Zeitreihe zur Prozessierung unmodifizierter und modifizierter TTPs durch

Die Durchführung einer Zeitreihe sollte weiteren Einblick in die Prozessierung unmodifizierter und modifizierter TTPs durch die selektierten zwei Mutanten F272G und F272M geben. Zum Vergleich wurde hier nicht nur Polßwt herangezogen, sondern auch F272A. Begründet ist dies darin, dass es sich bei Alanin um die Aminosäure mit der kleinsten aliphatischen Seitenkette handelt, mit der die Aktivität der F272G-Mutante, die über keine Seitenkette verfügt, abgeglichen werden sollte. Für die Zeitreihe von 0 bis 30 min wurde der gleiche Templat-Komplex wie zuvor für die Primer-Verlängerungs-Experimente (P24/T36A, Abb. 33 A) verwendet. Die in Abb. 33 B dargestellten Ergebnisse belegen die zuvor erzielten.

F272M zeigte beim Einbau unmodifizierter TMPs nicht nur die Primer-Verlängerung um ein Nukleotid (Produkte mit einer Länge von 25 Basen), sondern auch Produkte mit einer Länge von 26 Basen. Polßwt zeigte diesen Effekt ebenfalls; allerdings waren die Banden schwächer ausgeprägt. Dies deutet auf einen nicht-kanonischen Einbau des T^HTPs gegenüber der folgenden Templatbase (C) hin. Bei den Mutanten F272G und F272A lässt sich dies nicht erkennen.

F272M zeigte für die Primerverlängerung durch modifizierte TTPs die Banden mit der höchsten Intensität. Diese ist beim Einbau von methylierten TMPs stärker als beim Einbau von ethylierten. Bei ersteren lässt sich nach 20 Minuten Vollumsatz der eingesetzten Primerkonzentration erkennen. Polßwt zeigte eine Prozessierung der methylierten TTPs, jedoch keine der ethylierten. F272A weist unter Verwendung beider modifizierter TTPs nur eine sehr geringe Prozessierung auf. Die Intensität der Banden ist auch nach dem Ablauf von 30 min schwächer als bei F272G und F272M.

F272G konnte sowohl T^MeTPs als auch T^EtTPs prozessieren. Die Intensität der Banden nahm dabei mit Verlängerung der Reaktionszeit zu. Vollumsatz des Primers konnte in beiden Fällen auch nach 30 min nicht erzielt werden. Auffällig war, dass die Intensität der 25 Basen langen Banden beim Einbau von ethylierten TMPs stärker war als die beim Einbau von methylierten. Diese Verhältnismäßigkeit wies keines der anderen Enzyme auf.

Abb. 33: Zeitreihen zum Einbau unmodifizierter und modifizierter TMPs durch F272G und F272M im Vergleich zu Polßwt und F272A. (A) Ausschnitt aus der Sequenz des verwendeten Primer-Templat-Komplexes sowie Übersicht über die eingesetzten Substrate. (B) Ergebnisse der Primer-Verlängerungsreaktion in einer Zeitreihe von 0 bis 30 min für Polßwt (wt), F272A, F272G und F272M. Die Reaktionen enthielten 40 nM Primer-Templat-Komplex (P24/T36A), 200 nM Enzym und 200 µM der jeweiligen TTPs. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C über den angegebenen Zeitraum.

Mit diesem Experiment konnte gezeigt werden, dass F272G und F272M die modifizierten TTPs besser prozessieren konnten als Polßwt und F272A. Eine Primerverlängerung konnte bei den beiden genannten Mutanten bereits nach 10 Minuten beobachtet werden.

Aufgrund dieser Ergebnisse wurde in den nachfolgenden Untersuchungen die Mutante F272A nicht mehr zum Vergleich herangezogen.

3.3.2 Genauigkeit beim nicht-kanonischen Einbau von T^HMP durch F272G, F272M und Polßwt

Zur Untersuchung der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt wurde eine Primer-Verlängerungs-Reaktion unter „Standing-Start“-Bedingungen durchgeführt, in die vier verschiedene Template eingesetzt wurden. Diese differierten im Desoxynukleosid an der Position, die dem angelagerten Primer folgte (Position 25) (Abb. 34 A). Als Substrat wurde in die Reaktion jeweils unmodifiziertes TTP eingesetzt, um den kanonischen und nicht-kanonischen Einbau unter Verwendung drei verschiedener Enzymkonzentrationen (50, 100 und 200 nM) zu untersuchen.

