Proteinbiochemische Methoden

6.4.1 Expression im 96-well Format

Zur Expression der Bibliothek aus Klentaq DNA-Polymerasen Varianten wurden 1 mL-Kulturen in 96-deep well Platten angesetzt. Hierzu wurden die in 384-deepwell Platten gelagerten Glycerinkulturen der Bibliothek aufgetaut, 5 µL davon mit Hilfe eines Pipettierroboters in 1 mL LB-Medium mit Carbenicillin überimpft. Die 96-deep well Platten wurden mit einer gaspermeablen Klebefolie abgedeckt und über Nacht bei 37 °C und 1000 rpm im Plattenschüttler inkubiert.

Am nächsten Morgen erfolgte die Induktion durch Zugabe von Anhydrotetracyclin zu einer Endkonzentration von 200 µg/l. Nach einer Stunde wurden die Zellen durch

Methoden

10 minütiges Zentrifugieren bei 4400 rpm und 4 °C geerntet. Der Überstand wurde aus den Platten ausgegossen und verbleibende Flüssigkeit ausgeklopft.

Die Pellets wurden mit 0,5 ml Lysepuffer pro Well versetzt, die Platten mit selbstklebender Alufolie verschlossen und die Zellen durch kräftiges Schütteln resuspendiert. Nach 10 min Lyse im 37 °C Wasserbad wurde die Lösung in den 96-Well-Platten durch 6 x 10 s Vortexen gemischt und zur Denaturierung nicht-thermostabiler Proteine für 45 min in ein 75 °C heißes Wasserbad gestellt.

Anschließend konnten durch 45 min Zentrifugation bei 4400 rpm die Überstände gewonnen werden, welche die thermostabilen Klentaq DNA-Polymerase Varianten enthielten.

Diese Lysate konnten direkt für die Screening-Reaktionen eingesetzt werden und behielten bei Lagerung bei 4 °C für ca. drei Wochen ihre Aktivität.

6.4.2 Expression und Lysatherstellung im präparativen Maßstab

Für die Expression im präparativen Maßstab wurde eine Hauptkultur von 1 L LB-Medium morgens wie unter 6.3.2 beschrieben angeimpft. Bei einer OD⁶⁰⁰ von 0,8-1,0 wurde je nach verwendetem Plasmid mit Anhydrotetracyclin (AHT, 200µg/L finale Konzentration) oder IPTG (1mM finale Konzentration) für 60-90 min bei 37 °C induziert. Die Zellen wurden bei 4400 rpm für 10 min bei 4 °C geerntet. Das Zellpellet wurde in eiskaltem Lysepuffer (100 ml Lysepuffer pro 1 L Hauptkultur) resuspendiert und anschließend für 10 min bei 37 °C schwenkend im Wasserbad lysiert. Nach der Lyse erfolgte die Denaturierung der E. coli eigenen Proteine im Wasserbad bei 75 °C für 45 min. In regelmäßigen Abständen wurde das Lysat bewegt und nach der Hitzedenaturierung in Eis abgekühlt. Das Lysat wurde in SS-34 Zentrifugenröhrchen überführt und in einem SS-34 Rotor (Sorvall) bei 22000 x g für 30 min abzentrifugiert.

Der Überstand wurde nun zur Reinigung der Polymerase mit einer Ni-NTA Matrix inkubiert (siehe 6.4.3).

Methoden

6.4.3 Isolierung der Polymerasen

Die Reinigung der Klentaq DNA-Polymerasen aus dem Lysat erfolgte im Batch-Verfahren mittels einer Ni-NTA-Sepharose-Matrix (Amersham Biosciences) nach dem Protokoll von Qiagen unter nativen Bedingungen.¹⁷⁰ Alle im Folgenden beschriebenen Wasch- und Inkubationsschritte erfolgten bei 4 °C im Überkopfschüttler, zentrifugiert wurde jeweils für 5 min bei 700 g. Für die Reinigung der Polymerase wurden 4 ml 50 %ige Ni-NTA-Matrix pro 100 ml Lysat eingesetzt.

