PCR-Amplifikation ausgehend von stark UV-geschädigter

Im folgenden Experiment sollte die Eigenschaft der gefundenen Variante M747K überprüft werden, ausgehend von stark UV-geschädigter DNA ein PCR Amplifikat zu erzielen. Zu diesem Zweck wurde Plasmid DNA (pASK-IBA37plus::KTQwt) mit unterschiedlichen Dosen Licht der Wellenlänge λ = 254 nm in einem UV-crosslinker der Firma Stratagene bestrahlt. Anschließend wurde ein 1,8 kb großes Fragment von der bestrahlten Plasmid DNA amplifiziert (Abb. 24).

Die Plasmid DNA wurde mit einer Konzentration von 100 ng/µl für die Bestrahlung eingesetzt. Nach der erfolgten Bestrahlung mit UV-Licht wurde jeweils ein Aliquot der DNA mit unterschiedlichen Strahlendosen auf ein Agarosegel geladen, um die drastischen Auswirkungen der UV-Strahlung darzustellen (Abb. 24 A). Es war deutlich zu erkennen, wie mit zunehmender Strahlendosis die Plasmid DNA geschädigt wurde und es zu zahlreichen Strangbrüchen kam, bis bei der höchsten Dosis (50 kJ/m²) nur noch ein DNA Schmier im Gel zu erkennen war. Diese hochgeschädigte DNA, die neben den Strangbrüchen weitere zahlreiche Schäden, wie lichtinduzierte Thymindimere, abasische Stellen oder oxidative Schäden aufwies, diente als Templat für eine PCR Reaktion mit den Polymerasen Klentaq WT und der Variante M747K.³¹ Abb. 24 B zeigt das PCR-Produkt für beide DNA-Polymerasen ausgehend von den unterschiedlichen Templaten. Die Wildtyp-Polymerase war in der Lage ein gut erkennbares PCR-Produkt bis zu einer Strahlendosis von 0,2 kJ/m² zu erzielen. Bei der nächst höheren Dosis von 0,5 kJ/m² war nur noch eine sehr schwache Produktbande zu erkennen. Die Variante M747K war hingegen in der Lage selbst bei der höchsten Strahlendosis von 50 kJ/m² noch ein deutliches Amplifikat zu erreichen.

Abb. 24: Amplifikation eines DNA Fragmentes ausgehend von UV-geschädigter DNA.

In A ist ein Agarosegel des mit verschiedenen Dosen bestrahlten Plasmides zu sehen, aufgetragen wurden 250 ng. B zeigt die erhaltenen PCR Produkte (ca. 1,8 kb) bei Amplifikation mit Klentaq WT bzw. mit Variante M747K ausgehend von unterschiedlich stark geschädigter Templat DNA. Die Amplifikation erfolgte unter Verwendung von 2,5 fmol Templat, 200 nM Primern, 200 µM dNTPs, 80 nM Polymerase in 20 µl für 30 Zyklen bei einer Elongationszeit von 4 min. C verdeutlicht das Experiment als Schemazeichnung.

Die Kontrollreaktion, bei der keine DNA als Templat zur PCR Reaktion hinzugegeben wurde, ist für beide Polymerasen negativ.Dieses Experiment ebenso wie die Primerextension-Experimente unter 3.1.2.9 verdeutlichen welche Auswirkungen der Austausch einer einzelnen Aminosäure auf die Eigenschaften eines Enzyms haben kann. Eine DNA Poylmerase, die kaum in der Lage war einen DNA-Schäden zu überlesen bzw. hochgeschädigte DNA zu amplifizieren, konnte durch den Austausch einer hydrophoben zu einer kationischen Aminosäure in ein Enzym überführt werden, das diese Eigenschaften besitzt.

Abb. 25: Elektropherogramm und Sequenz-Alignment.

A Alignment der durch die Variante M747K amplifizierten Sequenz ausgehend von UV-bestrahltem Templat bei einer Dosis von 50 kJ/m² mit der reversen komplementären original Sequenz des KTQ WT ORFs. B Ausschnitt aus dem Elektropherogramm der Sequenzierung.