Aus Abb. 34 B wird deutlich, dass es sich bei F272G um die Mutante mit der höchsten Genauigkeit handelte. Auch unter Einsatz von 200 nM Enzym zeigte sie keinen nicht-kanonischen Einbau. Im nicht-kanonischen Fall wurde bereits bei Verwendung von 50 nM Enzym Vollumsatz des Primers erzielt. Es wird – auch bei steigender Enzymkonzentration – kein Produkt mit einer Länge von 26 Basen synthetisiert, was einen nicht-kanonischen Einbau von T^HMP gegenüber Desoxycytidin (C) bedingt hätte.

Für F272M war bereits unter Einsatz von 100 nM Enzym nicht-kanonischer Einbau zu erkennen. Hier zeigten sich neben den um eine Base verlängerten Primerbanden auch Banden von 26 Basen Länge mit schwacher Intensität nach dem Einbau gegenüber Desoxyguanosin (G) und Desoxythymidin (T). Vorgenannte Effekte verstärkten sich bei Anwendung von 200 nM F272M bis zum Vollumsatz des Primers. Der kanonische Einbau führte bereits unter 50 nM F272M zum Vollumsatz des Primers und zur Synthese von 26 Basen langen Produkten. Die Banden dieser Länge waren auf den Einbau von T^HMP gegenüber C im Anschluss an einen kanonischen bzw. nicht-kanonischen Einbau an Position 25 zurückzuführen.

Polßwt zeigte erst unter Einsatz von 200 nM Enzym Banden deutlicher Intensität, die auf den nicht-kanonischen Einbau von T^HMP schließen ließen. Es kam hierbei – im Gegensatz zu F272M – nicht zum Vollumsatz des Primers. Beim kanonischen Einbau von T^HMP zeigte Polßwt ebenfalls bereits bei Verwendung von 50 nM einen Vollumsatz des Primers sowie eine Bande mit einer Länge von 26 Basen. Dies verstärkte sich mit Erhöhung der Enzymkonzentration.

Abb. 34: Primer-Verlängerungsreaktionen unter „Standing-Start“-Bedingungen zur Untersuchung der Genauigkeiten von F272G, F272M im Vergleich zu Polßwt. (A) Ausschnitt aus der Sequenz des verwendeten Primer-Templat-Komplexes und Darstellung des verwendeten Substrats (T^HTP). (B) Ergebnisse der Primer-Verlängerungsreaktion zur Überprüfung der Genauigkeit unter Einsatz von drei verschiedenen Enzymkonzentrationen (50, 100 und 200 nM). Gezeigt ist der kanonische Einbau von T^HMP gegenüber Desoxyadenosin (N=A) sowie die nicht-kanonischen Einbauten gegenüber Desoxycytidin (N=C), Desoxyguanosin (N=G) und Desoxythymidin (N=T) durch Polßwt (wt), F272G und F272M. Die Reaktionen enthielten 40 nM Primer-Templat-Komplex (P24/T36N mit N=A, C, G, T), 200 nM Enzym und 200 µM der jeweiligen TTPs. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 20 min.

Zusammenfassend ergab die Untersuchung der Genauigkeit, dass F272G im Vergleich zu Polßwt eine höhere und F272M im Vergleich zu Polßwt eine geringere Genauigkeit aufwies.

3.3.3 Einbau modifizierter TMPs durch Polßwt, F272G und F272M unter Verwendung von „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexen

Für die im Anschluss durchgeführten Experimente wurde ein Templat verwendet, an das zusätzlich zum Primer ein so genanntes Downstream-Oligonukleotid (DSO) gebunden

hatte. Durch dieses 11 Nukleotide langes Oligomer entsteht - wie aus den Abb. 35 A ersichtlich – im Primer-Templat-Komplex (P24/T36A/DSO11) eine Lücke von der Größe einer Base. Nachfolgend wird dieser Primer-Templat-Komplex als „single-gapped“

benannt. Diese Form des Einzeleinbaus durch die Polymerase wird auch als „Gap-Filling“

bezeichnet.

