3 Ergebnisse und Diskussion
3.2 Randomisierung der Aminosäureposition M747 der Klentaq DNA-
3.2.2.6 Titration ausgewählter Varianten der Klentaq M747 Bibliothek im
In den Primerextension-Experimenten unter 3.2.2.4 und 3.2.2.5 konnte gezeigt werden, dass sich die ausgewählten Varianten der Klentaq WT Polymerase in Bezug auf Prozessierung von DNA-Schäden und Prozessivität unterschiedlich verhielten. Da es sich um thermostabile DNA-Polymerasen handelte und diese Anwendung in der PCR finden, sollte im folgenden Experiment untersucht werden, ob die Varianten dort ebenfalls ein unterschiedliches Verhalten zeigten. Die gereinigten Enzyme wurden in verschiedenen Konzentration zur Amplifikation eines relativ kurzen DNA Fragmentes von 120 bp eingesetzt.
Abb. 35: PCR Amplifikation in Abhängigkeit der Polymerasekonzentration.
Polymerasen wurden in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt (100 – 10 nM), um eine DNA von 120 bp zu amplifizieren. Reaktionsbedingungen: 400 nM Primer, 12,5 pM Templat, 100 µM dNTPs, 30 Zyklen.
Bei der Titration der DNA-Polymerasen fällt auf, dass die Varianten mit den Substitutionen Asn, Glu, Asp selbst bei hohen Enzym-Konzentrationen kein PCR-Produkt bilden konnten. Zwischen 50 und 20 nM Enzym hört das Wildtyp-Enzym (Met) und die Gly Varianten auf ein Produkt zu bilden und die Varianten Ala und Gln werden erkennbar schwächer. Bei 10 nM Enzym sind nur noch die Varianten Lys und Arg fähig ein PCR-Produkt zu bilden. Diese Daten stehen in Einklang mit den zuvor erhaltenen Daten für die Prozessivität. Gerade die Fähigkeit DNA zu binden und effektiv zu prozessieren ist von der Identität der Aminosäure an Position 747 abhängig, wie durch diese Experimente gezeigt werden konnte. Durch den Austausch der hydrophoben Wildtyp-Aminosäure Methionin zu den positiv geladenen Aminosäuren Lysin bzw. Arginin konnte eine wesentliche Steigerung in der Prozessivität, als auch im Überlesen von DNA-Schäden erhalten werden. Dass diese Eigenschaften gerade bei Substitution durch negativ geladene Aminosäuren, wie Glutaminsäure und Asparaginsäure, wieder entfallen und sogar unter das Wildtyp-Niveau sinken, zeigt welchen großen Beitrag ladungsvermittelte elektrostatische Interaktionen zum Verhalten von DNA-Polymerasen beitragen.
3.2.3 Diskussion
Die Randomisierung der Aminosäureposition 747 und das anschließende Durchmustern der Bibliothek gaben Aufschluß über die möglichen Aminosäuresubstitionen an dieser Position und deren Auswirkungen. Die Durchmusterung wurde direkt in einem radiometrischen Primerextension-Experiment durchgeführt, bei dem wie bereits unter 3.1.2.4 beschrieben eine Reaktion mit drei bzw. vier Nukleotiden durchgeführt wurde. Dies war aufgrund der geringen Bibliotheksgröße (90 geteste Varianten) schnell durchführbar. Die nötige Bibliotheksgröße wurde nach Ostermeier et al. berechnet, wobei nach Substitution einer Aminosäureposition durch ein degenieriertes Codon (NNK) die Wahrscheinlichkeit, dass alle der 20 möglichen Aminosäuren durch die Codonkombinationen abgedeckt wurden, bei 90 getesten Varianten, bei 96,7% lag.111 Diese Wahrscheinlichkeit wurde als ausreichend anerkannt.
