Kinetische Untersuchungen des Einzeleinbaus bzw. Gap-Fillings modifi-

Polßwt

Zur Quantifizierung der zuvor beschriebenen Ergebnisse wurde der Einzeleinbau modifizierter und unmodifizierter TMPs unter Verwendung von Primer-Templat-Komplexen mit und ohne Downstream-Oligonukleotid mittels pre-steady-state-Kinetik (vgl. 5.5.4) untersucht. Erstere werden nachfolgend als „offene“ Primer-Templat-Komplexe, letztere als „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexe bezeichnet.

Abb. 37 B-D stellt die Abhängigkeit der Umsatzraten (kobs) beim Einbau modifizierter und unmodifizierter TMPs von der Nukleotidkonzentration unter Verwendung eines offenen Primer-Templat-Komplexes (Abb. 37 A) dar. In Abb. 37 E-F sind vergleichend die Kurven für die Umsatzraten unter Verwendung eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes gezeigt (Abb. 37 B). Die kinetischen Parameter für Polßwt, F272G und F272M sind in Tab.

6 und Tab. 7 aufgeführt.

Abb. 37: Kinetik des Einzeleinbaus bzw. Gap-Fillings von an der 4´C-Position des Zuckers modifizierten und unmodifizierten TMPs durch F272G (●/○), F272M (♦/◊) und Polßwt (■/□) unter Verwendung des offenen (A-D) und „single-gapped“ (E-H) Primer-Templat-Komplexes. Die Graphen stellen die Abhängigkeit der Umsatzraten kobs von der Nukleotidkonzentration dar. Verwendete Primer-Templat-Komplexe für die Untersuchungen ohne (A) und mit (E) Downstream-Oligonukleotid und Übersicht über die Substrate. Einzeleinbau (B) und Gap-Filling (F) von unmodifizierten TMP (T^HTP). Einzeleinbau (C) und Gap-Filling (G) von methylierter TMPs (T^MeTP).

Einzeleinbau (D) und Gap-Filling (H) ethylierter TTPs (T^EtMP). Eingesetzt wurden 200 nM aufgereinigtes Enzym, 40 nM Primer/Templat/Komplex sowie unterschied-liche Konzentrationen der Nukleotide. Reaktionszeiten zwischen 0,05 und 15 wurden

3.3.5.1 Vergleich der Kinetiken des Einbaus unmodifizierter und modifizierter TMPs durch Polßwt, F272G und F272M unter Verwendung eines offenen Primer-Templat-Komplexes

In Tab. 6 sind die kinetischen Parameter für den Einbau unmodifizierter und modifizierter TTPs unter Verwendung des offenen Primer-Templat-Komplexes P24/T36A aufgelistet.

Tab. 6: Kinetische Daten zur Untersuchung des Einzeleinbaus modifizierter und unmodifizierter TMPs durch F272G, F272M und Polßwt (wt) unter Verwendung des offenen Primer-Templat-Komplexes.

*Die Fehlerrate lag in den Messreihen unterhalb der Signifikanz.

Hieraus ist für Polßwt zu ersehen, dass das unmodifizierte Substrat mit einer Inkorporationsrate von 8,16 ± 0,48 s^-1 und einer Dissoziationskonstante von 680,2 ± 76 µM eingebaut werden konnte. Die sich daraus ergebene Effizienz von 12.000 M^-1 x s^-1 lag 340-fach höher als bei dem Einbau methylierter TMPs (35 M^-1 x s^-1).

Hierbei war die Inkorporationsrate 200-fach niedriger (0,04 ± 0,01 s^-1) und die Affinität zum Substrat um ein 2-faches gesenkt (1.144 ± 314 µM). Die Ethylierung an der 4´C-Position des Zuckers des Nukleotids wurde von Polßwt nicht toleriert. Weder eine Steigerung der Konzentration der T^EtTPs noch eine Verlängerung der Reaktionszeit führte zu einer Änderung dieses Ergebnisses.

F272G baute unmodifizierte TMPs mit einer Inkorporationsrate von 0,36 ± 0,01 s^-1 und einer Dissoziationskonstante von 135,4 ± 13,3 µM ein, was eine – verglichen mit Polßwt - 4,5-fach reduzierte Effizienz von 2.600 M^-1 x s^-1 ergab. Diese sank beim Einbau methylierter TMPs (30 M^-1 x s^-1) um das ca. 90-fache. Dies war auf die Abnahme der Inkorporationsrate (0,04 ± 0,01 s^-1) und der Substrataffinität (1.219 ± 294 µM) um das ca. 10-fache zurückzuführen. Bei Einbau der an der 4´C-Position des Zuckers ethylierten TMPs zeigte sich eine weitere Verringerung der Inkorporationsrate (0,02* s^-1), aber eine

im Vergleich zum Einbau von unmodifizierten TMPs nur 2,5-fach reduzierte Substrataffinität (331,8 ± 21,9 µM). Die daraus resultierende Effizienz von (60 M^-1 x s^-1) war verglichen mit dem Einbau unmodifizierter TMP ca. 40-fach reduziert, aber doppelt so hoch wie die des Einbaus methylierter TMPs.