Erste, hier nicht dargestellte Versuchsansätze mit der zuvor beim Einbau von modifizierten und nicht-modifizierten Substraten verwendeten Enzymkonzentration von 100 und 200 nM zeigten, dass von beiden Mutanten und Polßwt Vollumsatz des Primers erreicht wurde. Um eine Vergleichbarkeit zu schaffen, wurden die Primer-Verlängerungsreaktionen anschließend mit geringerer Enzymkonzentration (50 nM) sowie reduzierter Dauer (10 min) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abb. 35 dargestellt.

Abb. 35 B zeigt die Prozessierung von an der 4´C-Postition des Zuckers methylierten (T^MeTP) oder ethylierten (T^EtTP) TTPs im Vergleich zu unmodifizierten TTP (T^HTP) und einem dNTP-Mix ohne TTP als Negativkontrolle. Es ist zu erkennen, dass beide Mutanten und der Wildtyp unmodifiziertes TMP beim Vollumsatz des Primers in die Lücke einbauen konnten.

Ebenso konnte die Lücke im Primer-Templat-Komplex mit methylierten TMPs aufgefüllt werden. Auch hier war bei allen drei Enzymen unter Einsatz von 50 nM nahezu Vollumsatz des Primers zu erkennen.

Beim Gap-Filling mit ethylierten TMPs wiesen die Enzyme die größten Unterschiede auf.

Das Produkt von 25 Basen Länge des Wildtyps Polßwt zeigte eine Bande von schwacher Intensität. Das der Mutante F272G war in der Intensität der Bande mit dem durch den Einbau von methylierten TMP vergleichbar, während das Produkt der Mutante F272M eine geringere Bandenintensität im Fall des Einbaus von ethylierten TMPs zeigte.

Bei Verwendung eines dNTP-Mixes ohne TTP (Negativkontrolle) waren bei F272M und Polßwt im Gegensatz zu F272G Produkte mit einer Länge von 25-27 Basen, deren Banden nur geringe Intensität zeigten, zu erkennen.

Abb. 35: Primer-Verlängerungsreaktionen zum Gap-Filling von modifizierten TTPs unter Verwendung von „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexen. (A) Ausschnitt aus den Sequenzen der verwendeten Primer-Templat-Komplexe mit Downstream-Oligonukleotid und Darstellung der verwendeten Substrate. (B) Ergebnisse der Primer-Verlängerungsreaktion für F272G, F272M und Polßwt (wt) unter Verwendung eines dNTP-Mixes ohne TTP (-T^HTP) als Negativkontrolle, von T^HTP als Aktivitätskontrolle sowie an der 4´C-Position des Zuckers methylierter (T^MeTP) oder ethylierter (T^EtTP) TTPs. Die Reaktionen enthielten 40 nM Primer-Templat-Komplex (P24/T36A/DSO11), 50 nM Enzym und 200 µM der jeweiligen TTPs. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 10 min.

3.3.4 Überprüfung der Genauigkeit von Polßwt, F272G und F272M unter Verwendung von „single-gapped“Primer-Templat-Komplexen

Abb. 36 zeigt den kanonischen und nicht-kanonischen Einbau von T^HMP gegenüber verschiedenen Primer-Templat-Komplexen mit Downstream-Oligonukleotiden (P24/

T36N/DSO11) (Abb. 36 B). Die Primer-Verlängerungsreaktionen wurde mit einer Enzymkonzentration von 50 nM und einer Inkubationszeit von 5 min durchgeführt.

Polßwt zeigte beim kanonischen Einbau die Produktbande der stärksten Intensität, gefolgt von F272G und F272M. Die nicht-kanonischen Einbauten von F272M und Polßwt waren vergleichbar.

F272G zeigte gegenüber C und T keinen Einbau von T^HMP. Bei Vorliegen eines G ließ eine Produktbande schwacher Intensität von 25 Basen Länge auf einen nicht-kanonischen Einbau schließen.

Abb. 36: Primer-Verlängerungsreaktionen zur Überprüfung der Genauigkeit von Polßwt, F272G und F272M unter Verwendung von „single-gapped“ Komplexen. (A) Ausschnitt aus den Sequenzen der verwendeten Primer-Templat-Komplexe mit Downstream-Oligonukleotiden und Darstellung des verwendeten Substrats. (B) Ergebnisse der Primer-Verlängerungsreaktion zur Überprüfung der Genauigkeit. Gezeigt ist der kanonische Einbau von T^HMP gegenüber Desoxyadenosin (N=A) sowie die nicht-kanonischen Einbauten gegenüber Desoxycytidin (N=C), Desoxyguanosin (N=G) und Desoxythymidin (N=T) durch Polßwt (wt), F272G und F272M. Die Reaktionen enthielten 40 nM Primer-Templat-Komplex (P24/T36A/

DSO11), 50 nM Enzym und 200 µM der jeweiligen TTPs. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 5 min.

