8 Experimentalteil
8.5 PCR-Amplifikation ausgehend von stark UV-geschädigter DNA
Das Plasmid pASK-IBA37plus::KTQwt (100ng/µl) wurde jeweils in einem Aliquot von 100 µl für verschieden lange Zeiten einer UV-Strahlung bei 254 nm im Stratalinker UV Crosslinker (Stratagene) ausgesetzt. Die Proben wurden dabei auf einem Metallblock, der in einem Eisbad stand, auf Parafilm aufliegend der Strahlung ausgesetzt, um eine evtl. Erhitzen der DNA zu vermeiden. Anschließend wurde eine PCR mit den unterschiedlich lange bestrahlten Plasmiden als Templat unternommen, wobei der KTQ-ORF (ca.1,8 kb) amplifiziert werden sollte. 20 µl Reaktionslösung enthielten: 2,5 fmol Templat (pASK-IBA37plus::KTQwt) welches unterschiedlich lange bestrahlt wurde, 200 nM Primer (Seq-Primer-fw und Seq-Primer-rev), 200 µM dNTPs, 80 nM DNA-Polymerase (KTQ WT bzw. M747K) in 1 x KTQ-Puffer. PCR Programm: 94 °C für 3 min, 30 Zyklen mit: 94 °C für 1 min, 59 °C für 1 min, 72 °C für 4 min, anschließend 72 °C 10 min. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden auf einem 0,8 % Agarosegel in 0,5 x TBE Puffer analysiert.
8.6 Steady state kinetische Messungen
Für die steady state kinetischen Untersuchungen mussten Reaktionsbedingungen gefunden werden, bei denen ein maximaler Umsatz des Primers von 20 % erreicht wurde, um single completed hit Bedingungen zu gewährleisten. Dazu mussten Reaktionszeiten, Polymerase- und dNTP Konzentrationen für jede Reaktion optimiert werden. Alle Reaktionen wurden bei 55 °C durchgeführt und über ein 12 %-iges denaturierendes PAGE aufgetrennt. Die Reaktionslösungen enthielten: 150 nM Primer, 300 nM Templat in 1 x KTQ Puffer sowie dNTP und Polymerase in den unten angegebenen Konzentrationen.
8.6.1 Einbau und Fehleinbauverhalten
Primer / Templat: F20H / F33A
Enzym dNTP c (Pol) c (dNTP) t [min]
KTQ WT A 50 pM 0,15 – 5 µM 4
G 50 pM 0,05 – 2 mM 60
C 50 pM 0,05 – 2 mM 60
T 50 pM 0,05 – 2 mM 120
KTQ M747K A 50 pM 0,15 – 5 µM 20
G 50 pM 0,05 – 2 mM 60
C 50 pM 0,05 – 2 mM 60
T 50 pM 0,05 – 2 mM 120
8.6.2 Match- und Mismatch-Verlängerungsverhalten
Primer / Templat: F21A,G,C,T / F33A
Enzym P / T dN /dX
dNTP c (Pol) c (dNTP) t [min]
KTQ WT dA / dT G 50 pM 0,15 – 5 µM 3
dG / dT G 50 pM 0,005 – 1 mM 15 dC / dT G 50 pM 0,005 – 1 mM 22
dT / dT G 1 nM 0,005 – 1 mM 20
KTQ M747K dA / dT G 50 pM 0,15 – 5 µM 20
dG / dT G 50 pM 0,005 – 1 mM 4
dC / dT G 50 pM 0,005 – 1 mM 4
dT / dT G 100 pM 0,005 – 1 mM 30
8.6.3 Einbau gegenüber der stabilisierten abasischen Stelle
Primer / Templat: F23 / F33X
Enzym dNTP c (Pol) c (dNTP) t [min]
KTQ WT A 200 pM 0,05 – 2 mM 20
KTQ M747K A 200 pM 0,05 – 2 mM 10
KTQ WT G 200 pM 0,05 – 2 mM 60
KTQ M747K G 200 pM 0,05 – 2 mM 30
KTQ WT C 200 pM 0,05 – 2 mM 60
KTQ M747K C 200 pM 0,05 – 2 mM 60
KTQ WT T 200 pM 0,05 – 2 mM 60
KTQ M747K T 200 pM 0,05 – 2 mM 60
8.6.4 Verlängerung nach der stabilisierten abasischen Stelle
Primer / Templat: F24A, F24G / F33X
Enzym P / T dN /dX
dNTP c (Pol) c (dNTP) t [min]
KTQ WT dA / dX T 20 nM 0,02 – 1,2 mM 120
KTQ M747K dA / dX T 5 nM 0,02 – 1,2 mM 40
KTQ WT dG / dX T 10 nM 0,02 – 1,2 mM 120
KTQ M747K dG / dX T 10 nM 0,02 – 1,2 mM 120
8.7 Analyse des Fehlerspektrums
Das Fehlerspektrum wurde wie von Loeb et al. beschrieben durchgeführt. 125 Dazu wurde ein ca. 1,8 kb großes Fragment (KTQ-ORF) vom Plasmid pASK-IBA37plus::KTQwt mit den Klonierungsprimern (KTQfw und P-pASK37-KTQrev) amplifiziert, anschließend mit BsmBI verdaut und in den mit BsaI geschnittenen und dephosphorylierten pASK-IBA37plus Vektor kloniert. 400 µl PCR Reaktionen enthielten: 31,5 fmol Templat (pASK-IBA37plus::KTQwt), 400 nM jeden Primers, 100 µM dNTPs, 80 nM Polymerase in 1 x KTQ Puffer. PCR Program: 30 Zyklen, 94 °C für 1 min, 65 °C für 1 min, 72 °C für 2 min. Die erhaltenen Produkte wurden über 0,8 %-ige Agarosegele gereinigt, nachdem die Konzentration des Produktes über ein Agarosegel durch Vergleich mit einem Größenstandard festgestellt wurde. Anschließend wurde das PCR-Produkt mit BsmBI verdaut und in den pASK-IBA37plus Vektor kloniert. Die ligierten Plasmide werden in E. coli BL21 (DE3) Gold Zellen transformiert und auf Agarplatten mit Carbenicillin ausgestrichen. Von ca.
