Untersuchung der Bypass-Synthese und der Wirkung sterischer Zwänge auf Funktionalität und Selektivität
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Dipl.-Biol. Sonja Gieseking
an der
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie
September 2011
Dissertation der Universität Konstanz
Prüfungsvorsitzender: Prof. Dr. Jörg Hartig 1. Referent: Prof. Dr. Andreas Marx 2. Referent: Prof. Dr. Thomas Mayer
Tag der mündlichen Prüfung: 25. November 2011
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht in:
Gieseking, S., K. Bergen, F. Di Pasquale, K. Diederichs, W. Welte, and A. Marx, Human DNA Polymerase ß Mutations Allowing Efficient Abasic Site Bypass. J Biol Chem, 2011. 286 (5):
4011-4020.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
1.1 Struktur und Aufbau der DNA... 1
1.2 Schädigung der DNA... 2
1.3 Reparaturmechanismen ... 3
1.4 Bypass eines DNA-Schadens... 5
1.5 DNA-Polymerasen ... 5
1.5.1 Polymerase beta und ihre Funktion... 6
1.5.2 Kinetik des Reaktionsmechanismus der humanen DNA-Polymerase beta ... 8
1.5.3 Aufbau und Struktur der Polymerase beta... 9
1.5.4 Selektivität und Genauigkeit der DNA-Polymerase beta ...11
1.6 Gerichtete Evolution an DNA-Polymerasen ...11
1.7 Ziele dieser Arbeit...13
2. Ergebnisse und Diskussion des Screenings einer Polß-Mutanten Bibliothek ... 14
2.1 Identifizierung von Polß-Mutanten mit erhöhter Bypass-Aktivität einer abasischen Stelle durch Screening einer Bibliothek...16
2.1.1 Konstruktion der Polß-Mutanten-Bibliothek...16
2.1.2 Übersicht über das Screeningsystem ...16
2.1.3 Ergebnisse des Screenings der Bibliothek...18
2.2 Radiometrische Untersuchungen der Lysate der selektierten Mutanten...19
2.2.1 Überprüfung der Aktivität und der Bypass-Eigenschaften über eine stabile abasische Stelle ...20
2.2.2 Überprüfung der Bypass-Eigenschaften über ein 8-Oxo-desoxyguanosin...21
2.2.3 Sequenzierung der acht selektierten Mutanten...22
2.3 Aufreinigung und weitere radiometrische Überprüfung der selektierten Mutanten...23
2.4 Ergebnisübersicht des Screenings der Mutanten-Bibliothek und der Identifizierung einer Hit-Mutante ...26
2.5 Diskussion der Ergebnisse aus dem Screening der Mutanten-Bibliothek der Polß ...28
2.6 Charakterisierung der Mutante 1L19 ...29
2.6.1 Überprüfung der Sequenzen und erneute Aufreinigung ...29
2.6.2 Analyse der Sequenz ...30
2.6.3 Untersuchung der Bypass-Eigenschaften der Mutante 1L19 im Vergleich zu Polßwt und 5P20 ...31
2.6.4 Bestimmung der spezifischen Aktivität ...34
2.6.5 Bindungsaffinität zur DNA ...35
2.6.6 Kinetische Untersuchungen ...37
2.6.7 Untersuchung der Einzel-, Doppel- und Dreifachmutanten...41
2.7 Diskussion der Ergebnisse aus der Charakterisierung der Mutante 1L19 ...43
3. Ergebnisse und Diskussion der Untersuchung der Polß F272-
Mutantenbibliothek... 51
3.1 Identifizierung von Polß-Mutanten mit der Fähigkeit zum Einbau modifizierter Nukleotide ...56
3.1.1 Generierung der F272-Mutanten ...56
3.1.2 Prozessierung modifizierter TTPs durch 18 F272-Mutanten und Polßwt ...58
3.2 Überprüfung der sieben selektierten F272-Mutanten ...59
3.2.1 Sequenzüberprüfung, Aufreinigung mittels Ni-NTA Affinitätschromato- graphie und Aktivitätskontrolle der selektierten Mutanten ...59
3.2.2 Prozessierung modifizierter TTPs durch die erneut aufgereinigten sieben F272-Mutanten im Vergleich zu Polßwt...60
3.3 Untersuchung der identifizierten Mutanten F272G und F272M ...62
3.3.1 Zeitreihe zur Prozessierung unmodifizierter und modifizierter TTPs durch F272G und F272M im Vergleich zu F272A und Polßwt...63
3.3.2 Genauigkeit beim kanonischen und nicht-kanonischen Einbau von THMP durch F272G, F272M und Polßwt ...65
3.3.3 Einbau modifizierter TMPs durch Polßwt, F272G und F272M unter Ver- wendung von „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexen...66
3.3.4 Überprüfung der Genauigkeit von Polßwt, F272G und F272M unter Ver- wendung von „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexen...68
3.3.5 Kinetische Untersuchungen des Einzeleinbaus bzw. Gap-Fillings modifi- zierter und unmodifizierter TMPs gegenüber A durch F272G, F272M und Polßwt ...69
3.3.6 Kinetische Untersuchungen der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt unter Verwendung der offenen und „single-gapped“ Primer- Templat-Komplexe ...75
3.4 Diskussion der Untersuchung der Mutanten F272G und F272M...81
4. Zusammenfassung und Ausblick ... 90
5. Methoden... 95
5.1 Molekularbiologische Methoden ...95
5.1.1 Gelelektrophoretische Auftrennung der DNA...95
5.1.2 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen...95
5.1.3 Polyacrylamidgelelektrophorese ...95
5.1.4 Isolierung von DNA aus Polyacrylamidgelen...97
5.1.5 Ethanolpräzipitation ...97
5.1.6 Entfernung von Proteinverunreinigungen ...97
5.1.7 Quantitative Nukleinsäure-Bestimmung ...97
5.2 Enzymatische Reaktionen ...98
5.2.1 Ungerichtete Mutagenese durch fehleranfällige PCR („error-prone“ PCR) ...98
5.2.2 Sättigungsmutagenese eines Aminosäurecodons...99
5.2.3 Ortsgerichtete Mutagenese ... 100
5.2.4 Kolonie Polymerase-Ketten-Reaktion (Kolonie-PCR)... 101
5.2.5 Restriktionsverdau doppelsträngiger DNA ... 102
5.2.6 Dephosphorylierung... 102
5.2.7 Ligation doppelsträngiger DNA... 103
5.2.8 DNA-Sequenzierung ... 103
5.2.9 5´-Phosphorylierung mit 32P ... 103
5.3 Bakterienkulturen... 104
5.3.1 Plattenkulturen... 104
5.3.2 Flüssigkulturen ... 104
5.3.3 Glycerinkulturen... 104
5.3.4 Herstellung komopetenter E. coli-Zellen ... 104
5.3.4.1 Herstellung chemischkompetenter E. coli-Zellen ... 104
5.3.4.2 Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen ... 105
5.3.5 Transformation ... 105
5.3.5.1 Transformation in E. coli mittels Hitzeschock ... 105
5.3.5.2 Transformation in E. coli mittels Elektroporation ... 106
5.3.6 Plasmidisolierung ... 106
5.4 Expression und Reinigung von Polß ... 106
5.4.1 Expression ... 106
5.4.1.1 Expression in Plattenkultur... 106
5.4.1.2 Expression in Flüssigkultur ... 107
5.4.2 Lyse von Plattenexpressionskulturen ... 107
5.4.3 Proteinreinigung aus Flüssigkulturen... 108
5.4.3.1 Verwendung von mit Nickel-Ionen beladene Chelating SepharoseTM Fast Flow Matrix ... 108
5.4.3.2 Verwendung der Ni-NTA Spin Columns (Qiagen)... 109
5.4.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 109
5.4.5 Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen... 110
5.4.6 Proteinquantifizierung mittels Bradford-Test... 110
5.5 Aktivitätsuntersuchungen von DNA-Polymerasen... 111
5.5.1 Primer-Verlängerungsreaktionen mit radiometrischer Produktanalyse... 113
5.5.2 Bestimmung der spezifischen Aktivität von Polß... 113
5.5.3 Untersuchung der Affinität der Polß zum Primer/Templat-Komplex ... 114
5.5.4 Pre-steady-state kinetische Untersuchungen ... 115
6. Materialien...117
6.1 Chemikalien ... 117
6.2 Nukleotide und Radiochemikalien ... 118
6.3 Standards und Kits... 118
6.4 Enzyme und Proteine... 118
6.5 Plasmide... 118
6.6 E. coli Stämme ... 118
6.7 Medien und Puffer (sofern nicht im Abschnitt Methoden aufgeführt)... 119
6.8 Geräte... 119
6.9 Verbrauchsmaterialien... 120
7. Anhang ...121
7.1 Oligonukleotidsequenzen... 121
7.2 Sequenzen der in den Primer-Verlängerungsreaktionen eingesetzten Primer und Template ... 122
7.2.1 Primer/Templat-Kombinationen für das Screening der Bibliothek... 123
7.3 Nukleotidsequenzen der klonierten Polßwt ... 123
7.3.1 CDS des Polßwt in pGDR11 ... 123
7.3.2 CDS der Mutante 5P20 in pGDR11 ... 124
7.3.3 CDS der Mutante 1L19 in pGDR11 ... 124
7.4 Proteinsequenzen... 125
7.4.1 Sequenz der Polßwt in pGDR11 ... 125
7.4.2 Sequenz der Polß 5P20 in pGDR11 ... 125
7.4.3 Sequenz der Polß 1L19 in pGDR11 ... 125
7.5 Nomenklatur der natürlichen Aminosäuren ... 126
7.6 Abkürzungsverzeichnis ... 126
8. Abbildungsverzeichnis ...128
9. Tabellenverzeichnis ...131
10. Literatur ...133
11. Danksagung ...143
12. Eidesstattliche Erklärung...145
1. Einleitung
1.1 Struktur und Aufbau der DNA
Die Struktur der DNA als Träger der Erbinformation wurde erstmals im Jahr 1953 von J. Watson und F. Crick als Doppelhelix beschrieben. Diese besteht aus zwei komplementären, antiparallel verlaufenden Polynukleotidmolekülen, die rechtsdrehend um eine gemeinsame Achse gewunden sind. Die Nukleotide der DNA bestehen aus einer heterozyklischen Base (Purin- oder Pyrimidinderivate), der 2-Desoxyribose sowie einer Phosphatsäure. Während sich auf der Außenseite der Helix das so genannte Zucker- Phosphat-Rückgrat befindet, sind auf der Innenseite die stickstoffhaltigen Basen lokalisiert und stehen über Wasserstoffbrücken in Wechselwirkung. Die komplementären Basenpaarungen zwischen Adenin und Thymin wird durch zwei, diejenige von Cytosin und Guanin durch drei Wasserstoffbrücken vermittelt.1 Eine vollständige Windung der Doppelhelix umfasst zehn Basenpaare, und ist 3,4 nm hoch. Es bilden sich hierbei eine große und eine kleine Furche aus (Abb. 1).