3.3.5 Kinetische Untersuchungen des Einzeleinbaus bzw. Gap-Fillings modifi-zierter und unmodifimodifi-zierter TMPs gegenüber A durch F272G, F272M und Polßwt

Zur Quantifizierung der zuvor beschriebenen Ergebnisse wurde der Einzeleinbau modifizierter und unmodifizierter TMPs unter Verwendung von Primer-Templat-Komplexen mit und ohne Downstream-Oligonukleotid mittels pre-steady-state-Kinetik (vgl. 5.5.4) untersucht. Erstere werden nachfolgend als „offene“ Primer-Templat-Komplexe, letztere als „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexe bezeichnet.

Abb. 37 B-D stellt die Abhängigkeit der Umsatzraten (kobs) beim Einbau modifizierter und unmodifizierter TMPs von der Nukleotidkonzentration unter Verwendung eines offenen Primer-Templat-Komplexes (Abb. 37 A) dar. In Abb. 37 E-F sind vergleichend die Kurven für die Umsatzraten unter Verwendung eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes gezeigt (Abb. 37 B). Die kinetischen Parameter für Polßwt, F272G und F272M sind in Tab.

6 und Tab. 7 aufgeführt.

Abb. 37: Kinetik des Einzeleinbaus bzw. Gap-Fillings von an der 4´C-Position des Zuckers modifizierten und unmodifizierten TMPs durch F272G (●/○), F272M (♦/◊) und Polßwt (■/□) unter Verwendung des offenen (A-D) und „single-gapped“ (E-H) Primer-Templat-Komplexes. Die Graphen stellen die Abhängigkeit der Umsatzraten kobs von der Nukleotidkonzentration dar. Verwendete Primer-Templat-Komplexe für die Untersuchungen ohne (A) und mit (E) Downstream-Oligonukleotid und Übersicht über die Substrate. Einzeleinbau (B) und Gap-Filling (F) von unmodifizierten TMP (T^HTP). Einzeleinbau (C) und Gap-Filling (G) von methylierter TMPs (T^MeTP).

Einzeleinbau (D) und Gap-Filling (H) ethylierter TTPs (T^EtMP). Eingesetzt wurden 200 nM aufgereinigtes Enzym, 40 nM Primer/Templat/Komplex sowie unterschied-liche Konzentrationen der Nukleotide. Reaktionszeiten zwischen 0,05 und 15 wurden

3.3.5.1 Vergleich der Kinetiken des Einbaus unmodifizierter und modifizierter TMPs durch Polßwt, F272G und F272M unter Verwendung eines offenen Primer-Templat-Komplexes

In Tab. 6 sind die kinetischen Parameter für den Einbau unmodifizierter und modifizierter TTPs unter Verwendung des offenen Primer-Templat-Komplexes P24/T36A aufgelistet.

Tab. 6: Kinetische Daten zur Untersuchung des Einzeleinbaus modifizierter und unmodifizierter TMPs durch F272G, F272M und Polßwt (wt) unter Verwendung des offenen Primer-Templat-Komplexes.

*Die Fehlerrate lag in den Messreihen unterhalb der Signifikanz.

Hieraus ist für Polßwt zu ersehen, dass das unmodifizierte Substrat mit einer Inkorporationsrate von 8,16 ± 0,48 s^-1 und einer Dissoziationskonstante von 680,2 ± 76 µM eingebaut werden konnte. Die sich daraus ergebene Effizienz von 12.000 M^-1 x s^-1 lag 340-fach höher als bei dem Einbau methylierter TMPs (35 M^-1 x s^-1).

Hierbei war die Inkorporationsrate 200-fach niedriger (0,04 ± 0,01 s^-1) und die Affinität zum Substrat um ein 2-faches gesenkt (1.144 ± 314 µM). Die Ethylierung an der 4´C-Position des Zuckers des Nukleotids wurde von Polßwt nicht toleriert. Weder eine Steigerung der Konzentration der T^EtTPs noch eine Verlängerung der Reaktionszeit führte zu einer Änderung dieses Ergebnisses.