Die oben beschriebene, stark geschädigte DNA wurde von der Variante M747K auch bei einer Strahlendosis von 50 kJ/m² amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt wurde nach der PCR durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und partiell sequenziert. Das Ergebnis zeigte, dass die Klentaq Mutante fähig war die DNA ohne Fehler zu amplifizieren, obwohl das Templat hochgeschädigt war (vgl. Abb. 24 A). In Abb. 25 B ist ein Ausschnitt des Elektropherogramms dargestellt sowie in A ein Ausschnitt aus dem Alignment der sequenzierten DNA-Probe mit der original Ausgangssequenz.

Das Elektropherogramm zeigte ein gutes Sequenzierergebnis mit starken Signalen und einer scharfen Bandenverteilung, so dass man von einem zuverlässigen Ergebnis ausgehen konnte. Das Alignment zeigte keine Unterschied zwischen der

Ausgangssequenz und dem Amplifikat. Die Variante M747K der K entaq DNA-Polymerase schien demnach keine erhöhte Fehlerneigung in der PCR aufzuweisen, war jedoch in der Lage stark geschädigte DNA fehlerfrei zu amplifizieren.

l

3.1.2.11

Steady state

kinetische Untersuchungen der

Klentaq

WT DNA-Polymerase und der Variante M747K

3.1.2.11.1

l

Einbau- und Fehleinbauverhalten der Polymerasen

Um die unter 3.1.2.8 beobachteten Effekte der unterschiedlichen Selektivität besser beschreiben zu können, wurden „steady state“ kinetische Messungen unter

„single-comp eted-hit“ Bedingungen durchgeführt. ^88,89 Als Sequenzkontext wurden die bisher verwendeten Primer / Templatsequenzen (Farber) mit dem Primer F20H und Templat F33A gewählt. Untersucht wurde der kanonische Einbau von dATP gegenüber dT sowie die drei möglichen Fehleinbauten von dGTP, dCTP und dTTP (Abb. 26).

Abb. 26: verwendete Sequenz für steady s atet Einbaukinetiken.

grün: kanonisches-, rot: nicht-kanonisches Nukleosid-Triphosphat. Tab. 1: Einbau und Fehleinbau von Nukleotiden gegenüber dT.

aRelative Effizienz bezogen auf die Einbaueffizienz (k^cat / K^M) von dATP.

Wie in

Tab. 1 zu erkennen ist, zeigten sich kaum Unterschiede in den relativen Einbaueffizienzen zwischen Klentaq Wildtyp und Variante M747K. Beide zeigten eine Diskriminierung vom kanonischen zum nicht-kanonischen Einbau in der Größenordnung von 10^-4, wobei zu bemerken ist, dass die relative Effizienz des Fehleinbaus von dTTP durch die M747K Variante ca. vierfach über dem für die WT Polymerase gemessenen Fehleinbau lag.

3.1.2.11.2 Verlängerung von kanonisch und nicht-kanonisch eingebauten Nukleotiden

Die unter 3.1.2.11.1 beobachteten geringen Unterschiede sollten in weiteren kinetischen Messungen untersucht werden. Bei Selektivitätsuntersuchungen an DNA-Polymerasen sind zwei Situationen von Interesse; zum einen der Einbau bzw.

Fehleinbau eines Nukleotids, zum anderen das Verhalten bei der Verlängerung der entstandenen Situationen. Zu diesem Zweck wurden Primer synthestisiert, die ein dA, dG, dC oder dT am 3’-Ende trugen und bei der Paarung mit dem Templat ein kanonisches Watson-Crick Basenpaar (dA/dT) ergaben oder drei Fehlpaarungen erzeugten (Abb. 27).

Auch hier konnten ebenso wie bei den unter 3.1.2.11.1 beschriebenen Einbauexperimenten nur geringe Unterschiede festgestellt werden. Die Unterschiede in den relativen Effizienzen der Verlängerung im Vergleich von kanonisch paarenden zu nicht paarenden Primerenden bewegten sich bei beiden Polymerasen in der gleichen Größenordnung von 10^-3 – 10^-4.

Abb. 27: verwendete Sequenzen für steady state Verlängerungsexperimente.

grün: paarendes, rot: nicht paarende 3’-Primerenden.