Das Screening der Bibliothek zeigte Polymerasevarianten mit unterschiedlichen Aktivitäten in den Reaktionen mit vier dNTPs auf, wobei in drei verschiedene Klassen unterschieden wurde (vgl. Abb. 30). Dabei fällt auf, dass nur drei Substitutionen einen Aktivitätsverlust bewirken. Die Valin substituierte Variante war kaum in der Lage den Primer zu verlängern, die Aspartat und Glutamat Varianten konnten zwar ein Volllängenprodukt bilden, wiesen jedoch zahlreiche Abbruchbanden auf und fügten kein zusätzliches Nukleotid als 3’ Überhang an, wie es die anders substituierten Varianten zeigten. In den Reaktionen mit nur drei dNTPs zeigten einige Varianten keine Fähigkeit den Primer zu verlängern (Val, Asp, Glu, Asn, Phe, Cys, Leu). Andere konnten den Primer geringfügig (Met, Ser, Trp, Ala), bis auf Volllänge (Gly) oder noch darüber hinaus mit großer Effizienz verlängern (Lys, Arg, Gln). Ein Vergleich mit den Eigenschaften dieser Aminosäuren ließ erkennen, dass kationische Substitutionen wie Lysin oder Arginin die Polymerase Variante befähigten Fehleinbauten und deren Verlängerung durchzuführen, während anionische Substitutionen (Glutamat, Aspartat) diese Eigenschaft verhinderten und sogar zu einem Verlust der natürlichen Funktion führten. Die anderen Aminosäuren ließen sich nur schwer klassifizieren und ein
allgemein gültiges Muster in Bezug auf Größe oder Hydrophobizität war nicht erkennbar.
Von den sequenzierten Varianten wurden neun, neben Wildtyp und M747K, ausgewählt und für weitere Untersuchungen im kleinen Maßstab mit Ni-NTA Sepharose im „batch“ Verfahren gereinigt. Dabei wurde mindestens eine Variante aus jeder Klassifizierung aus Abb. 31 berücksichtigt, mit Ausnahme der Valin substituierten Variante, die bereits einen Aktivitätsverlust bei der Verwendung von vier dNTPs zeigte. Auffällig ist bei den durchgeführten Experimenten, dass stets die Lysin und Arginin substituierten Varianten eine deutliche Veränderung zum WT Enzym zeigten sowie die Aspartat, Glutamat und Asparagin Varianten. Die anderen Varianten zeigten ein dem Wildtyp ähnliches Verhalten. In den Primerextension-Experimenten unter Verwendung geschädigter DNA-Template (Abb. 32) konnten M747K und M747R deutlich stärker die Schäden überlesen, während M747N, M747E und M747D schon vor den Schäden die DNA-Synthese abbrachen. M747E und M747D waren selbst auf ungeschädigtem Templat (F33A) kaum in der Lage ein Volllängenprodukt zu bilden. Dieses Muster zeigt sich auch weiterhin bei der Untersuchung der Prozessivität und der Fähigkeit zur Amplifikation eines DNA Fragmentes in Abhängigkeit zur Polymerase-Konzentration (vgl. Abb. 34, Abb. 35).
Hier zeigten die anionisch substituierten als auch die Asparagin Variante, kein PCR-Produkt sowie einen Verlust der Prozessivität. Die kationisch substituierten Varianten stellten sich bei diesen Experimenten als die effektivsten heraus.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zahlreiche Mutationen an dieser Position zulässig sind, ohne die Wildtyp-Aktivität nennenswert zu beeinflussen. Außer der Valin, Glutamat und Aspartat Variante, zeigten die anders substituierten Enzyme bei den Experimenten mit Lysaten bzw. mit den gereinigten Enzymen kaum Unterschiede auf ungeschädigten Templaten. Dies steht in Einklang mit Untersuchungen von Loeb e al., die fanden, dass zahlreiche Aminosäuresubstitutionen in einem bestimmten Motiv (Motiv A) möglich waren, ohne die Wildtyp-Funktion zu beeinträchtigen.
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Veränderte man jedoch die Bedingungen und führte Situationen herbei, die einen Fehleinbau und dessen Verlängerung oder das Überlesen eines DNA-Schadens beeinhalten, so traten die Unterschiede deutlicher hervor (vgl. Abb. 32).