Aktivitätsuntersuchungen von DNA-Polymerasen

Für das Screening einer Mutantenbibliothek von Polß wurde mit dem Multidrop Combi von Thermo Electron Corporation 15 µl der in Tab. 35 dargestellten Reaktionsmischung in eine schwarze 384-Well-Mikrotiterplatte vorgelegt. Für das Testen der Aktivität der Mutanten wurde ein Reaktionspuffer verwendet, der Mn²⁺ als divalentes Kation enthielt (Tab. 33).

Für das Testen der Fähigkeit, eine abasische Stelle zu überlesen, wurde der Mg²⁺-Puffer verwendet, dessen Zusammensetzung sich aus Tab. 35ergibt.

Tab. 32: Zusammensetzung der Reaktionsmischung für das Screening der Polß-Mutantenbibliothek.

Mit Hilfe des Pipettierroboters (Hamilton Robotics) wurden anschließend 5 µl der auf 4 °C gekühlten Lysatlösung aus der 96-Wellplatte (5.4.2) hinzugefügt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C wurde die in SybrGreenI enthaltende Stopplösung (Tab. 34) mittels Multidrop Combi hinzugefügt. Der Farbstoff bindet in die kleinen Furchen der DNA und erfährt hierbei eine Fluoreszenzverstärkung bei 485 nm Anregung und 520 nm Emission.

Dies diente zur Endpunktquantifizierung der durch die Reaktion gebildeten dsDNA. Die Platten wurden nach Zugabe sofort mit Licht undurchlässiger Folie verschlossen und die in den Wells befindlichen Lösungen durch kurzes Vortexes vermengt. Anschließend erfolgte das Auslesen der Platten im Fluoreszenreader (Polarstern, BMG) bei vorgenannter Anregungs- Emissionswellenlänge.

Das Screening der Mutanten erfolgte in mehreren Durchgängen mit unterschiedlichen Primer/Templat-Komplexen, wie sich aus 7.2.1 ergibt.

Die Auswertung der erhaltenden Rohdaten erfolgte in Microsoft Excel. Zur Korrektur von Schwankungen in der SybrGreenI-Fluoreszenz zwischen den verschiedenen Platten wurde bei allen Werten einer Platte der gemittelte Wert der der Negativkontrollen (inaktive D256A Polß-Mutante) als Background abgezogen. Der Mittelwert der auf der Platte befindlichen Positivkontrollen (Polß-Wildtyp) wurde gemittelt und als Richtwert 1 gesetzt.

Im ersten Screening wurde die Aktivität der Mutanten getestet. Es wurden die Mutanten gewählt, die mindestens 80 % dieses Richtwertes erreichten. Diese wurden mit Hilfe des Pipettierrobotors zur Anzucht in frische Plattenkulturen überimpft. Im zweiten Screening wurde nur die Fähigkeit der Mutanten, eine abasische Stelle zu überlesen, mit der des Wildtypes verglichen. Es wurden nur die Mutanten ausgewählt, die den Richtwert überschritten. Es erfolgte wiederum das Anlegen einer frischen Plattenkultur mit den ausgewählten Mutanten. Im dritten Screening wurde vergleichend mit zwei Primer/Templat-Komplexen gearbeitet. Der erste enthielt eine abasische Stelle und hatte eine Länge von 56 Basenpaaren, der zweite enthielt insgesamt drei abasische Stellen und

umfasste 90 Basenpaare. Es wurden die Mutanten ausgewählt, die in beiden Ansätzen den Richtwert überschritten. Diese Mutanten wurden in eine neue Plattenkultur überführt. Mit den Lysaten wurden Primer-Verlängerungsreaktionen wie unter 5.5.1 beschrieben durchgeführt und über Polyacrylamidgelelektrophorese 5.1.3) ausgewertet.