Enzym P / T

Tab. 2: Verlängerung von paarenden und nicht paarenden 3’-Primerenden.

aRelative Effizienz bezogen auf die Verlängerungseffizienz (k^cat / K^M) von dA / dT. 38 1,1 x 10^-4

Geringe Unterschiede vom Faktor zwei waren bei den relativen Effizienzen der Verlängerung der fehlgepaarten Primer F21C und F21T zu erkennen. Hier zeigte die Variante M747K eine niedrigere Selektivität als der Wildtyp.

Diese Kinetiken zeigten, dass sich die Polymerasen bei der Verwendung ungeschädigter Template nur gering unterschieden.

3.1.2.11.3 Einbauverhalten gegenüber einer stabilisierten abasischen Stelle

Wie unter 3.1.2.9 deutlich gezeigt wurde, stellten die verwendeten DNA-Schäden einen effektiven Block für den Einbau bzw. die Verlängerung eines Primers durch die Klentaq WT Polymerase dar. Die stärkste Blockade bildete dabei die stabilisierte abasische Stelle, weshalb diese als Modell für die kinetischen Studien an einem DNA-Schaden gewählt wurde. Auch hier wurde wieder der Einbau aller vier natürlichen Nukleotide untersucht (Abb. 28).

Abb. 28: Einbau gegenüber der stabilisierten abasischen Stelle.

X: stabilisierte abasische Stelle.

Enzym dNTP k^cat [min^-1]

K^M [µM]

k^cat / K^M [M^-1 min^-1 x 10³]

relative Effizienz^a

KTQ WT A 10,5 ± 0,8 266 ± 63 39,4 1

KTQ M747K A 21,2 ± 1,2 455 ± 65 46,2 1,2

KTQ WT G 2,9 ± 0,2 280 ± 56 10,1 1

KTQ M747K G 10 ± 0,7 890 ± 117 11,3 1,1

KTQ WT C n.d. n.d. n.d. n.d.

KTQ M747K C n.d. n.d. n.d. n.d.

KTQ WT T n.d. n.d. n.d. n.d.

KTQ M747K T 0,7 ± 0,1 350 ± 69 2,1 n.d.

Tab. 3: Einbau gegenüber der stabilisierten abasischen Stelle.

aRelative Effizienz bezogen auf die Einbaueffizienz (k^cat / K^M) von dATP der WT Polymerase. n.d.: nicht detektierbar.

Auffallend war hierbei, dass dATP bzw. dGTP von beiden Polymerasen gegenüber der stabilisierten abasischen Stelle eingebaut wurde, jedoch kein dCTP. Im Falle von dTTP konnte nur ein Einbau durch die Variante M747K gemessen werden, der deutlich unter den Einbaueffizienzen für dATP und dGTP lag. Beide Polymerasen unterschieden sich auch in diesem Experiment kaum und zeigten ähnliche Einbaueffizienzen. Interessant zu bemerken ist, dass die Einbaueffizienz (k^cat/K^M) bei beiden Polymerasen für den Einbau von dATP vierfach über der von dGTP lag. Das bedeutete, dass beim Überlesen der stabilisierten abasischen Stelle bevorzugt ein dATP eingebaut wurde. Eine These, die in Übereinstimmung mit der „A-rule“ stand.^32,138

3.1.2.11.4 Verlängerung von Primern, die gegenüber einer stabilisierten abasischen Stelle enden.

Für diese Experimente wurden Primer synthetisiert, die bei Paarung mit dem Templat F33X mit dA bzw. dG gegenüber der stabilisierten abasischen Stelle enden. Dadurch sollte die Situation der Verlängerung nach erfolgtem Einbau von dATP bzw. dGTP untersucht werden (Abb. 29). Primer, die auf dC bzw. dT enden wurden nicht hergestellt, da diese Einbausituation wie unter 3.1.2.11.3 gezeigt nicht vorkommt bzw.

in nur geringem Maße für dTTP.

Abb. 29: Sequenzen für die Verlängerung nach der stabilisierten abasischen Stelle.

X: stabilisierte abasische Stelle.