Abb. 1: Struktur der Doppelhelix der DNA und Übersicht über die kanonischen Basenpaarungen.
Bei der DNA handelt es sich um ein Polynukleotid, in dem die einzelnen Nukleotide (Abb.
2 A-D) über Phosphordiesterbrücken miteinander verbunden sind. Hierbei ist die α-
Phosphatgruppe am 5'-OH eines Nukleotids mit dem 3'-OH eines anderen Nukleotids verestert. Dadurch erhalten DNA-Moleküle zwei unterschiedliche Enden und somit eine Orientierung. Am so genannten 5'-Ende ist die Phosphatgruppe nicht an einer Esterbindung beteiligt, während am anderen, dem so genannte 3'-Ende (3'-OH- Terminus), eine freie Hydroxygruppe vorliegt (Abb. 2 E).
Abb. 2: Struktur der Nukleotide. Nukleotide mit Purinderivaten (A) Desoxyadenosinmono- phosphat und (B) Desoxyguanosinmonophosphat. Nukleotide mit Pyrimidinderivaten (C) Desoxythymidinmonophosphat und (D) Desoxycytidinmonophosphat. (E) Schema des Aufbaus eines Polynukleotids.
Bereits in ihrer Arbeit 1953, für die sie 1962 zusammen mit Maurice Wilkins den Nobelpreis erhielten, fiel J. Watson und F. Crick auf, „dass die speziellen Paarungen, die wir als gegeben voraussetzen, unmittelbar auf einen möglichen Vervielfältigungsmechanismus für die genetische Erbsubstanz schließen lassen“.1 Heute weiß man, dass diese Annahme zutreffend ist, denn die Abfolge der Nukleobasen, die so genannte DNA-Sequenz, bestimmt die genetische Information.
1.2 Schädigung der DNA
Die DNA als Erbinformation jeder Zelle ist dauerhaft exogenen und endogenen Einflüssen ausgesetzt, die zu Schädigungen führen können.
Exogen sind hierfür z.B. UV-Licht2, Viren3, Toxine4 und chemotherapeutische Behandlung sowie auch Zigarettenrauch5 verantwortlich. Es kann zu Doppelstrangbrüchen, Ausbildung von Pyrimidindimeren, Modifikation der DNA (sog. „bulky adducts“) und Schäden an den Basen kommen (z.B. O6-Methylguanine).6
In einem Drittel der humanen Zellen kommt es zu spontanen, endogen bedingten Mutationen. Es handelt sich hierbei meist um die Folgen von Hydrolyse und Oxidation7. Bei der Hydrolyse kann sowohl die Nukleobase als auch die glykosidische Bindung zwischen ihr und dem Zucker geschädigt werden. Ist ersteres der Fall, wird am häufigsten Cytosin desaminiert und so zu Uracil umgewandelt. Die Hydrolyse an der glykosidischen Bindung bedingt die Entstehung einer abasischen Stelle, was zum Verlust der genetischen Information führen kann.8
Reaktive oxidative Elemente („Reactive oxygen species (ROS)“) entstehen als Nebenprodukte normaler sauerstoffabhängiger Stoffwechselprozesse. Sie können das Genom im Zellkern durch Strangbrüche oder die Entstehung oxidierter Basen, z.B. 7,8- Dihydro-8-Oxoguanin (8-oxo-G), sowie abasischer Stellen schädigen.9
Weitere Schäden an der DNA, wie z.B. Substitution, Deletion, Insertion oder Duplikation von Basen, entstehen bei der Replikation oder Rekombination und auch bei der Zellteilung. Diese müssen postreplikativ behoben werden.10
DNA-Schäden müssen repariert werden, um die genetische Information fehlerfrei zu erhalten.11 Bereits wenige Mutationen können zur Entstehung von Krebs führen. Dies macht deutlich, welche Relevanz ein intaktes Reparatursystem in der Zelle hat.6
1.3 Reparaturmechanismen
Für die Reparatur von Doppelstrangbrüchen sind mehrere Mechanismen bekannt. Hierbei handelt es sich um homologe Rekombination („Homologous Recombination“, HR),12 die auf der Paarung gleicher Sequenzen beruht sowie nicht-homologe Endverknüpfung („Non-Homolologous End Joining“, NHEJ),13 an der keine homologen Sequenzen beteiligt sind. Des Weiteren ist die Verbindung über mikrohomologe, 5-25 Nukleotide große Bereiche („Microhomology Mediated End Joining“, MMEJ) bekannt.14
Basenfehlpaarungen werden durch den so genannten „Mismatch-Repair“ (MMR) repariert. Hierbei werden die fehlerhaften Basen erkannt und gegen die korrekten ausgetauscht. 15
Schäden wie Pyrimidindimeren oder „bulky adducts“ werden durch den Prozess der Nukleotidexzisionsreparatur („Nucleotide Excision Repair“, NER) behoben. Die Doppelhelix wird durch die Aktivität von Helikasen und Endonukleasen geöffnet und die geschädigte Stelle aus dem Strang herausgeschnitten. Diese Lücke wird durch Polymerisation unter Nutzung des ungeschädigten Stranges als Templat wieder aufgefüllt.16
Die durch Hydrolyse, Desamination, Oxidation oder Alkylierung verursachten Schäden an DNA-Basen werden in Säugetieren hauptsächlich durch Basen-Exzision-Reparatur („Base- Excision-Repair“, BER) repariert.6,17 Dieser Mechanismus ist unter 1.5.1 detailliert dargestellt.
Einen Überblick über die DNA-Schadstoffe, die dadurch verursachten Schäden und die Reparaturmechanismen gibt Tab. 1.
Tab. 1: Übersicht über die DNA-Schadstoffe, die durch sie verursachten Schäden und die zur Behebung erforderlichen Reparaturmechanismen (vgl. Referenz 6)
DNA-Schadstoffe DNA-Schäden Reparaturmechanismen
• Alkylierungsreagenzien → O6-Methylguanine Direkte Reparatur
• Spontane Reaktionen
• Sauerstoff Radikale
• Alkylierungsreagenzien
• Röntgenstrahlung
→ Abasische Stellen
→ Oxidiert, desaminierte, alkylierte Basen
→ Einzelstrangbrüche
Basenexzisionsreparatur (Base- Excision-Repair, BER)
• UV-Licht
• Umwelt-Mutagenese
→ Pyrimidin-Dimere
→ “bulky adducts” Nukleotidexzisionsreparatur („Nucleotide Excision Repair“, NER)
• Röntgenstrahlung → Doppelstrangbrüche
Homologe Reparatur (“Homologous Repair”, HR);
nicht-homologe Endverknüpfung („Non-Homologous End Joining“, NHEJ)
• Fehler in der Replikation
→ Fehlpaarungen
→ Insertionen
→ Deletionen
“Mismatch Repair”, MMR
1.4 Bypass eines DNA-Schadens
Die vorgenannten Reparaturmechanismen können nur stattfinden, wenn sich der Sequenzabschnitt nicht in der Replikation befindet. Tritt beschädigte DNA in die Vervielfältigung der Erbinformation ein und der Replikationsapparat konnte den Fehler nicht beheben, kann der Prozess blockiert werden. In einigen Fällen führt dies zur Apoptose.6
Es kann aber auch zu einem Bypass des Schadens („Translesion Synthesis“, TLS) kommen.
