Cytotoxizität ... 132
9 Zusammenfassung ... 136
9.1 Funktionelle DNA-Sonden mit CyIQ ... 136
9.2 DNA-modifizierte Upconversion-Nanopartikel ... 138
10 Materialien und Methoden ... 139
10.1 Materialien, Geräte und allgemeine Methoden ... 139
10.2 Optische Spektroskopie ... 145
10.3 Synthesevorschriften ... 147
10.3.1 Darstellung des Cyaninfarbstoffs CyIQ ... 147
10.3.2 Darstellung des 2´-Propargyl modifizierten Uridins ... 151
10.4 DNA-Synthese ... 157
10.4.1 Synthese modifizierter Oligonukleotide ... 157
10.4.2 Aufarbeitung und Charakterisierung der Oligonukleotide ... 159
10.5 Upconversion Nanopartikel ... 160
Inhaltsverzeichnis
10.6 Klickreaktion ... 162
10.6.1 Klickreaktion von Oligonukleotiden mit CyIQ ... 162
10.6.2 Klickreaktion von DNA mit Upconversion-Nanopartikeln ... 163
10.6.3 Aufarbeitung und Reinigung von UCNP-DNA-Konjugaten ... 164
10.7 Untersuchungen von CyIQ-DNA ... 165
10.8 Zellkulturen und Versuche ... 167
10.9 Liste verwendeter DNA-Sequenzen ... 169
11 Literaturverzeichnis ... 173
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin, 2´-Desoxyadenosin
abs. absolut
bzgl. bezüglich
bzw. beziehungsweise
B Helligkeit (brightness; B = ε • Φ) C Cytosin, 2´-Desoxycytidin
CD Circulardichroismus
CI Chemische Ionisation
CPG Controlled Pore Glass CyIQ Cyanine Indole Quinoline
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Da Dalton = g/mol
DC Dünnschichtchromatographie
DCM Dichlormethan
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DMF Dimethylformamid
DMT 4,4´-Dimethoxytrityl DNA Desoxyribonukleinsäure d. Th. der Theorie
entspr. entspricht, entsprechend EI Elektrische Ionisation
EMBL European Molecular Biology Laboratory ESI Elektrosprayionisation
FAB Fast Atom Bombardment (Ionisierungsmethode in der MS) FACS Fluorescence Activated Cell Sorting (Durchflusscytometrie) FRET Fluoreszenzresonanz-Energietransfer
exc Anregung (excitation) FKS Fötales Kälberserum
GPC Gel-Permeations-Chromatographie (entspricht SEC)
Abkürzungsverzeichnis
isokrat. isokratisch
J Kopplungskonstante
kU klick-Uridin (2´-O-Propargyl-Uridin) h Stunde
HPLC High Performance Liquid Chromatography (Hochleistungs- flüssigkeitschromatographie)
HR-MS Hochauflösende Massenspektroskopie (HR = high resolution)
Hz Hertz
i. d. R. in der Regel
IR Infrarot (λ = 780 nm – 1 mm), Infrarotspektroskopie LC Liquid Chromatography
m Multiplett
M molar; mol/L
MALDI Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization
mbar Millibar
MeCN Acetonitril
MeOH Methanol
mg Milligramm
min. Minute
mL Milliliter
mm Millimeter
MS Massenspektrometrie
m/z Verhältnis Masse zu Ladung
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NIR Nahes Infrarot (λ = 780 nm – 3 µm) NHE Normalwasserstoff-Elektrode
nm Nanometer
NMR Kernspinmagnetresonanz (Nuclear Magnetic Resonance)
NP Nanopartikel
Po Ausgangsleistung Laser (optical output power)
PBS Phosphate buffered saline (Phosphatgepufferte Salzlösung) PCR Polymerase Chain Reaction
Abkürzungsverzeichnis
ppm parts per million
RP Reversed Phase
RT Raumtemperatur
rpm rotations per minute
s Singulett, Sekunde
SEC Size Exclusion Chromatography (Größenausschluss- chromatographie) veraltete Bezeichnung für GPC
s. o. siehe oben
T Thymin, 2´-Desoxythymidin
Tm Schmelzpunkt [°C]
TBTA tris-(Benzyltriazolylmethyl)amine
THF Tetrahydrofuran
TMS Trimethylsilyl
TO Thiazolorange
TOF Time of Flight
TR Thiazolrot
UC Upconversion
UCNP Upconversion Nanopartikel
UV/Vis Ultraviolettes- und sichtbares Lichtspektrum (190 – 800 nm)
V Volt
vgl. vergleiche
Vol. Volumen
z. B. zum Beispiel
z. T. zum Teil
Symbole
λ Wellenlänge
Å Ångström
Ø Durchmesser, Durchschnitt δ Chemische Verschiebung
Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celcius
µm Mikrometer
τf Fluoreszenzlebenszeit
ΦF Fluoreszenzquantenausbeute
λmax/A Wellenlänge des Absorptionsmaximums
λmax/F Wellenlänge des Fluoreszenzmaximums
∆λF – A Stokes-Verschiebung (λmax/F - λmax/A)
Die in dieser Arbeit verwendete Nomenklatur orientiert sich an den Chemical Abstracts[a] und an den von der IUPAC-IUB-Kommission[b] empfohlenen Richtlinien.