30 Kolonien werden dann Plasmid Mini-Präparationen hergestellt und zu einem kommerziellen Sequenzieranbieter geschickt. Eine einfache Sequenzierung mit einem
Primer reicht aus. Danach werden ca. 600 nt der erhaltenen Sequenzen mit Ausgangssequenz verglichen.
Die Mutations- und Fehlerrate berechnete sich wie folgt:
a) Amplifikation A: A =
Das Fehlerspektrum in Abschnitt (3.3.2.8) wurde ebenfalls ausgehend von der Amplifikation des KTQ-ORF von pASK-IBA37plus::KTQwt durchgeführt, allerdings wurden Klonierungsprimer mit anderen Schnittstellen verwendet und das erhaltene PCR-Produkt in den Vektor pGDR11 kloniert. Verwendete Primer waren: P-KTQ-SphI und P-KTQ-HindIII. pGDR11 wurde entsprechend mit HindIII und SphI verdaut.
Für das Fehlerspektrum der Polymerasevarianten KTQ DM (KK), DM (KR) und I614K musste ein kürzeres Fragment amplifiziert werden, da die Amplifikation des gesamten KTQ-ORF nicht möglich war. Es wurde ein 456 bp großes Fragment mit den Primern P-KTQ-SphI und P-KTQ-HindIII-420 amplifiziert, in pGDR11 kloniert und 420 bp nach der Sequenzierung der Klone mit der Ausgangssequenz verglichen.
8.8 Herstellung der randomisierten Bibliothek Klentaq M747
Für die Herstellung der Klentaq M747 Bibliothek wurde zunächste ein Primer synthetisiert, der das degenerierte Codon NNK trug (P-KTQdegM747). Mit diesem Primer und dem P-KTQ-HindIII Primer wurde eine PCR auf dem Plasmid pASK-IBA37plus::KTQwt durchgeführt und es wurde ein 290 bp großer Megaprimer erhalten. Dieser diente in einer zweiten Amplifikation mit dem Primer P-KTQ-SphI und dem Templat pASK-IBA37plus::KTQwt zur Generierung des gesamten Klentaq -ORF mit dem degenerierten Codon für Aminosäureposition M747.
PCR zur Generierung des Megaprimers: 300 µl PCR Reaktionslösung enthielten 12 ng Templat (pASK-IBA37plus::KTQwt), 200 nM jeden Primers (P-KTQdegM747 und P-KTQ-HindIII), 200 µM dNTPs, 7,5 Units Pfu DNA-Polymerase (Fermentas) in 1 x Pfu Puffer (Fermentas). Es wurden 20 Zyklen PCR durchlaufen mit: 94 °C für 1 min, 68 °C für 1 min, 72 °C für 1 min. Anschließend wurde das erhaltene PCR-Produkt über ein 1,5 %-iges Agarosegel gereinigt und quantifiziert. Der erhaltene Megaprimer wurde für eine zweite PCR eingesetzt. 1 ml Reaktionslösung enthielt: 4 µg Templat (pASK-IBA37plus::KTQwt), 200 nM jeden Primers (Megaprimer M747 und P-KTQ-SphI), 200 µM dNTPs, 25 Units Pfu DNA-Polymerase (Fermentas) in 1 x Pfu Puffer (Fermentas). Die PCR wurde als hot start PCR durchgeführt. Es wurden 20 Zyklen PCR durchlaufen mit: 94 °C für 1 min, 78 °C für 1 min, 72 °C für 2,5 min.
Anschließend wurde das erhaltene PCR-Produkt über ein 0,8 %-iges Agarosegel gereinigt, quantifiziert und mit HindIII und SphI nach Herstellerangaben verdaut.
Die Ligation erfolgte mit dem Plasmid pDGR11, das zuvor präparativ (5 µg) mit HindIII und SphI verdaut und über ein 0,8 %-iges Agarosegel gereinigt wurde, für 16 h bei 16 °C. Anschließend wurde die Ligation in BL21 (DE3) Gold Zellen transformiert, auf Agarplatten mit Carbenicillin ausgestrichen und einzelnen Kolonien wurden in eine 96-deep well Platte mit LB-Medium überführt.
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