5.5.1 Primer-Verlängerungsreaktionen mit radiometrischer Produktanalyse

Templat und 5´-³²P-markierte Primeroligodesoxynukleotide wurden im Verhältnis 1,3:1 in 1x Mg²⁺-Reaktionspuffer 5 min bei 95 °C denatuiert und dann mindestens 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde die DNA-Polymerase hinzugefügt, die Reaktionsmischung 3 min auf 37 °C inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von dNTPs gestartet. Nach Ablauf der angestrebten Zeit wurde die Reaktion durch Zugabe von PAGE-Ladepuffer (Tab. 12) gestoppt und das Produktgemisch durch Polyacryl-amidgelelektrophorese (5.1.3) analysiert. Die in 1x Mg²⁺-Reaktionspuffer durchgeführten Reaktionen differenzierten in der Primer/Templat-Zusammensetzung und – Konzentration. Gleiches gilt für die verwendeten dNTPs und Polymerasen. Angaben hierzu finden sich in den Abbildungslegenden.

Bei zusätzlicher Verwendung eines am 5´-Ende phosphorylierten Primeroligodesoxy-nukleotide (Downstream-Oligonukleotid, DSO) wurden mit dem Templat und dem 5´-³² P-markierte Primeroligodesoxynukleotide im Verhältnis 1:1:1 gearbeitet.

Tab. 35: Zusammensetzung des 1x Mg²⁺-Rekationspuffers.

Reagenz Konzentration

Tris HCl, pH 8,0 50 mM

KCl 20 mM

NaCl 20 mM

MgCl2 10 mM

DTT 2 mM

Glycerol 1 % (v/v)

BSA 200 µg/ml

5.5.2 Bestimmung der spezifischen Aktivität von Polß

Radiometrische Primerverlängerungsreaktionen wurden mit 15 verschiedenen Konzentrationen der Polß in der aus Tab. 36 ersichtlichen Zusammensetzung durchgeführt.

_n

Eingebaute dNTPs =

∑

(Intensität Bande*Umrechnungsfaktor P*eingesetzte Menge an Primer) P=1

Tab. 36: Zusammensetzung der Reaktionsmischung für die Bestimmung der spezifischen Aktivität.

Reagenz Konzentration

Nach 10-minütiger Inkubation bei 37 °C wurden die Reaktionen gestoppt, 5 min bei 95 °C denaturiert und mittels PAGE analysiert. Die Intensität jeder Bande einer Bahn wurde auf die tatsächliche Menge an eingebauten dNTPs umgerechnet und addiert. Hierbei wurde folgende Formel angewendet:

N stellt hierbei die Anzahl an dNTPs, die in der entsprechenden Bande eingebaut wurde, dar. Die Menge der eingebauten dNTPs einer Bahn wurde durch die entsprechende Enzymmenge und die Reaktionszeit geteilt. Der erhaltende Umsatz wurde anschließend gegen die entsprechende Enzymmenge aufgetragen und mit einer linearen Gleichung mit Hilfe des Programms GraphPad4 ausgewertet. Die Steigung der Geraden stellt die spezifische Aktivität dar.

5.5.3 Untersuchung der Affinität der Polß zum Primer/Templat-Komplex

Die Bindungsaffinität wurde mit Hilfe einer sogenannten Gelretardationsanalyse (Gel Mobility Shift Assays)¹⁵⁷ gemessen. Der radioaktiv markierte Primer P23 wurde an verschiedene Template (T33GCG oder T33F) in 1,3-fachem Überschuss an Templat annealt.

Dieser Komplex wurde anschließend zu einer Konzentration von 0,1 nM in Bindungspuffer (Tab. 37) verdünnt und zu einer Konzentrationsreihe der Polß (0,125 nM bis 5 µM)

Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 20 °C wurden die Proben auf ein 8 %iges natives Polyacrylamidgel geladen (Tab. 38), welches bei 300 V 1 h bei 4 °C unter Verwendung von 1x TBE Mg²⁺-Laufpuffer (Tab. 39) vorgelaufen war. Im Anschluss an das zügige Beladen mit der Multikanalpipette wurde die Spannung auf 150 V reduziert und das Gel bei 4 °C für 1,5 laufen gelassen.

Tab. 38: Ansatz für ein natives Polyacrylamidgel (12 cm Länge, 1,5 mm Dicke).

Reagenz Volumen

10x TBE Mg²⁺-Puffer 10 ml

40°% (29:1) Acrylamid 20 ml

APS 800 µ

TEMED 40 µl

H2O 70ml

Tab. 39: Zusammensetzung des 1x TBE Mg²⁺-Laufpuffers.

Reagenz Konzentration

Tris 50 mM

Borsäure 50 mM

EDTA 0,1 mM

MgCl2 2 mM

Die Quantifizierung der gebundenen Fraktionen erfolgte mittels Phosphorimagerscreen (BioRad) unter Verwendung des Programms Quantity One (BioRad). Die Werte wurden anschließend gegen die jeweiligen Enzymkonzentrationen aufgetragen und die Kurve mit der Gleichung

Y=(m1*X)/(Kd+X)+c

ausgewertet. Hierbei stellt X die Enzymkonzentration, Y die Fraktion von gebundener Polymerase und Kd die Dissoziationskonstante dar. Bei m1 handelt es sich um einen Normierungsfaktor und c stellt das scheinbare Minimum von Y dar.¹⁵⁸

5.5.4 Pre-steady-state kinetische Untersuchungen

Um die Effizienz einer Reaktionen zu untersuchen, wurden pre-steady-state Kinetiken gemessen. Diese Methode beruht darauf, die Geschwindigkeit der Reaktion und die Affinität der DNA-Polymerase zu messen, bevor ein steady-state Gleichgewicht erreicht ist. Hierfür wurde eine Rapid-Quench-Flow Apparatur (RQF-3, KinTek Corp.) verwendet, die

die Messung kurzer Reaktionszeiten – ab 2 ms – ermöglicht. Ab einer Reaktionszeit von 30 s wurden identische Reaktionen von Hand durchgeführt.

Für die Reaktion wurden Enzym, Primer/Templat-Komplex sowie das entsprechende dNTP in 1x Mg²⁺-Reaktionspuffer verdünnt. Erstere wurden mit einem fünf- bzw. zehnfach Überschuss an Enzym (genaue Konzentrationen finden sich in der jeweiligen Abbildungslegende) im Reaktionspuffer (Tab. 35) aufgenommen. 15 µl dieser Lösung sowie 15 µl der jeweiligen dNTP Konzentration wurden im entsprechenden Loop des Gerätes schnell miteinander vermischt und die dadurch Reaktion gestartet. Die Reaktionstemperatur wurde mit Hilfe eines Wasserbades konstant auf 37 °C gehalten. Die Reaktionszeit wurde durch die Länge des Schlauches des Reaktionsloops sowie durch die Fließgeschwindigkeit automatisch gesteuert. Nach der gewählten Zeit traf die Quenchlösung (0,5 M EDTA) auf die Reaktion, die dadurch abgestoppt wurde. Es wurden unterschiedliche Zeitreihen mit verschiedenen dNTP-Konzentrationen gemessen. Auch diese Angaben finden sich in der Legende zu den entsprechenden Abbildungen.

Die Reaktionsprodukte wurden über denaturierende PAGE aufgetrennt und mit dem Phosphorimager (BioRad) ausgewertet. Der Anteil an verlängertem Primer wurde hierbei mit der Biorad Quantity One Software bestimmt. Die aus den Zeitreihen erhaltenen Daten wurden gegen die dazugehörige Reaktionszeit aufgetragen und mit einer einfach exponentiellen Gleichung

Y = Ymax*(1-exp(kobs*t))

mit dem Programm GraphPad4 ausgewertet. Y stellt hierbei den Umsatz, t die Zeit dar. Die aus dieser Auswertung erhaltenen Umsatzraten k_obs wurden dann gegen die dNTP-Konzentration aufgetragen und mit der hyperbolischen Gleichung

k_{ob s}= kpol*X/(Kd+X)

ausgewertet (GraphPad4). Hierbei steht X für die dNTP-Konzentration, kpol für die maximale Reaktionsgeschwindigkeit und Kd für die Dissoziationskonstante des eingesetzten dNTP zum Primer/Templat/Enzym-Komplex. Die Inkorporationseffizienz errechnete sich aus kpol/Kd. Alle Daten stammen aus Doppel- und Dreifachbestimmungen.

Im Dokument Gerichtete Evolution der humanen DNA-Polymerase ß zur Untersuchung der Bypass-Synthese und der Wirkung sterischer Zwänge auf Funktionalität und Selektivität (Seite 118-124)