Tab. 4: Verlängerung nach Einbau gegenüber der stabilisierten abasischen Stelle.

aRelative Effizienz bezogen auf die Einbaueffizienz (k^cat/K^M) von dTTP der WT Polymerase. X: stabilisierte abasische Stelle, n.d.: nicht detektierbar.

Dieses Experiment machte die Unterschiede zwischen der Klentaq WT Polymerase und der Variante M747K deutlich. Beide Polymerasen konnten ausschließlich den Primer, der mit dA gegenüber der abasischen Stelle endete, verlängern. Der Primer, der auf dG endete wurde von beiden Polymerasen nicht verlängert. Die Variante M747K zeigte gegenüber dem Wildtyp eine siebenfach höhere Effizienz für die Verlängerung des mit

dA endenden Primers, was die Erklärung für die unter 3.1.2.9 beobachteten Effekte war.

3.1.2.12 Analyse des Fehlerspektrums der

Klentaq

WT Polymerase und der Variante M747K

Bei diesem Experiment sollte die Selektivität der beiden Polymerasen während der PCR quantifiziert werden. Hierzu wurde mit beiden Polymerasen eine PCR für eine definierte Anzahl von Zyklen durchgeführt. Anschließend wurde das erhaltene PCR-Produkt kloniert und in E.coli transformiert. Von einzelnen Klonen, die das PCR-Produkt im Plasmid enthielten, wurde die Plasmid DNA isoliert und sequenziert.

Durch Quantifizieren des erhaltenen PCR-Produktes, lässt sich die Fehlerrate errechnen (s.8.7).

Anzahl der einzelnen Substitutionen Anz.

Del.

Tab. 5: Fehlerrate und Fehlerspektrum nach der PCR.

a Anzahl der Mutationen pro 600 sequenzierten Basen pro Klon. ^b Fehlerrate ist gleich Anzahl der Mutationen pro Base pro Replikation. Anz.: Anzahl, Mut.: Mutationen, Del.: Deletionen, Ins.: Insertionen.

Die Fehlerrate sowie das Fehlerspektrum waren für beide Polymerasen ähnlich. Beide wiesen eine für die Taq DNA-Polymerase typische niedrige Fehlerrate im Bereich von 10^-5 auf.^109,110 Die am häufigsten auftretenden Fehler sind Transitionen, wobei keine Neigung für eine der beiden Transitionen zu erkennen ist. Transversionen fanden kaum statt.

3.1.3 Diskussion

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass aus einer relativ kleinen, zufällig randomisierten Bibliothek von DNA-Polymerasen eine Variante gefunden wurde, die im Vergleich zum Wildtyp-Enzym eine verbesserte Fähigkeit zum Überlesen von DNA-Schäden aufzeigte. Nach der Durchmusterung von bereits 736 PCR aktiven Varianten in einem SYBRgreenI basierten Assay wurde eine Enzym-Variante endeckt, die in der Lage war, den Primer in Anwesenheit von nur drei dNTPs bis zur Volllänge des Templates zu verlängern (Abb. 16). Das Screening mit SYBRgreenI bot den Vorteil, sehr schnell durchführbar zu sein und die Ausgangsbibliothek von 736 Varianten auf 53 Varianten einzugrenzen, was einer Größe von nur noch 7% der Bibliothek entsprach. Diese verringerte Anzahl bestand zu einem großen Teil aus „falsch-positiven“ Varianten, die ebenfalls in der Lage waren, ein relativ hohes Fluoreszenzsignal bei einer Primerextension-Reaktion mit nur drei dNTPs in Gegenwart von SYBRgreenI zu erzeugen, obwohl keine Verlängerung des Primers in einem späteren radiometrischen Experiment festgestellt werden konnte (vgl. 3.1.2.4).