F272G baute unmodifizierte TMPs mit einer Inkorporationsrate von 0,36 ± 0,01 s^-1 und einer Dissoziationskonstante von 135,4 ± 13,3 µM ein, was eine – verglichen mit Polßwt - 4,5-fach reduzierte Effizienz von 2.600 M^-1 x s^-1 ergab. Diese sank beim Einbau methylierter TMPs (30 M^-1 x s^-1) um das ca. 90-fache. Dies war auf die Abnahme der Inkorporationsrate (0,04 ± 0,01 s^-1) und der Substrataffinität (1.219 ± 294 µM) um das ca. 10-fache zurückzuführen. Bei Einbau der an der 4´C-Position des Zuckers ethylierten TMPs zeigte sich eine weitere Verringerung der Inkorporationsrate (0,02* s^-1), aber eine

im Vergleich zum Einbau von unmodifizierten TMPs nur 2,5-fach reduzierte Substrataffinität (331,8 ± 21,9 µM). Die daraus resultierende Effizienz von (60 M^-1 x s^-1) war verglichen mit dem Einbau unmodifizierter TMP ca. 40-fach reduziert, aber doppelt so hoch wie die des Einbaus methylierter TMPs.

F272M baute unmodifizierte TMPs mit einer Inkorporationsrate von 0,40 ± 0,02 s^-1 und einer Dissoziationskonstante von 42,4 ± 7,41 µM ein, was zu einer Effizienz von 9.400 M^-1 x s^-1 führte. Diese lag nur ca. 1,25-fach niedriger als die von Polßwt. Beim Einbau methylierter TMPs sank die Inkorporationsrate ca. 10-fach (0,05* s^-1) und die Affinität zum Substrat 1,5-fach (61,5 ± 1,73 µM). Die Effizienz der Reaktion verringerte sich um das ca. 12-fache (800 M^-1 x s^-1). Beim Einbau ethylierter TMPs zeigte sich eine vergleichbare Substrataffinität (62,5 ± 2,78 µM), während die Inkorporationsrate erneut sank (0,05* s^-1). Dies bedingte die Abnahme der Effizienz um ein 85-faches im Vergleich zum Einbau unmodifizierter TMPs und um das 8-fache verglichen mit dem Einbau methylierter TMPs.

Zusammenfassend zeigte sich, dass beide Mutanten im Vergleich zu Polßwt bei Verwendung des offenen Primer-Templat-Komplexes ethylierte TTPs prozessieren konnten. F272G zeigte hierbei eine höhere Effizienz als beim Einbau methylierter TMPs, insgesamt aber eine 2-fach geringere als F272M. Die Effizienz des Einbaus methylierter TMPs war zwischen Polßwt und F272G vergleichbar, während die von F272M deutlich höher lag. Bei der Inkorporation unmodifizierter TMPs zeigte F272G die stärkste Abweichung in der Effizienz. Auffallend war, dass die Inkorporationsraten der Mutanten in den jeweiligen Ansätzen nahezu identisch waren und sich die Veränderung in den Effizienzen nur durch die unterschiedlichen Substrataffinitäten bedingten.

3.3.5.2 Vergleich der Kinetiken des Gap-Fillings mittels unmodifizierter und modifizierter TMPs durch Polßwt, F272G und F272M bei Verwendung eines

„single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes

In Tab. 7 sind die kinetischen Parameter für das Gap-Filling durch unmodifizierte und modifizierte TMPs unter Verwendung des „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes P24/T36A/DSO11 aufgelistet.

Tab. 7: Kinetische Daten zur Untersuchung des Gap-Filling mittels modifizierter und unmodifizierter TMPs durch F272G, F272M und Polßwt (wt) unter Verwendung des

„single-gapped“Primer-Templat-Komplexes.

*Die Fehlerrate lag in den Messreihen unterhalb der Signifikanz.