Fachausdrücke aus dem Englischen werden kursiv gedruckt. Die Schreibweise von Fachausdrücken orientiert sich am DUDEN für chemische Fachausdrücke.[c] Nach DIN5008 wird als Dezimaltrennzeichen das Komma verwendet.
[a] Chemical Abstracts, Index Guide, 77.
[b] i) IUPAC Commision on Nomenclature of Organic Chemistry (CNOC) und UPACIUB Joint Commision on Biochemical Nomenclature (JCBN), Biochemistry 1971, 10, 3983-4004. ii) IUPAC-IUB (CBN); Tentative Rules for Carbohydrate Nomenclature, Eur. J. Biochem. 1971, 21, 455-477.
[c] O.-A. Neumüller, Duden – Das Wörterbuch chemischer Fachausdrücke, Bibliographisches Institut, Mannheim, 2003, Auflage.
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Einleitung
Auf ähnliche Weise verändern Schäden an unseren DNA-Basen den genetischen Code.[13, 14] Täglich wird unsere DNA durch UV-Strahlung, Chemikalien oder reaktive Sauerstoffspezies tausendfach geschädigt. In aller Regel merken wir davon nichts, da sie mit einer beispiellosen Effizienz repariert werden.[15, 16] Aber nicht immer. Ein Beispiel: In über 50 % aller Tumoren findet man eine inaktive Variante des Tumorsuppressorproteins p53.[17-20] Die Ursache für diese Inaktivität liegt in einem DNA-Schaden der durch die Reperaturmechanismen des Körpers nicht behoben wurde.
Diese Beispiele verdeutlichen, dass wir einerseits verstehen und detektieren können, wie sich unsere DNA auf molekularer Ebene durch bestimmte Einflüsse verändert. Wie steht es aber um die Möglichkeit, darauf Einfluss zu nehmen und Schäden zu beheben bevor eine Krankheit ausbricht? Einige der wichtigsten Erkenntnisse dazu stammen von Andrew Fire und Craig Mello.[21, 22] Sie erkannten, dass Gene ganz gezielt durch kurze RNA-Stücke (siRNA) abgeschaltet werden können. Für die Arbeiten zu diesen als Gene-Silencing oder RNA-Interferenz bezeichneten Vorgängen erhielten Fire und Mellow 2006 den Nobelpreis für Medizin.
Aber auch andere Ansätze wie z. B. die Gentherapie, bei der ein defektes Gen durch eine intaktes ausgetauscht wird, bieten ungeahnte Möglichkeiten.
Wir verstehen erstmals, wie bestimmte Prägungen oder Krankheiten auf molekulargenetischer Ebene entstehen oder sich verändern. Zusätzlich haben wir erstmals die Möglichkeit, bestimmte Krankheiten ursächlich zu behandeln bzw. sie gezielt zu verhindern. All diese Erkenntnisse fundieren auf wissenschaftlichen Ergebnissen die durch bioanalytische Verfahren realisiert wurden. Dabei spielt die fluoreszente Bildgebung und Diagnostik eine große Rolle. Neben der intrinsischen Fluoreszenz, wie beispielsweise der des GFP (green fluorescent protein), bieten artifizielle Fluorophore wie z. B. Cyaninfarbstoffe, ein großes Anwendungsspektrum.
Man findet sie in fast allen Bereichen moderner bioanalytischer Methoden, wie der Fluoreszenzmikroskopie, Polymerasekettenreaktion und in DNA- oder Protein- Arrays. Mit der rasanten Entwicklung technischer Möglichkeiten wächst neben den etablierten Fluoreszenzsystemen auch der Bedarf an Neuartigen. In der Grundlagenforschung werden Chromophore benötigt, die ganz spezielle Strukturen wie z. B. DNA Einzelbasenmutationen und G-Quadruplexe detektieren oder Protein- DNA-Interaktionen visualisieren können. In der Zellbiologie werden durch immer
Einleitung
höherer Auflösungen der Mikroskope und dem Einsatz von Lasern Farbstoffe gesucht, die den gestiegenen technischen Anforderungen gerecht werden. Auch für die etablierten Methoden der DNA Analytik sind neuartige Fluorophorsysteme interessant, da sie durch zusätzliche Funktionen, wie z. B. Farbwechsel, das Leistungsspektrum bisheriger Sensoren oder Arrays erweitern können.
Die Bioanalytik bildet die Grundlage für das Verständnis der Prozesse unserer DNA und RNA. Der Weiterentwicklung der bioanalytischen Methoden kommt daher eine große Bedeutung zu. Diese Arbeit soll dazu einen kleinen Beitrag liefern, indem zwei neue fluoreszente DNA-Sonden entwickelt und validiert werden.
Themenstellung
2 Themenstellung
Der Fokus dieser Arbeit liegt auf fluoreszenten DNA-Sonden für die Nukleinsäureanalytik und der Fluoreszenzmikroskopie. Neben anderen Forschungsgruppen entstanden auch in der Gruppe von Wagenknecht in den letzten Jahren vielversprechende Fluoreszenzsonden auf der Basis von Molecular Beacons.[23, 24] Dabei erwiesen sich die beiden Farbstoffe Thiazolorange und Thiazolrot, alleine oder in Kombination, als äußerst erfolgreich. Beides sind Cyaninfarbstoffe, die während der DNA-Synthese in die Oligonukleotide geknüpft wurden. Auch eigene Arbeiten konnten bereits zeigen, dass sogar etablierte Farbstoffe, wie Cy3, ihr Leistungsspektrum erweitern können, wenn sie zusammen mit einem Elektronenakzeptor in DNA eingebaut werden.[25] Auf Grundlage dieser Erkenntnisse sollen weitere Sonden entwickelt werden, die vor allem das Anwendungsspektrum von Fluorophoren erweitern. Für die Entwicklung neuer Fluorophore bzw. fluoreszierender DNA-Sonden lassen sich einige Eigenschaften als grundsätzliche Zielvorgabe formulieren (s. Tabelle 1):
Tabelle 1: Anforderungen an neuartige Fluorophorsysteme.
Eigenschaft Hintergrund
Anregung über λ = 450 nm Geringe Autofluoreszenz und hohe Eindringtiefe in biologische Medien.
Große Stokes Verschiebung Erfassung eines großen Emissionsbereichs und Verringerung von Autofluoreszenz.
Photostabilität Geringes Ausbleichen ermöglicht die zuverlässige Erfassung von Signalen über lange Zeiträume.
Geringe Toxizität Ermöglicht die ungestörte Erfassung längerer Zellprozesse und einen Einsatz der Sonde in vivo.
Helligkeit Abhebung des Signals von Hintergrundfluoreszenz und Grundvoraussetzung der fluoreszenten Bildgebung.
Synthese Geringer Syntheseaufwand zur Kostenreduzierung; einfache Handhabung zur postsynthetischen Modifikation erweitert das Einsatzspektrum; Biokompartibilität
Themenstellung
Teil 1 Entwicklung des Cyaninfarbstoffs CyIQ und funktionelle DNA Sonden:
Im Hauptteil dieser Arbeit soll ein Cyaninfarbstoff (CyIQ, Cyanine Indole Quinoline) so weiterentwickelt und synthetisiert werden, dass er universell und postsynthetisch mit DNA verknüpft werden kann. Dies soll über eine kupferkatalysierte Cycloaddition zwischen einem alkinmodifizierten Nukleosid und dem azidmodifizierten Farbstoff realisiert und validiert werden. In einem zweiten Schritt sollen die grundlegenden photophysikalischen Eigenschaften des Farbstoffs in Verbindung mit DNA untersucht werden. Danach werden unterschiedliche fluoreszente Oligomere aufgebaut, die durch die Kombination mit CyIQ selbst oder Thiazolrot funktionelle Sonden ergeben.
Das Ziel ist es, eine Sonde zu finden, die durch Farbwechsel oder Fluoreszenzlöschung Bindungsvorgänge visualisieren kann. Abschließend soll anhand zweier ganz unterschiedlicher Anwendungsbeispiele das Potential der CyIQ- Sonden nachgewiesen werden. Dafür wird einerseits eine CyIQ-Dimer-Sonde für die Detektion von Basenfehlpaarungen verwendet. Eine andere CyIQ-DNA-Sonde soll die Visualisierung von DNA auf dem Weg in eukaryontische Zellen sowohl im Lichtmikroskop (live cell imaging) als auch im hochauflösenden Elektronenmikroskop ermöglichen.
Teil 2 DNA-modifizierte Upconversion-Nanopartikel
Im zweiten Teil dieser Arbeit soll eine Methode zur Oberflächenfunktionalisierung von Upconversion-Nanopartikeln mit DNA auf Basis der Klick-Reaktion entwickelt und validiert werden. Sogenannte Upconversion-Materialien zeigen intensive Fluoreszenz im sichtbaren Spektralbereich bei Anregung im energiearmen Infrarotbereich. Diese Eigenschaft macht Upconversion-Nanopartikel besonders interessant für die Fluoreszenzmikroskopie, da keinerlei Hintergrundemission auftreten sollte. Diese Eigenschaften sollen vergleichend für unmodifzierte und DNA-modifizierte Upconversion-Nanopartikel untersucht werden. Die DNA verleiht den Nanopartikeln durch ihre Sequenz die Möglichkeit der molekularen Erkennung, was durch DNA gesteuerte Hybridisierung nachgewiesen werden soll. Dieser Teil der Arbeit entstammt einem Kooperationsprojekt mir der Forschungsgruppe von Prof. Wolfbeis am Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik der Universität Regensburg.
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Theoretischer Hintergrund
Cyanine im Grundzustand liegen typischerweise in der all-trans Konformation vor, zeigen aber eine ausgeprägte cis-trans-Photoisomerisierung.[31] Die Rotation um die C-C-Bindung ist bei kurzen Methinbrücken (n = 1) sehr ausgeprägt, was sich in kurzen Lebenszeiten (τf = 15 – 500 ps Monomethincyaninen; τf = 1 – 2 ns Dimethin- cyaninen) des photoangeregten S1-Zustandes und geringen Fluoreszenz- quantenausbeuten zeigt.[32-34] Im Umkehrschluss steigt die Fluoreszenz bei Fixierung der Rotation stark an. Die photophysikalischen Eigenschaften können auch durch die konjugierten Heterocyclen, z. B. durch Einbringen weiterer Heteroatome (S, O oder Se), verändert werden. Je nach Struktur der konjugierten Heterocyclen ergeben sich symmetrische (gleiche Heterocyclen) und unsymmetrische (unterschiedliche Heterocyclen) Cynanine. Typischerweise absorbieren diese Chromophore in einem Wellenlängenbereich von 400 - 1000 nm. Viele davon zeigen auch Fluoreszenz.
Neben der Emission sind Innere Umwandlung (IC, Internal Conversion) und Rotation die effizientesten Deaktivierungsprozesse des photoangeregten Singulett-Zustandes.
Cyaninfarbstoffe sind in vielen organischen Lösungsmitteln und meist auch in Wasser löslich, wobei die Löslichkeit hierfür oft durch Alkylsulfonate verbessert wird.
Trotzdem neigen Cyanine zur Aggregation, was oft mit einer Veränderung ihrer photophysikalischen Eigenschafteten einhergeht (s. Kapitel 3.3). In Verbindung mit DNA zeigen diese Farbstoffe in einigen Fällen Fluoreszenzlöschung zum Beispiel
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a) b)
Abb. 3: a) Die drei Klassen von Cyaninfarbstoffen: Offenkettige Cyaninfarbstoffe (Strepto-Cyanine), Hemi-Cyaninfarbstoffe und geschlossenkettige Cyaninfarbstoffe. b) Typische Heterocyclische Komponenten von Cyaninfarbstoffen. R ist meist eine Alkylgruppe, Alkylsulfongruppe oder die Verknüpfungsstelle bei kovalenten Biomarkern.
Theoretischer Hintergrund
durch Elektronentransfer.[25] Aktuelle Übersichtsartikel von Levitus et al.[31] und Armitage[28] sowie eigene Arbeiten[25] beleuchten das photophysikalische Verhalten von Polymethinfarbstoffen im Allgemeinen und in Verbindung mit DNA genauer.
All diese Eigenschaften machen Cyaninfarbstoffe zu einem wichtigen Arbeitsmittel der Bioanalytik. Bekannte Vertreter wie Cy3, Cy5, SYBR Green, TOTO oder YOYO, gehören mittlerweile zum Standartrepertoire molekularbiologischer Untersuchungsmethoden wie der Fluoreszenzmikroskopie, Gelelektrophorese, Proteinmarkierung (z.B. für Proteinarrays, Antikörperkopplungen) oder der DNA- und RNA Markierung (z.B. DNA Mikroarrays, Chromosomensonden, PCR). Neben den Grundeigenschaften zeigen Cyaninfarbstoffe oft intensive Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung, was in der Bioanalytik gerade dann interessant ist, wenn bestimmte Strukturen oder strukturelle Änderungen der Mikroumgebung detektiert werden sollen.
In dieser Arbeit wird ein Cyaninfarbstoff weiterentwickelt, dessen Grundstruktur als E36 von Yong-Tae Chang veröffentlicht[35, 36] und patentiert[37]
wurde. Ursprünglich wird der Farbstoff als Styrylfarbstoff geführt, was jedoch nicht ganz zutreffend ist, da der Name kennzeichnend für Cyaninfarbstoffe mit Styrol- Einheiten ist und diese in E36 fehlen.[38] Im Rahmen dieser Arbeit wird der weiterentwickelte Farbstoff als CyIQ (Cyanine Indole Quinoline) bezeichnet. Das Grundgerüst E36 ging aus einem Farbstoffscreening hervor, bei dem eine Reihe von kationischen Fluorophoren auf ihre Fähigkeit hin untersucht wurden, in lebenden Zellen spezifisch RNA anzufärben. Dabei ging es hauptsächlich darum, Chromophore zu finden, welche die Zellmembran überwinden und spezifisch an RNA und nicht an DNA binden. Üblicherweise erfolgt dies per Mikroinjektion eines Fluorophors oder über Hybride aus RNA bindenden und fluoreszierenden Peptiden (z. B. GFP), was für die Visualisierung globaler RNA-Prozesse in der Zelle wenig geeignet ist. Ein Hauptziel ist es, RNA im Nukleus und Nukleolus in lebenden Zellen zu verfolgen. In unterschiedlichen Zelllinien konnte gezeigt werden, dass dies unter anderem mit E36 möglich ist. Der Farbstoff zeigt dabei eine geringe Zell- und Phototoxizität. In Titrationsexperimenten konnte gezeigt werden, dass E36 besser an RNA als an DNA bindet, was sich durch einen fast doppelt so hohen Fluoreszenzanstieg bei RNA erklärt. Die optischen Eigenschaften, die in Tabelle 2 zusammengefasst sind, geben Anlass, den Farbstoff weiterzuentwickeln und
Theoretischer Hintergrund
kovalent mit DNA zu verknüpfen. Eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit DNA ist bisher nicht bekannt.