Hierbei wird an der Replikationsgabel die replikative durch eine so genannte Transläsions-DNA-Polymerase ausgetauscht, die den Schaden überlesen kann.18 Bei diesem fehleranfälligen Prozess kommt es zu Basensubstitutionen, Deletionen oder Insertionen, durch die Verschiebungen („Frameshifts“) in der DNA-Sequenz entstehen.19 Nach Synthese über den Schaden wird die Transläsions-DNA wieder durch eine replikative Polymerase ersetzt und die Vervielfältigung fortgesetzt. 20
Dieser Prozess unterscheidet sich deutlich von den anderen Reparaturmechanismen, da hierbei das Vorhandensein eines DNA-Schadens temporär toleriert wird.21
1.5 DNA-Polymerasen
Für Eukaryoten sind derzeit 15 verschiedene DNA-Polymerasen bekannt.22 Diese werden – abhängig von ihrer Sequenzhomologie und Strukturähnlichkeit – in die fünf Familien A, B, X, Y und RT eingeteilt.23, 24
Die für die DNA-Replikation zuständigen Polymerasen α (alpha), δ (delta) und ε (epsilon) gehören zur Familie B und die für die Replikation der mitochondrialen DNA verantwortliche Polymerase γ (gamma) zur Familie A. Bezüglich der unter 1.3 beschriebenen Reparaturmechanismen sind z.B. die Polymerasen ß (beta) und λ (lambda), die beide zur X-Familie gehören, an der Basenexzisionsreparatur (BER) beteiligt. Polymerase µ (mu), die ebenfalls der X-Familie angehört, wirkt im System der nicht-homologen Endverknüpfung (NHEJ) mit.13 Die Polymerasen δ (delta) und ε (epsilon) sind neben der DNA-Replikation auch an der Nukleotidexzisionsreparatur beteiligt.25 Für das Überlesen von DNA-Schäden sind zum einen die zur Familie A gehörende Polymerase ξ (zeta) und die Polymerasen τ (iota) κ (kappa) und η (eta), die der Familie Y angehören, zuständig.26 Zum anderen haben Untersuchungen gezeigt, dass
auch DNA-Polymerasen der Familien B (α und δ) und Y (Rev1) gegenüber einer abasischen Stelle einbauen können.27
Eine weitere wichtige DNA-Polymerase ist die Telomerase, die die 3´-Enden von Chromosomen (Telomere) verlängert. Die Synthese erfolgt revers, weshalb die Familie als RT („Reverse Transcriptase“) bezeichnet wird. RNA-Anteile der Zelle dienen hierbei als Templat. Durch die Funktion der Telomerasen wird die Verkürzung der Chromosomen vermieden, die anderenfalls bei jeder Replikation stattfinden und schließlich zur Apoptose führen würde. 28
In vorliegender Arbeit wurde ausschließlich mit der humanen DNA-Polymerase ß gearbeitet, weshalb diese in ihrer Funktion und Struktur nachfolgend näher beschrieben wird.
1.5.1 DNA-Polymerase ß und ihre Funktion
Die zur X-Familie gehörende DNA-Polymerase ß wurde 1971 erstmals als niedermole- kulare, DNA-abhängige Polymerase beschrieben.29,30 Die Beteiligung dieses Enzyms an der Synthese von Einzelstrangtemplaten konnte frühzeitig gezeigt werden.31,32 1993 gelang Singhal und Wilson der Nachweis, dass die DNA-Polymerase ß in in vitro Experimenten kleine Lücken in DNA-Strängen auffüllt, was als „Gap-Filling“ bezeichnet wird.33
Bis zum Jahr 1994 blieb jedoch unklar, welche Funktion das Enzym in der eukaryotischen Zelle hat. Gu et al. konnten zu diesem Zeitpunkt zeigen, dass das Ausschalten („Knock- out“) des DNA-Polymerase ß-Gens in Mäusen zur Letalität des Embryos führt. Dies deutete auf die wichtige Rolle des Enzyms in der fötalen Entwicklung hin.34 Die Beteiligung der DNA-Polymerase beta an der Basenexzisionsreparatur (BER) wurde durch eine 1996 veröffentlichte Arbeit von Sobol et al. deutlich. In diese führte das Ausschalten des DNA- Polymerase ß-Gens in Fibroblasten aus Mausembryos (MEFs) zu einer hohen Empfindlichkeit dieser gegenüber DNA-Alkylierungsstoffen.35
Studien von Wilson et al. gaben Aufschluss über die spezifische Funktion der DNA- Polymerase ß. Es konnte gezeigt werden, dass diese keine intrinsische Exonuklease- Aktivität aufweist, aber über eine 5´-Deoxyribose-Phosphatlyase und eine Lyaseaktivität
36
Die BER gilt als das Hauptreparatursystem der DNA in Säugetierzellen. Wie unter 1.3 beschrieben werden dadurch abasische Stellen repariert, die aufgrund von Hydrolyse an der glykosidischen Bindung zwischen der Nukleobase und dem Zucker entstehen.
Außerdem behebt dieses Reparatursystem die durch Desamination, Oxidation oder Alkylierung verursachten Schäden an DNA-Basen34,35 und ist auch an der Beseitigung von Fehlpaarungen, z.B. G-T oder G-U, beteiligt.37,38 Es werden zwei Wege der BER unterschieden: Zum einen der so genannte „Short Patch“, bei dem ein einzelnes Nukleotid ersetzt wird und zum anderen den „Long Patch“, bei dem mehr als ein Nukleotid ersetzt werden.39
Der schematische Ablauf eines „Short Patch“-Reparatursystem ist in Abb. 3 dargestellt.
Beim Vorliegen einer geschädigten Base kommt es zu einer Verzerrung der Helix.
Abhängig vom vorhandenen Schaden werden unterschiedliche Glykosylasen zur Entfernung der entsprechenden Base aktiviert.9 Anschließend wird an der abasischen Stelle das Zucker-Phosphat-Rückgrat am 5´-Terminus des Zuckers von einer AP- Endonuklease (APE) geöffnet. Hierdurch entsteht am 3´Terminus eine Hydroxy- und am 5´-Ende eine Phosphatgruppe.40 Die Neusynthese des fehlenden Nukleotids sowie die Entfernung der Phosphatgruppe werden von der DNA-Polymerase ß ausgeführt. Die verbleibende Lücke im Zucker-Phosphat-Rückgrat wird durch eine DNA-Ligase geschlossen.41
Abb. 3: Schematische Darstellung der Basenexzisionsreparatur bei Vorliegen einer einzelnen geschädigten Base („Short Patch Repair“).
Auch am „Long-Patch“-BER ist die DNA-Polymerase ß beteiligt. Sie hat hier die Funktion der Neusynthese des ersten fehlenden Nukleotids der Lücke. Dadurch wird die weitere DNA-Synthese durch andere DNA-Polymerasen ermöglicht.42
Die wichtige Rolle der DNA-Polymerase ß in der DNA-Reparatur konnte bis heute durch mehrere Untersuchungen nachgewiesen werden. Sweasy zeigte, dass Varianten der DNA- Polymerase ß zu einer veränderten Genauigkeit im Reparaturprozess führten. Die dadurch bedingten Mutationen sind wahrscheinlich mitverantwortlich für die Entstehung verschiedener Krankheiten, wie z.B. Krebs.43,44,45,46,47,48,49,50
Außerdem konnten weitere Funktionen der DNA-Polymerase ß aufgezeigt werden. Sweasy et al. wiesen in neueren Studien nach, dass diese auch einen Einfluss auf den korrekten Ablauf der Meiose nimmt. In Keimzellen von Mäusen, die einen Mangel des vorgenannten Enzyms aufwiesen, kam es zu fehlerhaften Chromosomenpaarungen in der Prophase I der Meiose, die zum Zelltod durch Apoptose führten.51 In weiteren Untersuchungenkonnte gezeigt werden, dass sowohl der homozygote als auch der heterozygote „Knock-out“ des DNA-Polymerase ß-Gens in Spermazellen von Mäusen zur Instabilität des Genoms führte.52
1.5.2 Kinetik des Reaktionsmechanismus der humanen DNA-Polymerase ß
Einen Überblick über den kinetischen Reaktionsmechanismus, mit dem die DNA-Poly- merase ß ein Nukleotid einbaut, ist in Abb. 4 dargestellt.
Abb. 4: Schematische Darstellung der Kinetik des Reaktionsmechanismus der DNA- Polymerase ß (nach Abbildung aus Referenz 53). (ß=DNA-Polymerase ß; Dn=DNA;
N=dNTP; *=Konformationsänderung; P=Pyrophosphat)
Die DNA-Polymerase ß (ß) formt im ersten Schritt einen binären Komplex mit der DNA (Dn). Anschließend wird das dNTP (N) an diesen Komplex gebunden (ß-Dn-N). Die Dissoziationskonstante wird als Kd angegeben. Beim Entstehen des ternäre Komplexes findet eine Konformationsänderung (ß*-Dn-N) statt, die zur Ausbildung der Bindungstasche führt. Dadurch wird das Nukleotid korrekt positioniert, was für die darauf folgende Phosphoryldiesterbindungsreaktion (ß*-Dn+1-P) notwendig ist, die im kpol-Wert wiedergegeben wird. Nach einer erneuten Änderung zur offenen Konformation wird das Pyrophosphat (P) freigesetzt (ß-Dn+1) und die DNA-Polymerase ß dissoziiert von der DNA.
Dieser Reaktionsschritt wird als der langsamste angesehen.53 1.5.3 Aufbau und Struktur der Polymerase ß
Mit 39 kDa handelt es sich um die kleinste bisher entdeckte eukaryotische DNA- Polymerase, die aus 335 Aminosäureresten besteht.41 Sie gehört zur Familie X der DNA- Polymerasen, ebenso wie die Polymerase λ, zu der sie eine hohe Sequenzhomologie aufweist, die Polymerase µ und die Terminal-Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT).54 DNA-Polymerase ß besteht aus einer 8 kDA großen, N-terminalen Lyasedomäne und einer 31 kDa großen, C-terminalen Polymerasedomäne. Diese sind durch eine Protease- sensible Region miteinander verbunden.54,55
Abb. 5: Schematische Struktur der DNA-Polymerase ß. In der Sekundärstruktur sind die α-Helices in gestreiften und die ß-Faltblätter in vollen Balken dargestellt. HhH bezeichnet eine Haarnadelstruktur zwischen zwei Helices („Helix-hairpin-helix“-Motif, HhH). Die mit * gekennzeichneten Positionen markieren wichtige Aminosäuren in der Sequenz: L72, D190, D192 und D256. (Entnommen und abgeändert aus Referenz 63).
Vielfältige Kristallstrukturen mit differenzierenden Liganden geben einen detaillierten Einblick in die Proteinstruktur der DNA-Polymerase ß.56,57,58 Wie bei anderen bekannten DNA-Polymerasen weist auch sie die typische Struktur einer Hand auf.56,59 Während die Lage der Subdomänen – Daumen, Handfläche und Finger – bei den meisten DNA- Polymerasen an eine rechte Hand erinnern, weisen die zur X-Familie gehörenden Polymerasen die Analogie zu einer linken Hand auf.55 Beard et al. führten für die Subdomänen der DNA-Polymerase ß eine an der Funktionalität ausgerichteten Nomenklatur ein und benannte diese mit C („catalytic“), D („duplex DNA binding“) und N („nascent base pair binding“).60 Dies korrespondiert mit der gängigen Bezeichnung (C≙Handfläche; D≙Daumen und N≙Finger), die auf DNA-Polymerasen mit einer Strukturanalogie zur rechten Hand angewendet wird.61 Die schematische Darstellung der Struktur der DNA-Polymerase ß in Abb. 5 gibt auch einen Überblick über die zuvor beschriebene Nomenklatur.
Die Lyasedomäne setzt sich aus 5 α-Helices (A-E) zusammen, von denen zwei Paar antiparallel angeordnet sind und sich in einem Winkel von 80° überschneiden.55 Die Domäne verfügt über eine 5´-Phosphat Bindungsstelle. Diese befindet sich stets an einem Lysin, variiert in der Position aber je nachdem, ob es sich um eine „Short-Patch“- oder „Long-Patch“-BER handelt. In ersterem Fall erfolgt die Bindung an Position K68,57 in letzterem konnte sowohl eine Bindung an Position K35 als auch an K68, K72 und K84 beobachtet werden.62
Die C-Subdomäne enthält 3 α-Helices (J, K und L) und die ß-Faltblattstrukturen 1-3. Das aktive Zentrum mit den Seitenketten D190, D192 und D256, die die für die Aktivität des Enzyms notwendige Mg2+-Ionen binden,63 befindet sich auf zwei ß-Faltblättern. Diese sind parallel angeordnet, während sie in den meisten DNA-Polymerasen antiparallel vorliegen.57
Die N-Subdomäne (AS 260-335) besteht aus den ß-Faltblattstrukturen 4-7 und den α- Helices M, N und O. Beim Eintreten eines korrekten Nukleotids umschließt sie das dNTP und die gegenüberliegende Templatbase.56,57,64,65 Dies bedingt eine Rotation von ca. 30°
um die M α-Helix.57,64
Die D-Subdomäne (Daumen,) besteht aus den 4 α-Helices F, G, H und I und weist eine Haarnadelstruktur („Helix-Hairpin-Helix“) zwischen F und G auf.63 Diese von den Seiten-
ketten 55-79 und 92-118 reichende Struktur bindet monovalente Metalle und interagiert mit dem Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA.62,66,67
Das Zusammenwirken der Domänen und Subdomänen der DNA-Polymerase ß führt zu deren individuellen biochemischen Funktionalität63 in den unter 1.5.1 beschriebenen Mechanismen.
1.5.4 Selektivität und Genauigkeit der DNA-Polymerase ß
Die DNA-Polymerase ß verfügt über keine Korrekturlesefunktion. Ihre Genauigkeit in in vitro Experimenten ist folglich nur auf die Selektivität des Enzyms zurückzuführen. Kunkel konnte 1985/86 für DNA-Polymerase ß eine in vitro Fehlerrate von 1,5 x 10-3 bis 5 x 10-3, d.h. ein Fehler pro 1.500 bis 5.000 Basen, nachweisen.68,69 Dabei konnte er auch den Zusammenhang zwischen der vorliegenden Fehlpaarung und dieser Rate zeigen.69 Die Größe der aufzufüllenden Lücke scheint nur einen Einfluss auf die Effizienz der DNA- Polymerase ß zu nehmen, nicht jedoch auf ihre Genauigkeit oder Selektivität.70,71
Weitere strukturanalytische und kinetische Experimente weisen darauf hin, dass die DNA- Polymerase ß zur Selektion des korrekten dNTPs die Templatbase durch eine Konformationsänderung stabilisiert. Dies führt zur Ausbildung eines aktiven Zentrums, in dem die geometrischen Eigenschaften des neuen Basenpaares überprüft werden können.72 Untersuchungen in dem Bereich des aktiven Zentrums lassen den Schluss zu, dass bestimmten Positionen, z.B. R28373, D25657, F27274 und N279 und Y27175, selektive und katalytische Funktionen zukommen.
Der Einfluss von Aminosäureresten, die sowohl innerhalb als auch außerhalb des aktiven Zentrums liegen, lassen den Schluss zu, dass die Bewegung und Positionierung der Sub- domänen einen wesentlichen Einfluss auf die Genauigkeit der DNA-Polymerase ß haben.76 1.6 Gerichtete Evolution an DNA-Polymerasen
In der modernen Molekularbiologie stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung, mit denen Vorgänge der natürlichen Evolution im Labor simuliert werden können. Zufällige Mutationen können hierbei zur Erzeugung von Diversität dienen und auch der Einsatz rekombinanter Methoden kann zu Proteinen mit veränderten Eigenschaften führen. Diese
werden durch Screening oder Selektion identifiziert und anschließend charakterisiert.77 Beide Methoden bedingen die Verknüpfung von Phänotyp und Genotyp.78
Durch diese Methodik konnten bereits DNA-Polymerasen gefunden werden, die verbesserte Eigenschaften aufweisen. Hierbei handelt es sich z.B. um ein erhöhtes Substratspektrum oder höhere Proteinstabilität.79,80,81,82,83,84,85,86 Diese Proteine finden teilweise Einsatz in der Labortechnik, z.B. der Polymerasekettenreaktion. Des Weiteren wird die gerichtete Evolution angewendet, um Aufschluss über den Zusammenhang zwischen der Struktur und der Funktion von Proteinen zu gewinnen.78
Die gerichtete Evolution beruht auf verschiedenen Schritten, die in Abhängigkeit ihres Ergebnisses wiederholt werden. Zuerst wird die Variabilität in das Genom eingebracht und anschließend die Mutanten mit den angestrebten Eigenschaften identifiziert, isoliert und charakterisiert.
Methoden zur Einbringung der Variabilität sind z.B. die ungerichtete Mutagenese durch fehlerhafte PCR („error-prone PCR“), die Sättigungsmutagenese eines einzelnen Kodons und die ortsgerichtete Mutagenese („Side-directed Mutagenesis“).77 Für die Identifizierung der Eigenschaften und die Charakterisierung werden Protein-spezifische Screeningverfahren und Versuchsanordnungen entwickelt.
1.7 Ziele dieser Arbeit
Mit dieser Dissertation sollte in einem ersten Projekt neue Erkenntnisse über eine erhöhte Akzeptanz von DNA-Schäden durch DNA-Polymerasen gewonnen werden, da der Prozess der Replikation von DNA-Schäden noch nicht vollkommen geklärt ist.
Die humane DNA-Polymerase beta (Polß) diente in diesem Ansatz als Model. Mit der Methode der gerichteten Evolution sollte eine Variante des Wildtypen gefunden werden, die eine erhöhte Akzeptanz von DNA-Schäden aufweist. Folglich wird eine DNA- Polymerase, die keine Überlesefunktion besitzt, in eine Polymerase umgewandelt, die Bypass-Syntheseaktivität aufweist. Dies sollte zum Aufschluss über den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion des Enzyms beim Überlesen eines DNA-Schadens dienen.
In den Untersuchungen sollten zumeist abasische Stellen verwendet werden, da es sich hierbei um eine der am häufigsten in der lebenden Zelle vorkommenden DNA-Läsionen handelt. Nach Erstellen einer Mutantenbibliothek sollte diese mit einem bereits etablierten Screeningsystem durchmustert werden. Eine spezifische Charakterisierung der identifizierten Mutanten war angestrebt.
In einem zweiten Projekt sollte die Abhängigkeit der Funktionalität und Selektivität der Polß von sterischen Zwängen in der Bindungstasche untersucht werden.
Zur Umsetzung dieser Untersuchung sollte in Polß die in der Bindungstasche befindliche Position F272, von der ein Einfluss auf die vorgenannten Eigenschaften in Studien anderer Arbeitsgruppen bereits gezeigt werden konnte, in alle 19 möglichen Amino- säuren mutiert werden. Die anschließenden Untersuchungen hatten zum Ziel, die Mutan- ten zu ermitteln, die in der Lage sind, sterisch veränderte Nukleotide gegenüber Desoxyadenosin effizienter einzubauen als Polßwt. Hierfür sollten am 4´C des Zuckers alkylierte TTPs in die Primer-Verlängerungsreaktionen eingesetzt werden. Die ausgewählten Mutanten sollten des Weiteren hinsichtlich ihrer Selektivität untersucht werden. Dies war anhand kinetischer Untersuchungen von nicht-kanonischem Nukleotideinbau angedacht. Des Weiteren war in diesem Ansatz ein Vergleich bezüglich Selektivität, Genauigkeit und Effizienz von Polßwt und der selektierten Mutanten bei Replikation von Templat bzw. dem Auffüllen der Lücke von einer Base angestrebt. Hierfür sollten identische Versuche mit unterschiedlichen Primer-Templat-Komplexen durchgeführt werden.
2. Ergebnisse und Diskussion des Screenings einer Polß-Mutanten Bibliothek
Die DNA wird dauerhaft durch exogene und endogene Einflüsse geschädigt. Unter physiologischen Bedingungen kommt es am häufigsten zur Ausbildung einer abasischen Stelle (Abb. 6). Diese resultiert aus der spontanen Hydrolyse der Verbindung zwischen dem Zucker und der Nukleobase in der DNA.8 Es wird geschätzt, dass ca. 10.000 abasischen Stellen in einer menschlichen Zelle pro Tag entstehen.8,87,88 Da es durch das Abspalten der Base zum Verlust der gespeicherten genetischen Information kommt, stellen alle durch abasische Stellen im Genom entstehenden Lücken potentielle Erbgutschäden dar.88
Abb. 6: Hydrolyse der Verbindung zwischen Zucker und Nukleobase. Dargestellt ist der Verlust der Nukleobase, der zur Ausbildung einer abasischen Stelle führt.
Ein Großteil dieser Schäden wird durch das DNA-Reparatursystem behoben. Hierbei wird der DNA-Schwesterstrang als Vorlage für die Inkorporation des korrekten Nukleotids anstelle des Schadens genutzt. Nicht detektierte Läsionen oder solche, die während der S-Phase des Zellzyklusses entstehen, behindern DNA-Polymerasen. Hierbei handelt es sich neben Polymerasen der Replikation20,22 auch um die an der Basen-Exzisions- Reparatur beteiligte DNA-Polymerase ß.35
Prakash et al. konnten 2005 erstmals spezielle DNA-Polymerasen identifizieren, die zum Überlesen von DNA-Schäden geeignet sind.26 Diese Enzyme wurden in unterschiedlichen Organismen nachgewiesen und sind in menschlichen Zellen beispielsweise an der Unterdrückung von Hautkrebs beteiligt. Es wird vermutet, dass die Transläsions-Synthese nach der chromosomalen Replikation, folglich außerhalb der S-Phase, abläuft.89,90 Die mechanistischen Grundlagen, die dazu führen, dass einige DNA-Polymerasen DNA- Schäden überlesen können, während andere dazu nicht in der Lage sind, sind noch immer nicht gänzlich verstanden.
In der vorliegenden Arbeit wurde mit der humanen DNA-Polymerase ß (Polß) gearbeitet, die häufig als Modell für die Untersuchung von grundlegenden Mechanismen der DNA- Polymerasen, wie z.B. Aktivität und Genauigkeit, eingesetzt wird. Das Enzym wurde in der Vergangenheit bereits umfassend bezüglich seiner Funktion und Struktur studiert.63 Wie unter 1.5.3 beschrieben, handelt es sich bei der zur X-Familie gehörenden Polß um die kleinste bisher entdeckte eukaryotische DNA-Polymerase.41,54 Sie ist nicht an TLS beteiligt.
Es war das Ziel, durch gerichtete Evolution eine Mutante ausfindig zu machen, die eine erhöhte Überlesefunktion von DNA-Schäden aufweist. Dies sollte Aufschlüsse über die Unterschiede in den strukturellen und biochemischen Eigenschaften von Bypass- und Nicht-Bypass-Polymerasen geben.
Für die Herstellung der Mutantenbibliothek wurde auf die Versuchsergebnisse von Di Pasquale zurückgegriffen.91 In deren Untersuchungen hatte sich gezeigt, dass die Expression von Polß in E. coli-Zellen durch die Verwendung einer E. coli kodon- optimierten Version des Polß-Gens deutlich verbessert werden kann. Es wurde daher ausschließlich mit dem bereits im Labor vorhandenen, bei der Firma Geneart bestellten
„codon-optimized Polymerase beta“ (Polß) Gen gearbeitet.
Für die Ermittlung der Mutantenaktivität wurde ein von Summerer82 etabliertes und von Di Pasquale91 optimiertes Screeningsystem verwendet. Dieses basiert auf der Detektion des Endpunktes einer Primer-Verlängerungsreaktion durch den Fluoreszenzfarbstoff Sybr- Green I und ermöglicht das Arbeiten im „High-Throughput-Screening“. Hierbei wird die Eigenschaft von SybrGreen I genutzt, dass sich dessen Fluoreszenz bei Bindung an die kleine Furche von doppelsträngiger DNA verstärkt. Der Farbstoff wird bei einer Wellenlänge von 485 nm angeregt und die Fluoreszenzmission erfolgt bei 520 nm.
Für das im Anschluss vorgenommene Screening auf die Bypass-Eigenschaften der aktiven Mutanten wurde das von Di Pasquale optimierte System verwendet. In die Primer- Verlängerungsreaktion wurden Template mit DNA-Schaden eingesetzt. Durch Messung der Fluoreszenz konnte ein direkter Rückschluss auf den Bypass des Schadens gezogen werden.
2.1 Identifizierung von Polß-Mutanten mit erhöhter Bypass-Aktivität einer abasischen Stelle durch Screening einer Bibliothek
2.1.1 Konstruktion der Polß-Mutanten-Bibliothek
Zum Anlegen einer Mutanten-Bibliothek wurde die Methode der fehleranfälligen PCR („error-prone“ PCR) angewendet. Diese basiert auf der erhöhten Fehlerrate der Taq DNA- Polymerase in Gegenwart von Mn2+. Hierbei finden mehr Transitionen als Transversionen statt.92 Zum Ausgleich dieser Fehlertendenz wurden im PCR-Ansatz unbalancierte dNTP- Mengen verwendet (5.2.1). Als Templat diente die bereits im Labor vorhandene E. coli kodon-optimierte DNA des Wildtyps der humanen DNA Polymerase ß (Polßwt). Die eingesetzten Primer enthielten in ihrer Verlängerungen Schnittstellenmuster für die Restriktionsenzyme BamHI und SalI. Des Weiteren war der Primer in Leserichtung um die Sequenz eines His-tags verlängert.
Im Anschluss an die PCR erfolgte ein Restriktionsverdau, der ebenfalls auf dem ausgewählten Zielvektor (pGDR11) angewandt wurde (5.2.5). Nach Dephosphorylierung des Restriktionsverdaus des Vektors wurden beide Produkte über ein 1 %iges Agarosegel aufgereinigt und anschließend ligiert. Nach Transformation in E. coli XL10gold Zellen mittels Hitzeschock erfolgten das Ausplattieren sowie der Anwuchs der Kolonien über Nacht. Zur Kontrolle der Fehlerrate und der Transformation wurden 20 Klone angezogen, die Plasmide isoliert und sequenziert. Das Ergebnis zeigte eine ausreichende Fehlerrate, so dass der Ansatz zum Anlegen einer Mutantenbibliothek von insgesamt 20 384- Wellplatten verwendet wurde.
2.1.2 Übersicht über das Screeningsystem
Die aus der fehleranfälligen PCR hergestellte Mutantenbibliothek wurden mittels des in Abb. 7 gezeigten Screeningssystems selektiert. Dieses wurde in der AG Marx von Summerer82 entwickelt und für Polß von Di Pasquale91 optimiert.
Die Einzelkolonien wurden in 384-Deepwellplatten kultiviert (5.4.1.1). Diese Flüssigkulturen wurden zwecks Lagerung bei -80 °C mit Glycerol versetzt. Aus diesen Lagerplatten erfolgte ein Überimpfen mittels Pipettierroboter in 96-Deepwelplatten, in denen die Überexpression der Proteine durchgeführt wurde. Die pelletierten Bakterien wurden bei -80 °C gelagert. Zur Durchführung eines Aktivitätstests wurden diese
Bakterien lysiert. Die Extrakte konnten nach Zugabe eines Lagerpuffers direkt in die Primer-Verlängerungsreaktion in 384-Well-Mikrotiterplatten eingesetzt werden. Für alle mit Lysaten durchgeführten Primer-Verlängerungsreaktionen wurden modifizierte Primer verwendet, die eine Phosphorothioat-Bindung am Primerterminus enthielten. Diese Modifikation ist bekannterweise widerstandsfähiger gegen Exonukleasen als unmodifizierte DNA. 93
Jede 384-Well-Mikrotiterplatte enthielt 16 Wildtypen der kodon-optimierten humanen DNA-Polymerase (Polßwt) sowie 16 katalytisch-inaktive Mutanten, die als Negativkontrolle (NK) dienten. Die Reaktionen wurden bei 37 °C für 30 min durchgeführt und anschließend mit einer EDTA und SybrGreenI enthaltenden Lösung gestoppt. Die Fluoreszenz wurde in einem Plattenlesegerät (Infinite M200, Tecan) gemessen.
Abb. 7: Übersicht über die verwendete Screening Methode. Kolonien, die Plasmide mit codierenden Sequenzen des mutierten Polßwt trugen, wurden einzeln gepickt und in 384-Deepwellplatten kultiviert. Nach Lyse der Mutanten erfolgte ein Aktivitätstest.