Dennoch enthielt sie eine Variante, die sich im radioaktiven Experiment als „echt-positiv“ erwies. Das Verringern der Bibliotheksgröße durch schnelle, leicht durchzuführende und kostengünstige Screening-Assays stellt eine wichtige Vorraussetzung für ein schnelles Durchmustern von Bibliotheken dar, auch wenn dabei „falsch-positive“ Signale erzeugt werden. Diese werden bei einem zweiten Screening der verringerten Bibliothek dann aussortiert. Die Anwendung von SYBRgreenI als Detektionsgrundlage für die Durchmusterung von randomisierten DNA-Polymerasebibliotheken führte bereits zur Evolution bzw. Verbesserung verschiedener Eigenschaften in DNA-Polymerasen (Selektivität, reverse Transkriptase-Aktivität) und stellte eine gut beherrschte Methode in der Arbeitsgruppe dar.95,96,98,102

Die verringerten Bibliotheken konnten anschließend mit zeit- und kostenintensiveren Methoden genauer untersucht werden (z.B.: radiometrische Untersuchung).

Die Auswertung der erhaltenen Daten aus dem fluoreszenzbasierten Screening (vgl.

3.1.2.3) musste dabei in Abschnitten erfolgen, die den Expressionsplatten entsprachen,

da der unter 3.1.2.3 eingeführte Fluoreszenz-Schwellenwert F^S deutlich zwischen den einzelnen Expressionseinheiten schwankte. So hätte eine Auswertung im 384-well Format zum Verlust von positiven Varianten führen können, wie aus Abb. 15 ersichtlich wird. Alle als positiv identifizierten Varianten der 96-well Platte Nr.1 wären bei der Auswertung nach dem 384-well Format Nr.1 als negativ gewertet worden, da ihr Signal unter dem F^S der 384-well Platte lag. Darunter hätte sich auch die hier entdeckte und charakterisierte Variante 1, E6 (entspricht KTQ M747K) befunden.

Nach der DNA-Sequenzierung der positiven Variante 1,E6 konnte der für die neue Eigenschaft verantwortliche Aminosäurerest identifiziert werden. Es handelte sich um die Position 747, bei der ein Methionin durch ein Lysin substituiert wurde (vgl. Abb.

17). Die Nummerierung orientierte sich am Volllängenenzym der Taq DNA-Polymerase. Die Wildtyp Aminosäure M747 befindet sich in direkter räumlicher Nähe zur Templat-DNA und steht in Kontakt mit der 2’-Desoxyribose des zuletzt gebildeten Basenpaares im Templat (vgl. Abb. 18). Der Abstand des Cβ-Atoms des Methionins zum Zucker weist dabei einen Abstand von 4,5 Å auf.⁸⁴ Interessanterweise haben Jestin et a . die gleiche Aminosäuresubstitution in Kombination mit einer weiteren Substitution gefunden (E742K, M747K) und ein Enzym beschrieben, das ebenfalls ein erweitertes Substratspektrum besitzt und RNA anstelle von DNA als Templat benutzen kann.

l

i i

139 Die Substitution von Methionin hin zu Lysin bedeutete den Austausch einer ungeladenen, hydrophoben Aminosäure hin zu einer basischen, geladenen Aminosäure von ähnlicher Größe (vgl. Abb. 19). Dabei war gut vorstellbar, dass gerade die positive Ladung in direkter Nähe zum negativ geladenen Rückgrat der DNA eine erhöhte elektrostatische Wechselwirkung bedingte und dies einen erheblichen Anteil der veränderten Eigenschaften der Variante M747K ausmachte. Sterische Veränderungen sind aufgrund der ähnlichen Größe und Gestalt der Aminosäuren kaum zu vermuten.

Strukturbiologische Untersuchungen dieses Verhaltes werden zurzeit in einer Kooperation mit der AG Welte, Lehrstuhl für Biophys k und Strukturb ologie, Universität Konstanz, unternommen, wobei die Variante M747K als ternärer Komplex zusammen mit DNA und Nukleosid-Triphosphat kristallisiert wird. Dass die Substitution einer hydrophoben mit einer geladenen Aminosäure Einflüsse auf die

Akzeptanz von DNA-Schäden, Genauigkeit und Selektivität haben kann, zeigten Loeb et al..¹²⁵ Sie fanden in der Taq DNA-Polymerase eine Substitution des Isoleucin 614 hin zu Lysin, welche in einer starken Erhöhung der Fehlerrate und einem verbesserten Schaden-Bypass der I614K Variante resultierte. Isoleucin 614 befindet sich im aktiven Zentrum und bildet mit weiteren Aminosäuren des Motiv A die Bindungstasche für das eintretende Nukleosid-Triphosphat, wobei Isoleucin 614 eng in Kontakt mit der Ribose sowie den Sauerstoffen des β-Phosphats des eintretenden Triphosphates steht.^84,125 Auch hier kann wieder eine erhöhte elektrostatische Interaktion zwischen DNA und substituierter Aminosäure angenommen werden, da das Triphosphat negativ und die Substitution positiv geladen sind.