Zuerst wurde die Matrix, die als Suspension in 20 %igem Ethanol vorlag, drei Mal mit vier Volumen Lysepuffer ohne Lysozym gewaschen. Hierzu wurde sie jeweils für 10 min im Überkopfschüttler inkubiert und anschließend abzentrifugiert. Zum Binden des mit einem N-terminalen Histidin-Anhangs (6 x His-tag) exprimierten Proteins an die Ni-NTA-Matrix wurde das entsprechend Kapitel 6.4.2 gewonnene Lysat zur Matrix gegeben und 1 h im Überkopfschüttler inkubiert (2 x 50 ml Falcon-Röhrchen). Nach dem Abzentrifugieren wurde der Überstand verworfen und die mit Protein beladene Matrix zweimal 15 min mit 1 ml Waschpuffer pro 1 ml Lysat gereinigt. Dieser enthielt 5 mM Imidazol, um unspezifisch gebundene Proteine aus dem Ni-NTA Komplex zu verdrängen. Anschließend erfolgte die Elution mit Elutionspuffer, welcher 200 mM Imidazol enthielt. Dazu wurde die Ni-NTA Matrix in einem 15 ml Falcon Röhrchen vereinigt und mit 3 ml Elutionspuffer versehen. Eluiert wurde drei Mal, über Kopf schüttelnd bei 4 °C. Anschließend wurden die Überstande vereinigt.

Zum Entfernen des Imidazols wurde das Eluat durch Ultrafiltration (Vivaspin-Zentrifugalkonzentrator, Sartorius Vivascience; 30 kDa Größenausschluss) eingeengt und der Elutionspuffer durch 2 x KTQ Puffer ersetzt. Dazu wurde das Eluat (ca. 12 ml) auf 200-500 µl eingeengt und auf 20 ml mit 2 x KTQ Puffer aufgefüllt. Dieser Vorgang wurde drei Mal wiederholt. Es wurde ein Endvolumen von ca. 10 ml erhalten, welches dann mit dem gleichen Volumen 100 % Glycerin aufgefüllt wurde. Die Lagerung erfolgte bei -20 °C.

Methoden

6.4.4 Glycin-SDS-PAGE Gelelektrophorese

Die Trennung von Proteinen erfolgte in denaturierenden SDS-PAGE-Gelen nach LÄMMLI.¹⁷¹ Diese setzen sich aus einem Sammel- und einem Trenngel zusammen. Das Sammelgel dient zur Fokussierung der Proteine, während diese im Trenngel nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden.

Zur Fertigung eines Gels (7,5 x 6 cm) wurde zuerst das Trenngel aus den entsprechenden Vorratslösungen hergestellt, mit APS und TEMED versetzt und die Lösung zwischen zwei abgedichtete Glasplatten (Abstand 0,75 mm) pipettiert. Um eine waagerechte, glatte Geloberkante zu erreichen und um Luftblasen zu vermeiden, wurde mit Isopropanol überschichtet. Nach der Polymerisation (ca. 30 min) wurde der Alkohol abgegossen, das Sammelgel auf das Trenngel gegossen und der Kamm eingesetzt. Das fertige Gel wurde in eine Elektrophorese-Apparatur eingesetzt und mit SDS-Laufpuffer befüllt. Die Proben wurden mit LÄMMLI-Puffer versetzt, 5 min bei 95 °C denaturiert und maximal 8 µL auf das Gel aufgetragen. Als Molekulargewichtsmarker diente die PageRuler™ Unstained Protein Ladder (Fermentas). Die Auftrennung erfolgte bei 35 mA für ca. 45 min.

6.4.5 Coomassie-Färbung von SDS-PAGE Gelen

Zum Einfärben wurden die Gele mind. 3 h, besser über Nacht, in kolloidaler Coomassie-Färbelösung geschwenkt und anschließend für 20 min in Entfärber-Lösung wieder soweit entfärbt, bis ein ausreichender Kontrast zwischen Banden und Hintergrund erreicht war. Die Gele wurden schließlich in einem Geldokumentationsgerät aufgenommen.

6.4.6 Konzentrationsbestimmung von Proteinen nach Bradford

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte im Bradford-Assay. Hierzu wurde das Bradford-Reagenz (Fa. Roth) 1:5 mit Wasser verdünnt und durch einen Faltenfilter

Methoden

filtriert. Zunächst wurde eine Standardreihe mit BSA (Rinderserumalbumin) zwischen 0,1 mg/ml – 1,0 mg/ml hergestellt und die Absorption bei 595 nm aufgenommen.

Dafür wurden 20 µl des Standards mit 1 ml verdünnter Bradford-Reagenz versehen und für 5 min bei RT inkubiert. Die erhaltenen Messwerte wurden gegen die Konzentration aufgetragen und es wurde eine Eichgerade durch die Messwerte gelegt.

Anhand der Steigung konnte nun die Konzentration unbekannter Proteinlösungen bestimmt werden, wozu wiederrum 20 µl Probe mit 1 ml Bradford-Reagenz versehen wurde.