Mit den aktiven Enzyme wurden anschließend zwei weitere selektive Screens durchgeführt.
2.1.3 Ergebnisse des Screenings der Bibliothek
Verteilt über zwanzig 384-Deepwellplatten wurden insgesamt 7040 Mutanten durchmustert. Im ersten Screening wurde ein ungeschädigtes Templat (T90A) zur Ermittlung der Aktivität der Mutanten eingesetzt. 1747 Mutanten (ca. 25 %) wiesen eine Aktivität >80 % als Polßwt auf (Abb. 8A). Diese wurden mithilfe eines Pipettierroboters in fünf neue 384-Deepwellplatten überführt und für ein zweites Screening verwendet.
In diesem Schritt wurde ein Templat verwendet, das das Analogon einer stabilen abasischen Stelle (nachfolgend als “stabile abasische Stelle“ bezeichnet, s. Abb. 8 C) ent- hält (P20thioAG/T90F). Selektiert wurden die Mutanten mit einer höheren Bypass- Aktivität als Polßwt (Abb. 8 B). Die Anzahl lag bei 469, d.h. ca. 27 % der Mutanten, die eine höhere Aktivität als Polßwt zeigten und 7 % der Gesamtbibliothek. Es erfolgte erneut das Überführen der selektierten Mutanten in zwei neue 384-Deepwellplatten, die für das dritte Screening verwendet wurden.
In diesem wurde zur weiteren Einschränkung auf einer 384-Well-Mikrotiterplatte zeitgleich zwei Primer-Verlängerungsreaktionen aus den gleichen Lysaten angesetzt. Zum einen wurde hierbei ein Templat, das eine stabile abasische Stelle enthält, eingesetzt.
Dieses ist um 34 Basen kürzer als das zuvor verwendet (F20thioAG/T56F). Zum anderen wurde ein Templat der vorherigen Länge verwendet, das insgesamt drei stabile abasische Stellen enthält (F20thioAG/T903F). Ausgewählt wurden die Mutanten, die in beiden Reaktionen eine höhere Bypass-Aktivität zeigten als Polßwt. In Abb. 8 C ist die ermittelte Aktivität der Mutanten im Vergleich zu ihrem Ergebnis aus dem ersten Aktivitäts- Screening dargestellt. Die Werte für Polßwt wurden hierbei gleich Null gesetzt.
Die aus dem dritten Screening selektierten 39 Mutanten, d.h. 8 % der aus dem zweiten Screening selektierten Mutanten und 0,6 % der Gesamtbibliothek, wurden in eine neue 384-Deepwellplatte überführt und als Glycerolstocks gelagert. Diese Glycerolstocks wurde für die weiteren beschriebenen Versuche verwendet.
Abb. 8: Graphische Darstellung der einzelnen Screening-Ergebnisse. (A) Ergebnis des Screenings auf Aktivität aller 7040 Mutanten unter Verwendung eines ungeschädigten Primer-Templat-Komplexes (P20thioAG/T90A). Dargestellt sind alle Mutanten, die mindestens 80 % der Polßwt-Aktivität zeigten. (B) Ergebnis des Screenings auf Bypass-Eigenschaften der selektierten 1747 aktiven Mutanten unter Verwendung eines geschädigten Templats (P20thioAG/T90F). Gezeigt ist die Anzahl der Mutanten, die eine höhere Bypass-Aktivität zeigten als Polßwt. (C) Ergebnis der weiteren Selektion durch zwei parallele Primer-Verlängerungsreaktionen (P20thioAG/T903F [blau] und P20thioAG/T56F [orange]). Gezeigt ist die Aktivität im Vergleich zum Ergebnis aus dem vorausgegangenen Aktivitäts-Screening [grün]. Die Rate von Polßwt wurde hierbei auf Null gesetzt. (NK=Negativkontrolle)
2.2 Radiometrische Untersuchungen der Lysate der selektierten Mutanten
Die 39 selektierten Mutanten wurden in radiometrischen Primer-Verlängerungsreaktionen charakterisiert. Hierzu wurden die wie unter 5.4.2 beschrieben hergestellten Lysate verwendet.
Diese wurde zur Überprüfung der Konzentrationen der Proteine mittels SDS-PAGE analysiert und in ihrem Laufverhalten mit bereits aufgereinigtem Polßwt verglichen (Abb.
9 A). Alle Lysate zeigten eine vergleichbare Konzentration, so dass sie unverändert eingesetzt wurden.
2.2.1 Überprüfung der Aktivität und der Bypass-Eigenschaften über eine stabile abasische Stelle
Für die Untersuchungen wurden 33 Basenpaar lange Template verwendet, die an Position 27 entweder ein Desoxyadenosin (T33A) oder eine stabile abasische Stelle (T33F) enthalten (Abb. 9 B). Der Unterschied in der Struktur einer natürlich abasischen Stelle und des hier verwendeten Analogons – als stabile abasische Stelle bezeichnet - ist in Abb.
9 C dargestellt.
Die Analyse der Primer-Verlängerungsreaktionen zeigte, dass viele der als Treffer selektierten Mutanten so genannte „falsche Positive“ waren. Sie zeigten zum größten Teil eine Verlängerung in Gegenwart eines unbeschädigten Templatstrangs (Abb. 9 D). Die entsprechenden Banden waren im Vergleich zu Polßwt jedoch oft von schwächerer Intensität. 20 Mutanten zeigten eine mit Polßwt vergleichbare Aktivität.
Diese 20 Mutanten zeigten auch die Eigenschaft, an einer abasischen Stelle vorbei zu synthetisieren. Sie erreichten zwar Volllänge, was durch den Vergleich zu Polßwt in einer Reaktion mit dem Primer-Templat-Komplex P20thioAG/T33A sichtbar wurde, aber es zeigte sich nur eine geringe Ausbeute (Abb. 9 E).
In diesen Untersuchungen konnte unter den 20 Mutanten auch in Wiederholungs- versuchen keine einzelne mit besonders hervorstechenden Eigenschaften verifiziert werden. Daher wurden alle 20 Mutanten zwecks weiterer Einschränkung untersucht.
Vier der 39 Mutanten zeigten einen extrem starken Abbau des Primer-Templat-Komplexes.
Dies konnte durch Ausmessen des PAGE-Gels mit einem Geiger-Müller-Zähler weit unterhalb der Laufbande des Primers nachgewiesen werden.
Abb. 9: Radiometrische Primer-Verlängerungsreaktionen der 39 selektierten Mutanten aus Lysaten. (A) Analyse der 39 Lysate sowie des Polßwt (wt), NK (Negativkontrolle) und eines aufgereinigten Polßwt (wt*) mittels SDS-PAGE zur Kontrolle der Konzentration sowie der Laufhöhe, (M= Marker). (B) Ausschnitt aus der Sequenz der verwendeten Primer-Templat-Komplexe. (C) Strukturen einer abasischen Stelle (AP) sowie des hier verwendeten Analogons (F). (D) Ergebnis der Primer- Verlängerungsreaktion mit ungeschädigtem (T33A) bzw. geschädigtem (T33F) Templat (E) unter Verwendung aller vier dNTPs. Zur Volllängenkontrolle diente der Auftrag des Polßwt Reaktion mit P20thioAG/T33A (kursiv). Die Reaktionen enthielten 150 nM Primer-Templat-Komplex (P20thioAG/T33A bzw. F), 5 µl Lysat, 200 µM dNTPs.
Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 30 min.
2.2.2 Überprüfung der Bypass-Eigenschaften über ein 8-Oxo-desoxyguanosin Mit den Lysaten der 20 aus den vorangegangenen radiometrischen Reaktionen selektierten Mutanten wurde eine Primer-Verlängerungsreaktion unter Einsatz eines
Templats durchgeführt, das an Position 29 ein 8-Oxo-desoxyguanosin (8-OxoG) aufwies (Abb. 10 A, B).
Abb. 10: Radiometrische Primer-Verlängerungsreaktionen der 20 selektierten Mutanten.
(A) Ausschnitt aus der Sequenz des verwendeten Primer-Templat-Komplexes. (B) Struktur des 8-OxoG. (C) Ergebnis der radiometrischen Primer-Verlängerungsreaktion mit geschädigtem Templat (T33oG). Zur Volllängenkontrolle diente der Auftrag des Polßwt Reaktion mit P20thioAG/T33A (kursiv), (NK=Negativkontrolle). Die Reak- tionen enthielten 150 nM Primer-Templat-Komplex (P20thioAG/T33oG), 5 µl Lysat, 200 µM dNTPs. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 30 min.
Die Analyse diese Primer-Verlängerungsreaktionen zeigte, dass acht Mutanten besser über den DNA-Schaden hinweg synthetisierten als der Polßwt. Die Aktivität stellte sich in der PAGE höher dar als die des Polßwt in der Reaktion unter Einsatz des unbeschädigten Templats (T33A) (Abb. 10 C). Da sich dieses Ergebnis reproduzieren ließ, wurden diese acht Mutanten weiter untersucht.
2.2.3 Sequenzierung der acht selektierten Mutanten
Die für die acht Mutanten codierenden Plasmide wurden isoliert und die codierende DNA- Sequenz von GATC Biotech AG bestimmt. Das Ergebnis dieser Sequenzierungen, das in Tab.
2 dargestellt ist, ergab eine Übereinstimmung der Mutanten 1P16 und 1C17 aufgrund der
zwei stillen Mutationen in 1C17 an den Positionen 768 und 774. Des Weiteren zeigte sich, dass die Mutanten 1A9, 2C3 und 2K3 identische Veränderungen aufwiesen.
Die weiteren Untersuchungen wurden mit den fünf Mutanten 1P16, 105, 1A9, 1L19 und 1P22 durchgeführt. Die Bezeichnung lässt den Rückschluss auf die Position des Wells sowie die Nummer der 384-Deepwellplatte zu.
Tab. 2: Übersicht über das Sequenzierungergebnis der acht Hits aus dem Bibliothek-Screening.
Mutante Mutiertes Basenpaar
Aminosäure-
austausch Tripletts Basenaustausch
1P16 698 C T ACC ATC Thr Ile T233I
1C17 698 C T ACC ATC Thr Ile T233I
768 T C GAT GAC Asp = Asp =
774 T C CGT CGC Arg = Arg =
1O5 228 T A TTT TTA Phe Leu F76L
259 A G AAA GAA Lys Glu K87E
293 A T AAC ATC Asn Ile N98I
549 T A CGT CGA Arg = Arg =
1A9 293 A T AAC ATC Asn Ile N98I
1L19 132 C A AGC AGA Ser Arg S44R
295 T C TTT CTT Phe Leu F99L
367 G A GAG AAG Glu Lys E123K
698 C T ACC ATC Thr Ile T233I
721 C T CTG TTG Leu = Leu =
1P22 92 A G CAG CGG Gln Arg Q31R
2C3 293 A T AAC ATC Asn Ile N98I
2K3 293 A T AAC ATC Asn Ile N98I
2.3 Aufreinigung und weitere radiometrische Überprüfung der selektierten Mutanten
Die benannten fünf Mutanten wurden wie unter 5.4.3.1 beschrieben aufgereinigt. Nach Reinheitskontrolle der Proteine durch Auftrennung mittels SDS-Page und Coomassie- Färbung wurden die erhaltenen Proteinmengen mittels Bradford-Test quantifiziert. Zur Angleichung der Konzentrationen erfolgte ein Auswertung durch SDS-PAGE unter gleichzeitiger Verwendung des im Labor bereits aufgereinigt vorhandenen Polßwt. Des Weiteren wurde die von Di Pasquale gefundene Mutante 5P20 aufgetragen. Diese sollte in späteren Untersuchungen zur Charakterisierung eines Hits als Vergleich dienen (Abb.
11 A).
Eine Überprüfung der Aktivität durch radiometrische Primer-Verlängerungsreaktion unter Verwendung des ungeschädigten Templats T33A (Abb. 11 B, C) zeigte, dass alle aufge- reinigten Mutanten mindestens genauso aktiv waren wie Polßwt. Die Aktivität von 1P16 und 1L19 wirkte durch die ausgeprägte Verlängerung des Volllängenprodukts um eine Base verstärkt. Bei keinem der aufgetragenen Ansätze zeigte sich Primerabbau. Alle mit aufgereinigten Polymerasen verwendeten Primer waren unmodifiziert, da die humane Polymerase ß keine intrinsische Exonuklease-Aktivität besitzt.
Die Bypass-Eigenschaften wurden unter Verwendung des Templats T33F, das an Position 27 eine stabile abasische Stelle trägt, und eines Primers, der drei Basen vor diesem Defekt anlagert, durchgeführt (Abb. 11 C, D). Unter diesen so genannten „Running-Start“-Be- dingungen zeigten alle Mutanten im Gegensatz zu Polßwt einen Einbau gegenüber der stabilen abasischen Stelle sowie den Einbau eines weiteren Nukleotids. Bei den Mutanten 1L19 und – geringer ausgeprägt –auch bei 1P16 ist auch die Synthese von längeren Produkten erkennbar.
Abb. 11: Aufreinigung und radiometrische Untersuchung der fünf selektierten Mutanten unter „Running-Start“-Bedingungen. (A) Auftrennung mittels SDS-PAGE zur Konzentrations- und Reinheitskontrolle der aufgereinigten fünf Mutanten sowie des Polßwt (wt) und der bereits vorhandenen Mutante 5P20 (kursiv) (M=Marker). (B) Ausschnitt aus der Sequenz der verwendeten Primer-Templat-Komplexe. (C) Radiometrische Überprüfung der Aktivität der fünf aufgereinigten Mutanten unter Verwendung des ungeschädigten Templats (T33A). (D) Ergebnis der radiometrischen Primer-Verlängerungsreaktion zum Bypass einer stabilen abasischen Stelle unter Verwendung des geschädigten Templats (T33F). Die Reaktionen enthielten 150 nM Primer-Templat-Komplex (P20/T33A/F), 200 nM Polymerase, 200 µM dNTPs. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 30 min.
Die beiden Mutanten 1P16 und 1L19 wurden nachfolgend dahingehend untersucht, welches Nukleotid gegenüber der abasischen Stelle eingebaut wurde. Zum Vergleich wurden wiederum Polßwt und 5P20 herangezogen. Die Primer-Verlängerungsreaktion wurde in Gegenwart eines Primers durchgeführt, dessen 3´-Primerterminus direkt vor der Modifikation anlagerte, was als „Standing-Start“ bezeichnet wird (Abb. 12 A). Verwendet wurde ein Templat, dessen Sequenz dahingehend von T33F abweicht, dass es nach der stabilen abasischen Stelle Desoxycytosin (C) und nachfolgend Desoxyguanosin (G) trägt (T33FCG). Zur Kontrolle wurden alle Primer-Verlängerungsreaktionen auch mit unge- schädigtem Templat durchgeführt. An der Position der stabilen abasischen Stelle befand sich in diesem Fall ein G, da sich in vorangegangenen Untersuchungen gezeigt hatte, dass unter natürlichen Bedingungen vorwiegend an diesem Nukleosid abasische Stellen entstehen (T33G).88
Abb. 12: Untersuchung der Bypass-Eigenschaften der zwei selektierten Mutanten im Vergleich zu Polßwt und der bekannten Mutante 5P20 unter „Standings-Start“- Bedingungen. (A) Ausschnitt aus der Sequenz der verwendeten Primer-Templat- Komplexe und Übersicht über die verwendeten Substrate. (B) Ergebnis der radiometrischen Primer-Verlängerungsreaktion zum Bypass eine stabilen abasischen Stelle unter Verwendung des geschädigten Templats (T33FCG) sowie aller vier dNTPs gemeinsam (X=N) oder einzeln (X=A≙dATP; C≙ dCTP, G≙dGTP, T≙TTP). Zum Volllängenvergleich wurden die Reaktionen einmal mit ungeschädigtem Templat (T33G) unter Vorliegen aller vier dNTPs (X=N) durchgeführt. Die Reaktionen enthielten 150 nM Primer-Templat-Komplex (P23/T33G/F), 500 nM Polymerase, 200 µM dNTPs. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 30 min.
Die mit den aufgereinigten Mutanten durchgeführten radiometrischen Untersuchungen führten zu dem Ergebnis, dass nur die Mutante 1L19 deutlich höhere Aktivität als Polßwt aufwies. Im Vergleich zur Mutante 5P20 zeigte sie schwächere Bypass-Synthese. In den nachfolgenden Untersuchungen wurde 1L19 im Vergleich zu Polßwt und 5P20 näher charakterisiert (Abb. 12 B).
2.4 Ergebnisübersicht des Screenings der Mutanten-Bibliothek und der Identifizierung einer Hit-Mutante
Aus der 7040 Mutanten umfassenden Polß-Bibliothek konnten über die beschriebenen Screeningverfahren 39 Mutanten selektiert werden, die weiter untersucht wurden. Diese Experimente zeigten 20 Mutanten mit einer erhöhten Bypass-Eigenschaft über eine stabile abasische Stelle (F) auf. Von diesen 20 Mutanten konnte für 8 eine erhöhte Bypass-Eigenschaft über 8-OxoG gezeigt werden. Die Sequenzierung dieser Mutanten ergab, dass nur fünf in ihrer Sequenz differenzierten. Nach Aufreinigung dieser fünf Mutanten und Angleichung der Konzentrationen zu der des Polßwt und der bereits bekannten Mutante 5P20 wurden weitere Untersuchungen zur Aktivität und Bypass- Synthese unter „Running-Start“-Bedingungen durchgeführt. Nur zwei Mutanten zeigten eine erhöhte Aktivität im Vergleich zu Polßwt. Mit diesen beiden Mutanten sowie Polßwt und 5P20 wurden anschließend Primer-Verlängerungsreaktionen unter „Standing-Start“- Bedingungen durchgeführt. Bei diesen zeigte sich nur 1L19 deutlich aktiver als Polßwt, aber weniger aktiv als 5P20.
Einen Überblick über das zuvor beschriebene Selektionsverfahren gibt Abb. 13. Die Charakterisierung des Hits 1L19 ist nachfolgend beschrieben.
Abb. 13: Überblick über die Selektion eines Hits aus einer Bibliothek von 7040 Mutanten des Polß.
2.5 Diskussion der Ergebnisse aus dem Screening der Mutanten-Bibliothek der Polß
Die Mutantenbibliothek wurde mit Hilfe der fehleranfälligen („error-prone“) PCR angelegt.
Hierbei wird die Fehleranfälligkeit der Taq DNA-Polymerase bei Verwendung von Mn2+- Ionen genutzt. Da hierbei vermehrt Transitionen als Transversionen auftreten – insbesondere die Mutation A zu G-, wurden differenzierende Konzentrationen an dNTPs eingesetzt (5.2.1). Des Weiteren nehmen die MnCl2+-Konzentration sowie die Anzahl der Zyklen in der PCR-Reaktion Einfluss auf die Fehlerrate.
Die Sequenzierung von zwanzig Klonen aus der erstellten Bibliothek zeigte auf, dass unter Verwendung dieser Mutagenese keine Wildtyp-Sequenzen verblieben. Es kam zu Einzel- und Mehrfachmutationen; Deletionen traten nicht auf.
Die Ergebnisübersicht des Screenings der Mutanten-Bibliothek und der Identifizierung einer Hit-Mutante ist unter 2.4 ausgeführt und in Abb. 13 dargestellt.
Aus den im Screeningverfahren erzielten 39 Hits hatte sich nach Durchführung aller Kontrollreaktionen nur einer bestätigt. Die „falsch-positiv“ selektierten Mutanten sind wahrscheinlich auf die hohen Hintergrundwerte bei der Auswertung der Fluoreszenz- signale zurückzuführen. Die Bedingungen wurden hierbei weniger stringent gewählt, da das SybrGreenI Screening eine Verringerung der Bibliothekgröße zum Ziel hatte, wobei möglichst wenige Treffer verfehlt werden sollten. Erst in anschließenden radiometrischen Untersuchungen erfolgte eine detaillierte Durchmusterung. Dass durch diese Vorgehensweise die Mutante 1L19, die die gewünschten Eigenschaften zeigt, gefunden werden konnte, spricht für die Geeignetheit der Methode.
In der Arbeitsgruppe Marx konnte bereits mehrmals gezeigt werden, dass Bibliotheken mit einem Umfang von wenigen tausend Mutanten eine Grundlage für gerichtete Evolution von Polymerasen bieten können. Auf dieser Basis wurden mehrere DNA-Polymerasen entdeckt, die interessante Variationen im Vergleich zu ihrem Wildtyp aufweisen. Beispiele hierfür sind Mutanten der KlenTaq DNA-Polymerase mit Reverser-Transkriptase-Aktivität83 oder verbesserter Substratakzeptanz86 sowie selektivere Varianten der Taq DNA-Poly- merase85 oder des Klenow Fragments der DNA-Polymerase I aus E. coli.82 Dies lässt den Schluss zu, dass diese Art der Enzymevolution Erfolg aufweisen kann, obwohl die Anzahl der theoretisch möglichen Mutanten von der Größe der Bibliothek nicht umfasst wird.
2.6 Charakterisierung der Mutante 1L19
Mittels des Screenings, der folgenden Untersuchung der Lysate und aufgereinigten Proteine wurde aus der Mutantenbibliothek der Polß eine Variante – 1L19 - isoliert, die eine verbesserte Überlesefunktion besitzt. Diese wurde daher für eine Charakterisierung gewählt. Dies umfasste den Bypass einer stabilen abasischen Stelle, die kinetischen Untersuchungen sowie die Bestimmung der spezifischen Aktivität und der Bindungsaffinität zum Primer-Templat-Komplex. Diese Ergebnisse wurden in Vergleich gestellt zu Polßwt und der durch Di Pasquale bereits identifizierten Mutante 5P20.91 2.6.1 Überprüfung der Sequenzen und erneute Aufreinigung
Zum Ausschluss von Fehlern wurden sowohl die identifizierte Mutante 1L19 als auch Polßwt und die bereits bekannte Mutante 5P20 noch einmal aus Glycerolstocks angezogen und das isolierte Plasmid sequenziert. Dies ergab eine Übereinstimmung mit den bereits bekannten Sequenzen.
Des Weiteren erfolgte eine erneute Aufreinigung von Polßwt sowie 1L19 wie unter 5.4.3.1 beschrieben sowie die Konzentrationsbestimmung und –angleichung an 5P20 (Abb. 14).
In der Auftrennung mittels SDS-PAGE fällt auf, dass sich die Bande für die Mutante 1L19 geringfügig tiefer abbildete als die von Polßwt und 5P20.
Die Primer-Verlängerungsreaktionen zum Bypass einer stabilen abasischen Stelle unter
„Running-“ und „Standing-Start“-Bedingungen wurden anschließend wiederholt.
Abb. 14: Auftrennung mittels SDS-PAGE zur Überprüfung der Reinheit und der Konzentra- tionsangleichung der erneut aufgereinigten Polßwt und 1L19 mit 5P20. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte vorab per Bradford-Assay und wurde anschließend auch durch photometrische Messung überprüft.
2.6.2 Analyse der Sequenz
Die Sequenzierung der Mutante 1L19 ergab die aus Tab. 2 ersichtlichen Aminosäure- austausche. Diese liegen in der Proteinstruktur an den in Abb. 15 A markierten Positionen.
Die Mutation S44R vom polaren, ungeladenen Serin zum basischen Arginin liegt in einer der fünf α-Helices der Lyasedomäne der humanen DNA Polymerase ß (Abb. 15 B).55 Hierbei kommt es auch zu einer Veränderung der Größe der Aminosäure.
Die Mutation F99L befindet sich in einem Helix-Hairpin-Helix Motif in der D-Subdomäne des Proteins (HhH2 von 92-118) (Abb. 15 C). Sowohl bei Phenylalanin als auch bei Leucin handelt es sich um apolare Aminosäuren, es kommt jedoch zum Austausch einer aromatischen mit einer aliphatischen Aminosäure. Dies bedingt den Wegfall stabilisierender hydrophober Wechselwirkungen zwischen aromatischen Gruppen, was sich auf die Struktur des Proteins auswirken könnte.
Auch die Mutation E123K liegt auf einer Helix in der D-Subdomäne der DNA Polymerase ß, aber außerhalb des zuvor beschriebenen HhH2 (Abb. 15 C). Beim durch die Mutation stattfindenden Austausch wird eine anionsiche durch eine kationische Aminosäure ersetzt.
Die Mutation T233I liegt in einem ß-Turn zwischen den ß-Faltblattbereichen 3 und 4 in der C-Subdomäne (Abb. 15 D). Es findet ein Austausch des polaren, hydrophilen Threonins durch das nicht-polare, aliphatische und hydrophobe Isoleucin statt.
Abb. 15: Darstellung der mutierten Positionen in der Mutante 1L19. (A) In lila ist die Lyase- Domäne, in grau die Polymerase-Domäne dargestellt. Der Primerstrang mit 3´- Terminus ist türkis, das Downstream-Oligonukleotid dunkelblau und das Templat rot markiert. Das eintretende Nukleotid ist gelb hervorgehoben und die mutierten Positionen grün. (B) Position der Mutation S44R. (C) Positionen der Mutationen F99L und E123K. (D) Position der Mutation T233I. Für (B)-(D) sind die Farbmarkierungen identisch zu (A). PDB-Eintrag: 2FMP.
Für die zum Vergleich herangezogene, von Di Pasquale bereits charakterisierte Mutante 5P20 sind folgende Mutationen bekannt: S2G, F99L, E232K und V269M. Diese sind in der Promotionsschrift von Di Pasquale91 beschrieben und diskutiert.
2.6.3 Untersuchung der Bypass-Eigenschaften der Mutante 1L19 im Vergleich zu Polßwt und 5P20
Um die Bypass-Eigenschaften der identifizierten Mutante 1L19 über eine stabile abasische Stelle im Vergleich zu Polßwt und 5P20 zu untersuchen, wurden die aufgereinigten und in ihrer Konzentration angeglichenen Proteine (Abb. 11 A) in unterschiedliche Primer-Verlängerungsreaktionen eingesetzt.
In einem „Runnig-Start“-Experiment wurden die Bypass-Eigenschaften der Enzyme über eine stabile abasische Stelle in Anwesenheit aller vier dNTPs anhand der Verlängerung des radioaktiv markierten Primers untersucht. Dieser lagerte sich drei Nukleotide vor dem Schaden am Templatstrang an (Abb. 16 A).
Für Polßwt lässt sich aus der schwachen Bande in der Primer-Verlängerung schließen, dass nur wenig Einbau eines Nukleotids gegenüber der stabilen abasischen Stelle erfolgte. Die Synthese längerer Produkte, die auf einen Bypass der stabilen abasischen Stelle schließen lassen hätte, war nicht detektierbar. Bei Verwendung eines ungeschädigten Templats, dass ein Desoxyguanosin (G) an der Position der stabilen abasischen Stelle (F) trägt,88 wurde das Volllängenprodukt synthetisiert (Abb. 16 B).
Die beiden Mutanten, 1L19 und 5P20, zeigten ein Anhalten der Primer-Verlängerung gegenüber der stabilen abasischen Stelle. Beide zeigten im Gegensatz zu Polßwt einen Einbau gegenüber dieser sowie die Synthese längerer Produkte. Die Intensität der Banden ließ darauf schließen, dass diese Eigenschaften bei 5P20 ausgeprägter waren als bei 1L19 (Abb. 16 B).
Abb. 16: Primer-Verlängerungsreaktionen unter „Running-Start“-Bedingungen zum Vergleich der identifizierten Mutante 1L19 mit Polßwt und 5P20. (A) Ausschnitt aus der Sequenz der verwendeten Primer-Templat-Komplexe. (B) Vergleich der DNA Synthese unter Verwendung eines unbeschädigten Templat (T33G) oder eines Templats mit einer stabilen abasischen Stelle (T33FCG) sowie aller vier dNTPs. Die Reaktionen enthielten 150 nM Primer-Templat-Komplex (P20/T33G/F), 500 nM Polymerase, 200 µM dNTPs. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 30 min.