Die Daten der steady state kinetischen Untersuchungen zeigten, dass die Variante M747K im Vergleich zum Wildtyp eine leicht verringerte Selektivität im Fehlverlängerungsverhalten aufwies. So lagen die relativen Effizienzen für die Verlängerung eines fehlgepaarten Primers mit (dC/dT) und (dT/dT) etwa doppelt so hoch wie beim Wildtyp. Sonstige Unterschiede konnten bei der Verwendung ungeschädigter DNA-Template nicht festgestellt werden. Deutlicher waren jedoch die Unterschiede bei Verwendung eines Templates mit stabilisierter abasischer Stelle. Hier wurde von beiden Polymerasen am effizientesten dATP gegenüber der stabilisierten abasischen Stelle eingebaut, gefolgt von dGTP, welches ca. vierfach weniger effizient umgesetzt wurde. Für die anderen beiden Triphosphate (dCTP, dTTP) konnte kein bzw. nur ein sehr geringer Umsatz gemessen werden, so dass davon ausgegangen werden kann, dass sich dATP bzw. dGTP gegenüber einer abasischen Stelle befand (vgl. 3.1.2.11). Verwendete man nun Primer, die gegenüber der abasischen Stelle mit dA bzw. dG endeten und maß deren Verlängerung, so wurde der Unterschied zwischen Klentaq WT und Variante M747K deutlich. Beide Enzyme konnten nur den Primer, der mit dA gegenüber der abasischen Stelle endete, verlängern, wobei die Variante M747K eine siebenfach erhöhte Effizienz aufwies. Gerade die Verlängerung nach Einbau gegenüber der stabilisierten abasischen Stelle zeigte den Unterschied zwischen den beiden Enzymen.

Im Gegensatz zu der von Loeb e al. identifizierten Variante (Taq I614K) zeigte die KTQ M747K keine erhöhte Fehlerrate im Vergleich zum Wildtyp in einem

PCR-t

basierten Experiment. Loeb et al. fanden eine Erhöhung der Fehlerrate durch Substitution des Isoleucin mit Lysin von 3,3 x 10^-5 auf 80 x 10^-5.¹²⁵ Die hier gemessenen Fehlerraten für Klentaq WT und M747K betrugen 8,8 x 10^-5 bzw. 11,5 x 10^-5 und waren somit fast identisch, wobei die für die Taq Polymerase typische erhöhte Anzahl von Transitionen gegenüber Transversionen auftraten.^109,110

Interessant sind die Ergebnisse, die in den PCR-Experimenten unter Verwendung UV-Licht geschädigter DNA-Template erhalten wurden. UV-Licht erzeugt zahlreiche Schäden in der DNA wie Thymidin-Dimere, große Addukte oder DNA-Strangbrüche.^27,29-31 Diese Schäden stellen enorme Blockaden für replikative DNA-Polymerasen dar und erst in den letzten Jahren wurden DNA-DNA-Polymerasen entdeckt, die für die Schaden-Bypass-Synthese (trans lesion synthesis, TLS) verantwortlich sind.

Die meisten dieser neu entdeckten TLS-Polymerasen werden in der Y-Familie zusammengefasst.11,21,24,134,140,141 Die hier erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die gefundene Variante M747K in der Lage war, ein PCR-Produkt ausgehend von hochgeschädigter Templat-DNA zu erzeugen, welches der ungeschädigten Ausgangssequenz zu 100 % entsprach. Der Grad der Schädigung wurde durch ein Agarosegel deutlich gemacht, auf welches DNA-Proben aufgetragen wurden, die zuvor mit unterschiedlichen Dosen UV-Licht (λ = 254 nm) bestrahlt wurden. Es war deutlich zu erkennen, dass die Erhöhung der Strahlendosis zu vermehrten Strangbrüchen führte (vgl. Abb. 24). Die hier gefundene thermostabile DNA-Polymerase könnte ein wertvolles Werkzeug bei der Analyse von DNA-Proben sein, die extremen Umwelteinflüssen ausgesetzt war, wie z.B. DNA aus archäologischen oder forensischen Proben, deren Amplifikation oft ein Problem darstellt.^142,143 Erst kürzlich wurde ein solcher Versuch unternommen und eine Chimäre aus drei verschiedenen DNA-Polymerasen (Taq, Tfl und Tth) durch molecular breeding gewonnen, die ebenfalls hochgeschädigte DNA amplifizieren kann.¹⁴⁴

3.2 Randomisierung der Aminosäureposition M747 der Klentaq DNA-Polymerase

3.2.1 Einleitung

Im Abschnitt 3.1 dieser Arbeit wurde die Bedeutung der Aminosäureposition M747 der Klentaq DNA-Polymerase für die Eigenschaft des Überlesens von DNA-Schäden untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Wechsel von einer hydrophoben (Met) hin zu einer kationisch geladenen (Lys) Aminosäure an der Position 747 einen starken Einfluss auf das Verhalten der DNA-Polymerase ausübte. Dabei muss auf die räumliche Situation dieser Aminosäure hingewiesen werden, die sich in direkter Nähe zum Templatstrang auf Höhe des zuletzt gebildeten Basenpaares befindet. Gerade diese Nähe als auch das sehr stark negativ geladene Phosphodiester-Rückgrat der DNA und eine dadurch erhöhte elektrostatische Wechselwirkung lassen den starken Einfluss dieses Aminosäureaustausches auf das Verhalten der DNA-Polymerase erklären.

Durch Randomisierung der Aminosäuresequenz an der Position 747 sollte untersucht werden, ob die Eigenschaft der Klentaq DNA-Polymerase, einen DNA-Schaden zu überlesen, durch andere Aminosäuren noch verstärkt werden konnte oder ob Lysin bereits den stärksten Effekt zeigt. Des Weiteren sollte eine Randomisierung helfen ein Muster zu erkennen, ob Ladung oder Größe einer Aminosäure an dieser Position eine besondere Rolle spielen. Teile der gezeigten Ergebnisse dieses Abschnittes waren Gegenstand einer betreuten Abschlussarbeit des Bachelor-Studienganges Life Science an der Universität Konstanz und wurden von B. Sc. Nina Blatter durchgeführt.

3.2.2 Ergebnisse

3.2.2.1 Herstellung der randomisierten Bibliothek

Klentaq

M747

Mithilfe der Megaprimer Methode wurde eine an Position 747 randomisierte Bibliothek der Klentaq DNA-Polymerase hergestellt. Dazu wurde zunächst ein Primer (P-KTQdegM747) synthetisiert, der das degeneriertes Codon NNK trägt, wodurch zwei der drei möglichen Stopcodons bereits ausgeschlossen sind. Mit diesem Primer und einem reverse-Primer wurde ein 290 bp großes Fragment (Megaprimer) amplifiziert, das nun das randomisierte Codon trug, als auch eine HindIII Schnittstelle. Nach erfolgter Agarosegelreinigung wurde der Megaprimer zusammen mit dem

Mithilfe der Megaprimer Methode wurde eine an Position 747 randomisierte Bibliothek der Klentaq DNA-Polymerase hergestellt. Dazu wurde zunächst ein Primer (P-KTQdegM747) synthetisiert, der das degeneriertes Codon NNK trägt, wodurch zwei der drei möglichen Stopcodons bereits ausgeschlossen sind. Mit diesem Primer und einem reverse-Primer wurde ein 290 bp großes Fragment (Megaprimer) amplifiziert, das nun das randomisierte Codon trug, als auch eine HindIII Schnittstelle. Nach erfolgter Agarosegelreinigung wurde der Megaprimer zusammen mit dem

Im Dokument Gerichtete Evolution und Charakterisierung einer thermostabilen DNA-Polymerase mit erhöhter Akzeptanz für geschädigte DNA (Seite 58-0)