Polßwt baute das unmodifizierte Substrat bei Verwendung eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes mit einer Inkorporationsrate von 17,7 ± 0,4 s^-1 und einer Dissoziationskonstante von 10,8 ± 0,9 µM ein. Die sich daraus ergebene Effizienz von 1.600 x 10³ M^-1 x s^-1 lag 1,6 x 10³-fach höher als bei dem Einbau methylierter TMPs (1.000 M^-1 x s^-1). Hierbei war die Inkorporationsrate 175-fach niedriger (0,10 ± 0,01 s^-1) und die Affinität zum Substrat um ein 10-faches gesenkt (101 ± 27 µM). Beim Gap-Filling mittels eines ethylierten TMPs lag die Inkorporationsrate erneut deutlich niedriger (0,002* s^-1), während die Substrataffinität im Vergleich zum Einbau methylierter TMPs 1,5-fach höher – insgesamt folglich 6-fach geringer lag (62,1 ± 8,2 µM). Die daraus resultierende Effizienz von 32 M^-1 x s^-1 lag 50 x 10³-fach niedriger als beim Einbau unmodifizierter TMPs und ca. 30-fach niedriger im Vergleich zum Einbau methylierter TMPs.

F272G baute unmodifizierte TMPs bei Verwendung eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes mit einer Inkorporationsrate von 0,33 ± 0,01 s^-1 und einer Dissoziations-konstante von 2,29 ± 0,4 µM ein, was eine – verglichen mit Polßwt – ca. 10-fach reduzierte - Effizienz von 140 x 10³ M^-1 x s^-1 ergab. Diese sank beim Einbau methylierter TMPs (3.100 M^-1 x s^-1) um das ca. 45-fache. Dies war auf eine Abnahme der Inkorporationsrate (0,06* s^-1) um das ca. 5-fache und der Substrataffinität (18,5 ± 1,9 µM) um das ca. 8-fache zurückzuführen. Bei Einbau der an der 4´C-Position des Zuckers ethylierten TMPs zeigte sich eine weitere Verringerung der Inkorporationsrate (0,03* s^-1), bei einer im Vergleich zum Einbau von unmodifizierten TMPs vergleichbaren Substrataffinität (2,51 ± 0,3 µM). Die daraus resultierende Effizienz von (12.000

M^-1 x s^-1) war verglichen mit dem Einbau unmodifizierter TMP ca. 11-fach reduziert, aber um ein Vierfaches höher als die des Einbaus methylierter TMPs.

F272M baute unmodifizierte TMPs mit einer Inkorporationsrate von 0,44 ± 0,02 s^-1 und einer Dissoziationskonstante von 3,83 ± 0,6 µM ein, was eine Effizienz von 110 x 10³ M^-1 x s^-1 ergab. Diese lag ca. 15-fach niedriger als die von Polßwt. Beim Einbau methylierter TMPs sank die Inkorporationsrate um das ca. 15-fache (0,03* s^-1), während sich die Affinität zum Substrat um ein 2-faches erhöhte (2,07 ± 0,3 µM). Die Effizienz der Reaktion verringerte sich um ca. ein 8-faches (14.000 M^-1 x s^-1). Beim Einbau ethylierter TMPs zeigte sich eine 2-fache Verringerung der Substrataffinität (7,28 ± 0,8 µM) im Vergleich zum Einbau von unmodifizierten TMPs bzw. eine 3,5-fache Verringerung verglichen mit der des Einbaus von methylierten TMPs. Die Inkorporationsrate sank (0,003 s^-1) erneut um ein 10-faches verglichen mit der des Einbaus methylierter TMPs.

Dies bedingte die Abnahme der Effizienz um ein ca. 270-faches im Vergleich zum Einbau unmodifizierter TMPs und um das ca. 35-fache verglichen mit dem Einbau methylierter TMPs.

Zusammenfassend zeigte sich, dass beide Mutanten im Vergleich zu Polßwt bei Verwendung des „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes die modifizierten TTPs effizienter prozessieren konnten. Unmodifizierte TTPs wurden besser von Polßwt prozessiert. F272G zeigt eine höhere Substrataffinität zu ethylierten TTPs als zu methylierten, was trotz der Abnahme der Inkorporationsrate zu einer deutlich höheren Effizienz führte. Die hierbei ermittelten Werte sind mit denen von F272M beim Einbau von methylierten TTPs vergleichbar.

3.3.5.3 Vergleich der Reaktionseffizienzen beim Einbau unmodifizierter und modifizierter TMPs durch Polßwt, F272G und F272M bei Verwendung eines offenen oder „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes

Der Vergleich der Reaktionseffizienzen beim Einbau bzw. Gap-Filling zeigte, dass in allen Fällen unter Einsatz eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes die Effizienz zunahm, jedoch unterschiedlich stark.

Bei Polßwt und F272G nahm die Verwendung des „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes den stärksten Einfluss auf die Effizienz des Einbaus ethylierter TMPs. Während dieser bei Polßwt dadurch erst möglich wurde, zeigte sich bei F272G eine 200-fache

Erhöhung der Effizienz im Vergleich zur Reaktionseffizienz bei Verwendung eines offenen Primer-Templat-Komplexes. Die 4-fache Erhöhung der Effizienz bei F272M stellte den schwächsten Einfluss im Vergleich zu der Veränderung der Reaktionseffizienzen beim Einbau von unmodifizierten oder methylierten TMPs dar. Diese waren mit Erhöhungen um das 12-fache beim Einbau von T^HMP und um das 18-fache beim Einbau von T^MeMP vergleichbar.

Auch F272G zeigte eine stärkere Erhöhung der Effizienz unter Einsatz des „single-gapped“

Primer-Templat-Komplexes beim Einbau von methylierten TMPs (103-fach) im Vergleich zu der Reaktionseffizienz beim Einbau unmodifizierten TMPs (54-fach).

Umgekehrt verhielt es sich bei Polßwt. Hier nahm die Reaktionseffizienz beim Einbau unmodifizierter TMPs unter Verwendung eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes um das 133-fache zu, während die Zunahme der Effizienz beim Einbau von methylierten TMPs nur das 29-fache betrug.

3.3.6 Kinetische Untersuchungen der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt unter Verwendung der offenen und „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexe

Zur Quantifizierung der unter 3.3.2 und 3.3.4 beschriebenen Ergebnisse der Genauigkeit von Polßwt, F272G und F272M wurde der nicht-kanonische Einbau unter Verwendung von Primer-Templat-Komplexen mit und ohne Downstream-Oligonukleotid mittels pre-steady-state-Kinetik (vgl. 5.5.4) untersucht.

Abb. 38 B-D stellt die Abhängigkeit der Umsatzraten (kobs) beim nicht-kanonischen Einbau von T^HMP unter Verwendung verschiedener offener Primer-Templat-Komplexe (Abb. 38 A) dar. In Abb. 38 E-F sind vergleichend die Kurven für die Umsatzraten unter Verwendung von „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexen gezeigt (Abb. 38 B). Die kinetischen Parameter für Polßwt, F272G und F272M sind in Tab. 8 und Tab. 9 aufgeführt.

Abb. 38: Kinetik der Genauigkeit von F272G (●/○), F272M (♦/◊) und Polßwt (■/□) unter Verwendung von offenen (A-D) und „single-gapped“(E-H) Primer-Templat-Kom-plexen. Die Graphen stellen die Abhängigkeit der Umsatzraten kobs von der Nukleotidkonzentration dar. Verwendete Primer-Templat-Komplexe für die Unter-suchungen ohne (A) und mit (E) Downstream-Oligonukleotid sowie das eingesetzt Substrat. Genauigkeit unter Verwendung des offenen Primer-Templat-Komplexes beim Einbau von T^HMPs gegenüber Desoxycytidin (N=C) (B), Desoxyguanosin (N=G) (C) und Desoxythymidin (N=T) (D). Genauigkeit unter Verwendung des „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes beim Einbau von T^HMPs gegenüber Desoxycytidin (F), Desoxyguanosin (G) und Desoxythymidin (H). Die Reaktionen enthielten 200 nM aufgereinigtes Enzym, 40 nM Primer/Templat/Komplex sowie unterschiedliche

3.3.6.1 Vergleich der Kinetiken der Genauigkeiten von F272G, F272M und Polßwt unter Verwendung der offenen Primer-Templat-Komplexe

In Tab. 8 sind die kinetischen Parameter zur Untersuchung der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt unter Verwendung der offenen Primer-Templat-Komplexe P24/T36N (N = C, G, T) aufgelistet.

Tab. 8: Kinetische Daten zur Untersuchung der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt (wt) unter Verwendung der offenen Primer-Templat-Komplexe.

Tab. 8: Kinetische Daten zur Untersuchung der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt (wt) unter Verwendung der offenen Primer-Templat-Komplexe.

Im Dokument Gerichtete Evolution der humanen DNA-Polymerase ß zur Untersuchung der Bypass-Synthese und der Wirkung sterischer Zwänge auf Funktionalität und Selektivität (Seite 70-0)