F272M baute unmodifizierte TMPs mit einer Inkorporationsrate von 0,40 ± 0,02 s^-1 und einer Dissoziationskonstante von 42,4 ± 7,41 µM ein, was zu einer Effizienz von 9.400 M^-1 x s^-1 führte. Diese lag nur ca. 1,25-fach niedriger als die von Polßwt. Beim Einbau methylierter TMPs sank die Inkorporationsrate ca. 10-fach (0,05* s^-1) und die Affinität zum Substrat 1,5-fach (61,5 ± 1,73 µM). Die Effizienz der Reaktion verringerte sich um das ca. 12-fache (800 M^-1 x s^-1). Beim Einbau ethylierter TMPs zeigte sich eine vergleichbare Substrataffinität (62,5 ± 2,78 µM), während die Inkorporationsrate erneut sank (0,05* s^-1). Dies bedingte die Abnahme der Effizienz um ein 85-faches im Vergleich zum Einbau unmodifizierter TMPs und um das 8-fache verglichen mit dem Einbau methylierter TMPs.

Zusammenfassend zeigte sich, dass beide Mutanten im Vergleich zu Polßwt bei Verwendung des offenen Primer-Templat-Komplexes ethylierte TTPs prozessieren konnten. F272G zeigte hierbei eine höhere Effizienz als beim Einbau methylierter TMPs, insgesamt aber eine 2-fach geringere als F272M. Die Effizienz des Einbaus methylierter TMPs war zwischen Polßwt und F272G vergleichbar, während die von F272M deutlich höher lag. Bei der Inkorporation unmodifizierter TMPs zeigte F272G die stärkste Abweichung in der Effizienz. Auffallend war, dass die Inkorporationsraten der Mutanten in den jeweiligen Ansätzen nahezu identisch waren und sich die Veränderung in den Effizienzen nur durch die unterschiedlichen Substrataffinitäten bedingten.

3.3.5.2 Vergleich der Kinetiken des Gap-Fillings mittels unmodifizierter und modifizierter TMPs durch Polßwt, F272G und F272M bei Verwendung eines

„single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes

In Tab. 7 sind die kinetischen Parameter für das Gap-Filling durch unmodifizierte und modifizierte TMPs unter Verwendung des „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes P24/T36A/DSO11 aufgelistet.

Tab. 7: Kinetische Daten zur Untersuchung des Gap-Filling mittels modifizierter und unmodifizierter TMPs durch F272G, F272M und Polßwt (wt) unter Verwendung des

„single-gapped“Primer-Templat-Komplexes.

*Die Fehlerrate lag in den Messreihen unterhalb der Signifikanz.

Polßwt baute das unmodifizierte Substrat bei Verwendung eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes mit einer Inkorporationsrate von 17,7 ± 0,4 s^-1 und einer Dissoziationskonstante von 10,8 ± 0,9 µM ein. Die sich daraus ergebene Effizienz von 1.600 x 10³ M^-1 x s^-1 lag 1,6 x 10³-fach höher als bei dem Einbau methylierter TMPs (1.000 M^-1 x s^-1). Hierbei war die Inkorporationsrate 175-fach niedriger (0,10 ± 0,01 s^-1) und die Affinität zum Substrat um ein 10-faches gesenkt (101 ± 27 µM). Beim Gap-Filling mittels eines ethylierten TMPs lag die Inkorporationsrate erneut deutlich niedriger (0,002* s^-1), während die Substrataffinität im Vergleich zum Einbau methylierter TMPs 1,5-fach höher – insgesamt folglich 6-fach geringer lag (62,1 ± 8,2 µM). Die daraus resultierende Effizienz von 32 M^-1 x s^-1 lag 50 x 10³-fach niedriger als beim Einbau unmodifizierter TMPs und ca. 30-fach niedriger im Vergleich zum Einbau methylierter TMPs.

