Kinetische Untersuchungen der Genauigkeit von F272G, F272M und

Primer-Templat-Komplexe

Zur Quantifizierung der unter 3.3.2 und 3.3.4 beschriebenen Ergebnisse der Genauigkeit von Polßwt, F272G und F272M wurde der nicht-kanonische Einbau unter Verwendung von Primer-Templat-Komplexen mit und ohne Downstream-Oligonukleotid mittels pre-steady-state-Kinetik (vgl. 5.5.4) untersucht.

Abb. 38 B-D stellt die Abhängigkeit der Umsatzraten (kobs) beim nicht-kanonischen Einbau von T^HMP unter Verwendung verschiedener offener Primer-Templat-Komplexe (Abb. 38 A) dar. In Abb. 38 E-F sind vergleichend die Kurven für die Umsatzraten unter Verwendung von „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexen gezeigt (Abb. 38 B). Die kinetischen Parameter für Polßwt, F272G und F272M sind in Tab. 8 und Tab. 9 aufgeführt.

Abb. 38: Kinetik der Genauigkeit von F272G (●/○), F272M (♦/◊) und Polßwt (■/□) unter Verwendung von offenen (A-D) und „single-gapped“(E-H) Primer-Templat-Kom-plexen. Die Graphen stellen die Abhängigkeit der Umsatzraten kobs von der Nukleotidkonzentration dar. Verwendete Primer-Templat-Komplexe für die Unter-suchungen ohne (A) und mit (E) Downstream-Oligonukleotid sowie das eingesetzt Substrat. Genauigkeit unter Verwendung des offenen Primer-Templat-Komplexes beim Einbau von T^HMPs gegenüber Desoxycytidin (N=C) (B), Desoxyguanosin (N=G) (C) und Desoxythymidin (N=T) (D). Genauigkeit unter Verwendung des „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes beim Einbau von T^HMPs gegenüber Desoxycytidin (F), Desoxyguanosin (G) und Desoxythymidin (H). Die Reaktionen enthielten 200 nM aufgereinigtes Enzym, 40 nM Primer/Templat/Komplex sowie unterschiedliche

3.3.6.1 Vergleich der Kinetiken der Genauigkeiten von F272G, F272M und Polßwt unter Verwendung der offenen Primer-Templat-Komplexe

In Tab. 8 sind die kinetischen Parameter zur Untersuchung der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt unter Verwendung der offenen Primer-Templat-Komplexe P24/T36N (N = C, G, T) aufgelistet.

Tab. 8: Kinetische Daten zur Untersuchung der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt (wt) unter Verwendung der offenen Primer-Templat-Komplexe.

*Die Fehlerrate lag in den Messreihen unterhalb der Signifikanz.

Für Polßwt ist hieraus zu ersehen, dass T^HMP mit stets vergleichbar geringer Inkorporationsrate und Substrataffinität gegenüber C (2 x 10^-3* s^-1 und 1.538 ± 54 µM), G (8 x 10^-3 ± 1 x 10^-3 s^-1 und 2.490 ± 269 µM) sowie T (4 x 10^-3* s^-1 und 2.160 ± 281 µM) ein-gebaut wurde. Die sich daraus berechnenden Reaktionseffizienzen lagen zwischen 1 und 3 M^-1 x s^-1.

F272G zeigte keinen nicht-kanonischen Einbau von T^HMP. Weder eine Steigerung der Konzentration des Nukleotids noch eine Verlängerung der Reaktionszeit führten zu einer Änderung dieses Ergebnisses.

Für F272M ließen sich beim Einbau gegenüber C und T vergleichbare Inkorporationsraten und Substrataffinitäten erkennen (T^HTP-C: 8 x 10^-3 ± 1 x 10^-3 s^-1 und 938,6 ± 205 µM; T^H TP-T: 7 x 10^-3* s^-1 und 912,5 ± 97,8 µM). Diese führten zu nahezu identischen Effizienzen von 9 M^-1x s^-1 und 8 M^-1x s^-1. Für den Einbau von T^HMP gegenüber G zeigte sich eine leicht erhöhte Inkorporationsrate auf 11 x 10^-3* s^-1 sowie ein Anstieg der Substrataffinität auf 721,5 ± 227 µM. Die dadurch bedingte Reaktionseffizienz von 15 M^-1 x s^-1 differenzierte nur gering von den zuvor aufgeführten.

Im Vergleich zu Polßwt fiel vor allem die Zunahme der Substrataffinitäten bei Verwendung von F272M auf. Diese waren um das 1,5- bis 3,5-fache erhöht und bedingten eine Zunahme der Effizienz um das 4- bis 9-fache. Sowohl Polßwt als auch F272M zeigten beim nicht-kanonischen Einbau von T^HMP gegenüber G die höchsten Effizienzen.

3.3.6.2 Vergleich der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt unter Verwen-dung der „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexe

In Tab. 9 sind die kinetischen Parameter zur Untersuchung der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt unter Verwendung der „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexe P24/T36N/DSO11 (N = C, G, T) aufgelistet.

Tab. 9: Kinetische Daten zur Untersuchung der Genauigkeit von F272G, F272M und Polßwt (wt) unter Verwendung der „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexe.

*Die Fehlerrate lag in den Messreihen unterhalb der Signifikanz.

Für Polßwt ist hieraus zu ersehen, dass T^HMP gegenüber C mit einer Inkorporationsrate von 44 x 10^-3 ± 2 x 10^-3 s^-1 und 521 ± 59 µM eingebaut wurde. Die daraus resultierende Effizienz lag bei 84 M^-1 x s^-1. Beim nicht-kanonischen Einbau gegenüber G stieg die Inkorporationsrate auf 77 x 10^-3 ± 4 x 10^-3 s^-1 und die Substrataffinität auf 181 ± 31 µM.

Dies bedingte eine Reaktionseffizienz von 430 M^-1 x s^-1. Der T^HMP-Einbau gegenüber T zeigte die geringste Inkorporationsrate (26 x 10^-3 ± 2 x 10^-3 s^-1)und eine Substrataffinität von 249 ± 52 µM. Die sich daraus berechnende Reaktionseffizienz lag bei 100 M^-1x s^-1. F272G zeigte bei Verwendung des Downstream-Oligonukleotids nicht-kanonisches Gap-Filling. Hierbei waren die Substrataffinitäten beim Einbau gegenüber C und G mit 885 ± 158 µM und 890 ± 139 µM nahezu identisch. Allerdings differenzierten die Inkorporationsraten um ein 2,5-faches (5 x 10^-3* und 13 x 10^-3 ± 1 x 10^-3 s^-1), was zu um denselben Faktor abweichende Reaktionseffizienzen führte (6 und 15 M^-1 x s^-1). Beim

Gap-Filling gegenüber T lag die Inkorporationsrate mit 2 x 10^-3* s^-1 am niedrigsten. Es zeigte sich jedoch eine fast doppelt so hohe Substrataffinität im Vergleich zum Einbau gegenüber den vorgenannten Desoxynukleosiden (480 ± 86 µM). Die sich daraus berechnende Reaktionseffizienz lag bei 4 M^-1x s^-1.

Für F272M ließen sich beim Einbau gegenüber C und T vergleichbare Substrataffinitäten erkennen (T^HTP-C: 352 ± 65 µM; T^HTP-T: 338 ± 79 µM), während die Inkorporationsraten leicht differenzierten (T^HTP-C: 22 x 10^-3 ± 2 x 10^-3 s^-1 und T^HTP-T: 15 x 10^-3 ± 1 x 10^-3 s^-1).

Die Reaktionseffizienzen lagen bei 63 bzw. 45 M^-1 x s^-1. Die Inkorporationsrate beim nicht-kanonischen Gap-Filling mittels T^HMP gegenüber G war mit 42 x 10^-3 ± 2 x 10^-3 s^-1 am höchsten und auch die Substrataffinität lag ca. 3-fach höher (108 ± 15 µM) als bei den zuvor beschriebenen nicht-kanonischen Einbauten. Die Effizienz dieser Reaktion lag bei 390 M^-1x s^-1.

Zusammenfassend war zu beobachten, dass unter Verwendung des „single-gapped“

Primer-Templat-Komplexes Polßwt die Reaktionen mit den höchsten Effizienzen zeigte.

Hierbei wurde T^HMP mit der höchsten Inkorporationsrate und der stärksten Substrataffinität gegenüber G eingebaut. Analog verhält es sich bei F272M. Hier erreichten die Inkorporationen nicht die Raten der Reaktionen unter Einsatz von Polßwt, während F272M teilweise eine höhere Substrataffinität aufwies. Die Effizienzen differenzierten daher höchsten um ca. das Doppelte. F272G zeigte weit geringere Inkorporationsraten als Polßwt und F272M. Auch die Substrataffinitäten waren deutlich geringer als die der beiden anderen Enzyme, was zu Reaktionseffizienzen führte, die 10- bis 25-fach geringer lagen als die der Mutante F272M und 14- bis 29-fach geringer als die des Wildtypen Polßwt.

3.3.6.3 Vergleich der Reaktionseffizienzen beim nicht-kanonischen Einbau von T^HMP durch Polßwt, F272G und F272M bei Verwendung der offenen oder

„single-gapped“ Primer-Templat-Komplexe

Der Vergleich der Reaktionseffizienzen beim nicht-kanonischen Einbau bzw. Gap-Filling zeigte, dass in allen Fällen unter Einsatz eines „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes die Effizienz zunahm.

Bei F272G nahm die Verwendung des „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes den stärksten Einfluss. Hier wurde der nicht-kanonische Einbau erst unter diesen Versuchsbedingungen möglich.

Bei Polßwt zeigte der Einsatz des „single-gapped“ Primer-Templat-Komplexes einen größeren Einfluss auf die Reaktionseffizienzen als bei F272M. Bei beiden ist der stärkste Einfluss auf die Effizienz der Inkorporation von T^HMP gegenüber G zu erkennen. Die Reaktionseffizienz verstärkte sich bei Polßwt 143-fach und bei F272M 26-fach.

Die Effizienz des nicht-kanonischen Einbaus gegenüber C wurde bei Polßwt 12-fach stärker erhöht als bei F272M (84-fach im Vergleich zu 7-fach). Auch die Effizienz des nicht-kanonischen Einbaus gegenüber T unter Einsatz von Polßwt überstieg die Effizienz der Reaktion unter Einsatz von F272M um ca. das 8-fache.