Tabelle 2: Optische Eigenschaften der Grundstruktur (E36) von CyIQ nach Chang et al.[35]
Struktur λexc/λem [nm]
Puffer RNA ΦFPuffer ΦFRNA εPuffer
[M-1cm-1]
εRNA
[M-1cm-1]
457/541 497/548 0,002 0,1 3,94 x 104 4,31 x 104
3.2 Fluoreszenzmarkierung von Oligonukleotiden / DNA Sonden Die natürlichen Nukleoside A, G, C und T zeigen nahezu keine intrinsische Emission (ΦF = 0,5 – 3 x 10-4).[39, 40] Eine direkte Fluoreszenzdetektion ist also nicht möglich, schafft aber gleichzeitig die Möglichkeit, Fluorophore in DNA einzuführen und diese ohne Hintergrundemission zu detektieren. Grundsätzlich können Farbstoffe kovalent mit DNA verbunden werden oder als freier Farbstoff mit der DNA in Wechselwirkung treten. Freie Farbstoffe interkalieren dabei entweder in den Basenstapel (Interkalatoren) oder binden in eine Furche der Doppelhelix (groove binder). Gleiches gilt für RNA. Im Rahmen dieser Arbeit werden Farbstoffe kovalent in Oligomere eingebaut, weshalb sich dieses Kapitel grundsätzlich mit Varianten für den kovalenten Einbau beschäftigt. Dazu stehen vier Möglichkeiten zur Verfügung:[41, 42]
N
NH
E36
Theore
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Theoretischer Hintergrund
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Dies ist der am meisten verbreitete und etablierte Ansatz. Der Fluoreszenzfarbstoff wird über einen Linker am 3´- oder 5´-Ende mit der DNA verknüpft. Die Sonde dient meist lediglich als Marker der DNA. Die typischen Vertreter sind Cy3 und Cy5.
Die kovalente Verknüpfung von DNA mit Farbstoffen bringt einige Vorteile mit sich.
Zum einen lässt sich die Position des Fluorophors in der Sequenz exakt bestimmen, was zu definierten Strukturen führt. Des Weiteren ergibt sich aus der Natur einer festen Verknüpfung die Möglichkeit, die Position von DNA oder RNA z. B. in Zellen zu visualisieren. Kovalent gebundene Fluoreszenzsonden sind damit ein praktikabler Ersatz für radioaktive Marker und Interkalatoren.
Neben dem direkten Einbau von Fluorophoren während der DNA-Synthese gibt es die Möglichkeit der postsynthetischen Modifikation. Dabei wird eine reaktive Gruppe während der DNA-Synthese in das Oligomer eingebracht, an die später ein Fluorophor chemoselektiv gebunden wird. Der Vorteil dieser Methode ist, dass auch Bausteine, die nicht mit der DNA-Festphasenchemie kompatibel sind, verknüpft werden können. Für diesen Ansatz sind mild ablaufende Reaktionen nötig, die spezifisch, bioorthogonal und am Besten in wässrigen Lösungen funktionieren. In den letzten Jahren entstanden einige vielversprechende Ansätze die über Diels-Alder Reaktion, Staudinger-Ligation, Huisgen-Reaktion oder über thiolmodifizierte DNA ablaufen. In einem Übersichtsartikel von Marx et al. werden einige dieser Möglichkeiten genauer beleuchtet.[43] In Abb. 5 sind die wichtigsten Möglichkeiten zur postsynthetischen Funktionalisierung von DNA zusammengefasst.
Theoretischer Hintergrund
Abb. 5: Einige Möglichkeiten zur postsynthetischen Funktionalisierung von DNA.[43-48]
In dieser Arbeit wurde die kupferkatalysierte [2+3]-Cycloaddition zwischen Alkinen und Aziden nach Huisgen,[49, 50] Sharpless,[51] und Meldal[52] umgesetzt. Die Reaktion ist der bekannteste Vertreter der Klick-Reaktionen. Thomas Carell schreibt 2008 in einem Übersichtsartikel: Die Klick Konjugation ist „…auf dem besten Wege, die Synthese funktionalisierter DNA-Stränge zu revolutionieren“.[53] Er fasst damit sehr treffend zusammen wie sich dieser Ansatz in den letzten Jahren entwickelt hat und welches Potential er birgt.[54] Die Methode wurde bereits von einigen Gruppen in unterschiedlicher Weise umgesetzt. Tabelle 3 soll hierüber einen kurzen Überblick verschaffen. Chemische Details zur Reaktion finden sich in Kapitel 4.1.4, die Klick- Konjugation von DNA mit Nanopartikeln wird in den Kapiteln 3.4.3 und 7.1 besprochen. Seit Kurzem sind auch kupferfreie Varianten der Cycloaddition mit DNA
Theoretischer Hintergrund
bekannt. Hierbei werden die Reaktionen über gespannte Cyclooctinderivate[46, 55]
(oder Nitriloxidverbindungen[47, 48, 56] ermöglicht (s. Abb. 5).
Tabelle 3: Übersicht einiger Anwendungsbeispiele der Klick-Konjugation von Aziden mit Alkinen in Bezug auf Nukleinsäuren.
Lit. Anwendung
[57, 58] Klick-Konjugation kleiner, z. T. biogener Moleküle an RNA und siRNA.
[59] Sequenzielle Click-Reaktion von drei unterschiedlichen Molekülen an DNA durch variierende Schutzgruppen.
[60] Fluorogene Klick-Reaktionen (Übersicht).
[61] Fluorophore für die kupferfreie und/oder kupferkatalysierte Klick- Konjugation von Biomolekülen.
[62-64] Klick-Reaktion an octinmodifizierten Uridinen (bis zu sechs
Funktionalisierungen).
[65] Immobilisierung von DNA auf Glasoberfläche via Klick-Reaktion.
[66-69] DNA-Ligation (cross linking) und Cyclisierungen von DNA durch Klick-
Reaktion.
[43, 53, 54, 70] Übersichtsartikel.
Auch die Gruppe von Wagenknecht nutzte die Klick Reaktion bereits, um z. B. IR- emittierende Farbstoffe[71] oder Nilblau[72] an alkinmodifizierte Uridine oder acyclische Basensurrogate zu knüpfen. 2009 verglichen sie zusammen mit Wolfbeis et al.
unterschiedliche Klickbausteine und konnten zeigen, dass 2´-O-Propargyluridin einem acyklischen Alkin vorzuziehen ist, da die DNA-Stabilität durch Basenpaarung des Uracils intakt bleibt.[73]
Die Gruppe von Carell zeigte bereits, in welche Richtung sich die Klick- Konjugation weiterentwickeln könnte. Sie konnten durch Polymerasekettenreaktion unterschiedliche alkin- und azidfunktionalisierten Nukleosidtriphosphate in DNA (300, 900 und 2000 Basen) einbauen und diese postsynthetisch modifizieren.[74, 75] Mit dieser Methode wäre es künftig möglich, nicht nur Oligomere postsynthetisch zu funktionalisieren, sondern große, vielleicht sogar genomische DNA-Sequenzen.
Theore
3.3 E
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Abb. 6:
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etischer Hin
Excitonis
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Theoretis
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Theoretischer Hintergrund
minimiert.[28] Bei den Übergangsdipolmomenten spielt nicht nur der Verschiebungs- winkel α eine wichtige Rolle, sondern auch der Rotationswinkel θ (s.
Abb. 8).
a) b)
Durch die Aufspaltung in unterschiedliche Energiezustände verändern sich auch die Relaxationsprozesse und damit die Fluoreszenz. J-Aggregate zeigen Fluoreszenz mit teilweise höheren Quantenausbeuten als die Monomere. Dieser Effekt ist gut beschreiben und seit langem bekannt.[79] Die Fluoreszenz von H-Aggregaten ist dagegen in den meisten Fällen gelöscht, was ebenfalls seit langem bekannt ist.[79, 89-
92] Nach Kasha[86, 87] und Förster[93] wird der energiereiche Exciton-Zustand der H- Aggregate durch schnelles Internal Conversion in einen energetisch niedrigeren Zustand überführt.[94] Elektronen aus diesem Zustand werden strahlungslos in den Grundzustand transportiert. Die Fluoreszenz wird gelöscht. Bis vor kurzem waren nur seltene Ausnahmen dieser Regel bekannt. Sie wurden bei sehr tiefen Temperaturen[95-99] oder Monolagen[100, 101] aggregierter Moleküle beobachtet.
Wortmann und Würthner beschrieben jedoch 2006 fluoreszente H-Aggregate von Merocyaninen unter Normalbedingungen (25 °C, Dioxan).[89] Den Grund für die theoretisch verbotene Fluoreszenz fanden sie in einer ganz bestimmten Anordnung der Chromophore zueinander (α = 59,9°; θ = 10°). Unter diesen Bedingungen
H-Aggregat J-Aggregat E
hν hν
90 0
α= 54,7
erlaubt
verboten J1
J2 H1
H2
S0 S0
o o o
Abb. 8: Einfluss der räumlichen Anordnung coplanarer Chromophor-Dimere und deren Übergangsdipolmomente auf das Absorptionsverhalten. a) Verschiebungswinkel α (Seitenansicht) und Rotationswinkel θ (Draufsicht); Pfeile repräsentieren die Übergangsdipolmomente. b) Zusammenhang zwischen Verschiebungswinkel und Bildung von H- oder J-Aggregaten (θ = 0°).
Theoretischer Hintergrund
(α > 54,7°; θ ≠ 0° oder 90°) ist ein Übergang auf das niedrigere Exciton-Niveau möglich und damit Fluoreszenz.
Auch in der Gruppe von Wagenknecht wurden fluoreszente H-Aggregate beobachtet.[102] Sie traten bei Dimeren aus Thiazolorange auf, die durch die DNA in einer antiparallelen Orientierung aggregierten. Auch in diesem Fall war diese Art der Orientierung in Verbindung mit einer helikalen Verdrehung der Übergangsdipol- momente entscheidend. Bemerkenswert ist, dass dies der erste Fall fluoreszenter H- Aggregate in DNA ist.
Aus diesem Beispiel wird deutlich, dass bei DNA-gesteuerter Dimer-Bildung die Verknüpfung mit der DNA eine entscheidende Rolle spielt. Zur Steuerung der Aggregate müssen die Linker entsprechende Längen und Verknüpfungen aufweisen.
Bei parallel, sehr eng verknüpften Chromophoren in einer Intrastrang Anordnung ist die Ausbildung von H-Aggregaten sehr wahrscheinlich. Okamoto et al. nutzen diese Art der Verknüpfung für den Aufbau funktioneller DNA Sonden, indem sie ein mit Thiazolorange doppelt modifiziertes Desoxythymidin in Oligomere einbauten.[103-106]
Diese als ECHO-Sonden („Exciton-Controlled Hybridization-Sensitive Fluorescent Oligonucleotides“) bezeichneten Oligomere zeigen im Einzelstrang keine Fluoreszenz, aufgrund gelöschter H-Aggregate. Die Aggregate werden bei Ausbildung eines Doppelstranges aufgelöst und zeigen Monomer-Fluoreszenz.
Dieses Thema spielt in Kapitel 4.5.2 noch eine wichtige Rolle.
Abb. 9: Thiazolorange Dimere nach Berndl und Wagenknecht.[23, 102]
Theoretischer Hintergrund
Abgrenzung zu Excimeren und Exciplexen:
An dieser Stelle muss die Ausbildung von Excimeren als ein weiteres Phänomen von Chromophorwechselwirkungen erwähnt werden, das nicht mit Excitonen verwechselt werden darf. Das Zustandekommen von Excimeren unterscheidet sich dabei grundlegend. Im Vergleich zu excitonisch gekoppelten Aggregaten liegt bei Excimeren nicht von Anfang an ein Aggregat vor, sondern es bildet sich erst, wenn sich einer der beiden Chromophore in einem angeregten Zustand befindet. Man bezeichnet diesen Zustand auch „excited dimer“, woraus sich der Begriff Excimer ableitet.[107-112] Bildet sich ein solches Dimer aus zwei unterschiedlichen Molekülen, so wird das Aggregat als Exciplex bezeichnet, was sich von „excited complex“
ableitet.[107, 113-115] Das Phänomen der Excimer-Bildung ist seit langem bekannt und wurde von Förster und Kaspar ausführlich untersucht.[116] Die Vorgänge lassen sich anhand eines vereinfachten Energieniveaudiagramms erläutern (Abb. 11 b).[117]
Bei Annäherung zweier Chromophore steigt deren repulsive Wechselwirkung und damit die Energie zwischen beiden Molekülen. Kommt es trotzdem zu einer weiteren Annäherung, so bildet sich ab einer bestimmten Distanz r aus dem Dimer ein Excimer. Die treibende Kraft dabei ist eine Absenkung der Energie im Excimer- Zustand. Das Excimer kann als neue energetische Spezies betrachtet werden und zeigt charakteristische Eigenschaften hinsichtlich Reaktivität und photophysikalischer Besonderheiten.[118] Typisch für Excimere ist eine energieärmere und damit rotverschobene Emission. Diese Verschiebung kommt durch Relaxation aus einem
NH O
O N O
O P O
O O
O- NH
O N
NH
NH O
O
N S N
N S N
Abb. 10: Thiazolorange Dimere nach Okamoto et al.[103-106]
Theoretischer Hintergrund
energetisch abgesenkten Niveau[117] des Excimers oder Exciplexes in den Energiezustand repulsiver Monomere. Charakteristisch ist auch, dass dabei jegliche Feinstruktur verschwindet, da im repulsiven Zustand der Monomere keine diskreten Energiezustände vorliegen.[119]
a) b)
Abb. 11: a) Zustandekommen von Excimeren, Exciplexen und excitonischen Wechselwirkungen zwischen zwei Molekülen (M und N = Monomere, D = Dimere). Die gebildeten Dimere sind in ihrer photophysikalischen Natur nicht gleich. b) Energiediagramm der Excimerbildung und darunter das theoretische Emissionsspektrum bei Relaxation in den Grundzustand.
(Wiedergabe mit Genehmigung aus Lit.[120]).
Wie auch bei den excitonischen Wechselwirkungen eignet sich DNA für die Ausbildung von Excimeren als Struktur gebendes Werkzeug. Dazu gibt es eine Vielzahl von Anwendungsbeispielen in denen Excimere aus Anthracen,[121] Pyren[111,
112, 122, 123] oder Perylen[124] aufgebaut wurden. Darunter auch die Gruppe von Wagenknecht, die Perylenbisimid-modifizierte Oligomere zur Detektion von Einzelbasenpolymorphismen verwendeten.[125] Hierbei ist eine sehr effiziente Excimer-Fluoreszenz nur bei den mutierten Basen zu sehen. Bei korrekter Basenpaarung ist keine Excimer Bildung möglich und es liegt zum größten Teil Monomer-Emission vor.
Theore
Bandbr diese S zur Det
Abb. 12: P von Kool e Genehmig American C
Abb. 13: P ein ganze Verantwort H-Aggrega
etischer Hin
reite an op Sonden zu tektion von
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Chemical Socie
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ntergrund
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Copyright ety 2009).
Oligomere von n Sonden unter die Kombinatio stem. (Wiederga
Ein beson Wechselw kleine C kombinier zeichnete denkbare Excimere System.
physikalis Variation Vielzahl genschafte n Färbung
n und Lipa
Kool et al. Durc rschiedlichster on unterschiedl
abe mit Genehm
nders eind wirkungen Chromopho
rte.[126-129]
en DNA-K en Energi e, Exciplex
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drucksvolle stammt v ore hinte
Diese Konstrukte
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von nur vier un lden (λexc = 354 ransfer-Prozess
[126] Copyright A
es Beispie von Eric K reinander als Poly vereinen mechanism
egate und tiple Anz
und die omophore e Sonden m en bereits nd deren E
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3.4 D
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132]).
ossenes (ISO/TS
Theoretischer Hintergrund
27687 vom August 2008). Wenn man bedenkt, dass 1 Nanometer der millionste Teil eines Millimeters ist, so bekommt man eine ungefähre Ahnung, in welcher Größenebene man sich bewegt (s. Abb. 14). Genau das macht Nanopartikel so interessant. Durch ihr Verhältnis zwischen Oberfläche und Größe sind Nanoteilchen sehr reaktionsfähig und zeigen meist komplett andere Eigenschaften als dasselbe Material im makroskopischen Maßstab. Sie können als Aggregate oder als einzelne, monodisperse Partikel vorliegen und dabei die unterschiedlichsten chemischen, physikalischen oder biologischen Funktionen aufweisen. Neben den bereits erwähnten Gold, TiO2 und ZnO Nanopartikeln gibt es eine Reihe weiterer künstlich erzeugter Vertreter: Silber-Nanopartikel, SWNT bzw. MWNTS (Single bzw. Multi- Walled Carbon Nanotubes), Quantenpunkte (CdSe, CdTe), magnetische Nanopartikel (Fe3O4), CdS oder Upconversion Nanopartikel. Neben diesen anorganisch geprägten Nanopartikeln gibt es eine ganze Reihe sog. weicher Nanoteilchen, die oft aus selbstassemblierten bioorganischen oder organischen Bausteinen wie z. B. Lipiden aufgebaut sind.[133, 134] Sie sind vor allem für ihre bessere Biokompatibilität bekannt.
Die Nanotechnologie bietet ein enormes Potential für die moderne Forschung und neuartige Anwendungen. So werden Nanopartikel bereits in der Medizin als Wirkstofftransporter, nichtvirale Vektoren oder als antimikrobielle Oberflächen- beschichtungen eingesetzt.[135-137] Ein besonders spannendes Beispiel auf diesem Gebiet ist die hyperthermische Tumorbehandlung mit magnetischen Nano- partikeln.[138, 139] Dabei werden magnetische Nanopartikel in die Nähe des Tumors injiziert, selektiv aufgenommen und durch ein Magnetfeld induktiv erhitzt. Dadurch werden lokal die Tumorzellen zerstört. Auch in großtechnischen Anlagen zur Gewinnung erneuerbarer Energien, Schadstoffumsetzung oder Wasseraufbereitung spielen Nanoteilchen eine vielversprechende Rolle. Für bioanalytische Anwendungen sind vor allem fluoreszierende Nanomaterialien von Interesse. Die interessantesten Vertreter sind dabei Quantenpunkte und Upconversion-Nanopartikel.
3.4.2
grundle erstma beschr anorga trivalen für UC- gestaffe NaYF4
durch angere Aufwär (PA, Ph
N einen a metasta diesem sequen D Ionen.
Aktivato Energie
Abb. 15:
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egender B ls von A ieben.[141, 1 anischen F
nten Lantha -Prozesse elte Energ Gitter her drei Mec egten Zus
rtskonversi hoton Aval Nach dem angeregten abilen Zus m Zustand nzielle zwe Der ETU-M
Das eine or (Energi ezustand (
: Upconversio sichtbare Fluo
im energ be mit Gen pyright Wiley-VC
ersion Nan
Bedeutung Auzel, Ova
142] Die eff Festkörper anoiden do
: Langlebig giezustände rvor, die m chanismen
standes ion (ETU, lanche).[141 m ESA-Prin
n Zustand stand in ein d resultier ei-Photonen
Mechanism Ion agiert e Akzepto (E2) erreic
on Materialien oreszenz bei giearmen IR.
ehmigung aus CH 2004).
nopartike
Typisc NIR o Welle sichtb von nichtli seque Photo Energ sind. Die asyankin fizientesten rn, die m otiert sind.
ge angere e.[143] Mit mit Er3+ und
beschrie (ESA, E Energy Tr
1, 143-145]
nzip wird überführt.
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dabei als or). Es gib
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ein Elektr Durch ein en Zustand
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Metallen üllen die w nde, ähnlic onders hoh iert sind. D den (s. A State Abs pconversio
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