F272G baute unmodifizierte TMPs bei Verwendung eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes mit einer Inkorporationsrate von 0,33 ± 0,01 s^-1 und einer Dissoziations-konstante von 2,29 ± 0,4 µM ein, was eine – verglichen mit Polßwt – ca. 10-fach reduzierte - Effizienz von 140 x 10³ M^-1 x s^-1 ergab. Diese sank beim Einbau methylierter TMPs (3.100 M^-1 x s^-1) um das ca. 45-fache. Dies war auf eine Abnahme der Inkorporationsrate (0,06* s^-1) um das ca. 5-fache und der Substrataffinität (18,5 ± 1,9 µM) um das ca. 8-fache zurückzuführen. Bei Einbau der an der 4´C-Position des Zuckers ethylierten TMPs zeigte sich eine weitere Verringerung der Inkorporationsrate (0,03* s^-1), bei einer im Vergleich zum Einbau von unmodifizierten TMPs vergleichbaren Substrataffinität (2,51 ± 0,3 µM). Die daraus resultierende Effizienz von (12.000

M^-1 x s^-1) war verglichen mit dem Einbau unmodifizierter TMP ca. 11-fach reduziert, aber um ein Vierfaches höher als die des Einbaus methylierter TMPs.

F272M baute unmodifizierte TMPs mit einer Inkorporationsrate von 0,44 ± 0,02 s^-1 und einer Dissoziationskonstante von 3,83 ± 0,6 µM ein, was eine Effizienz von 110 x 10³ M^-1 x s^-1 ergab. Diese lag ca. 15-fach niedriger als die von Polßwt. Beim Einbau methylierter TMPs sank die Inkorporationsrate um das ca. 15-fache (0,03* s^-1), während sich die Affinität zum Substrat um ein 2-faches erhöhte (2,07 ± 0,3 µM). Die Effizienz der Reaktion verringerte sich um ca. ein 8-faches (14.000 M^-1 x s^-1). Beim Einbau ethylierter TMPs zeigte sich eine 2-fache Verringerung der Substrataffinität (7,28 ± 0,8 µM) im Vergleich zum Einbau von unmodifizierten TMPs bzw. eine 3,5-fache Verringerung verglichen mit der des Einbaus von methylierten TMPs. Die Inkorporationsrate sank (0,003 s^-1) erneut um ein 10-faches verglichen mit der des Einbaus methylierter TMPs.

Dies bedingte die Abnahme der Effizienz um ein ca. 270-faches im Vergleich zum Einbau unmodifizierter TMPs und um das ca. 35-fache verglichen mit dem Einbau methylierter TMPs.

Zusammenfassend zeigte sich, dass beide Mutanten im Vergleich zu Polßwt bei Verwendung des „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes die modifizierten TTPs effizienter prozessieren konnten. Unmodifizierte TTPs wurden besser von Polßwt prozessiert. F272G zeigt eine höhere Substrataffinität zu ethylierten TTPs als zu methylierten, was trotz der Abnahme der Inkorporationsrate zu einer deutlich höheren Effizienz führte. Die hierbei ermittelten Werte sind mit denen von F272M beim Einbau von methylierten TTPs vergleichbar.

3.3.5.3 Vergleich der Reaktionseffizienzen beim Einbau unmodifizierter und modifizierter TMPs durch Polßwt, F272G und F272M bei Verwendung eines offenen oder „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes

Der Vergleich der Reaktionseffizienzen beim Einbau bzw. Gap-Filling zeigte, dass in allen Fällen unter Einsatz eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes die Effizienz zunahm, jedoch unterschiedlich stark.

Bei Polßwt und F272G nahm die Verwendung des „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes den stärksten Einfluss auf die Effizienz des Einbaus ethylierter TMPs. Während dieser bei Polßwt dadurch erst möglich wurde, zeigte sich bei F272G eine 200-fache

Erhöhung der Effizienz im Vergleich zur Reaktionseffizienz bei Verwendung eines offenen Primer-Templat-Komplexes. Die 4-fache Erhöhung der Effizienz bei F272M stellte den schwächsten Einfluss im Vergleich zu der Veränderung der Reaktionseffizienzen beim Einbau von unmodifizierten oder methylierten TMPs dar. Diese waren mit Erhöhungen um das 12-fache beim Einbau von T^HMP und um das 18-fache beim Einbau von T^MeMP vergleichbar.

Auch F272G zeigte eine stärkere Erhöhung der Effizienz unter Einsatz des „single-gapped“

Primer-Templat-Komplexes beim Einbau von methylierten TMPs (103-fach) im Vergleich zu der Reaktionseffizienz beim Einbau unmodifizierten TMPs (54-fach).

Umgekehrt verhielt es sich bei Polßwt. Hier nahm die Reaktionseffizienz beim Einbau unmodifizierter TMPs unter Verwendung eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes um das 133-fache zu, während die Zunahme der Effizienz beim Einbau von methylierten TMPs nur das 29-fache betrug.

3.3.6 Kinetische Untersuchungen der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt