Expression und Reinigung von Polß

5.4.1.1 Expression in Plattenkultur

Zur Herstellung der Mutantenbibliothek von Polßwt wurden einzelne Klone in 150 µl LB-Medium mit 100 µg/ml Carbenicillin in 384-Deepwellplatten unter Verwendung von sterilen Zahnstochern gepickt. Die Kultivierung erfolgte bei 37 °C und 1000 rpm. Vor Lagerung auf -80 °C wurde die Platte mit Glycerol überschichtet und 5 min bei 1000 rpm geschüttelt. Zur Expression in 1 ml LB-Medium (+100 µg/ml Carbenicillin) wurden die

Einzelklone aus der 384-Deepwellplatte in 2,2 ml-96-Deepwellplatten überführt. Die Platten wurden zur Inkubation mit Airpore Tape Sheets verschlossen und bei 1000 rpm geschüttelt. Die Expression wurde bei einer OD600 zwischen 0,6 und 08 mit 1 mM IPTG induziert. Nach 4 h wurden die Platten bei 4000 rpm abzentrifugiert und die Pellets bei -80 °C gelagert.

5.4.1.2 Expression in Flüssigkultur

Die Expression von Polß im PGDR11_Polßwt-Vektor erfolgte in E. coli XL10gold als Expressionsstamm. Es wurden Übernachtkulturen (LB-Medium, 100 µg/ml Carbenicillin) von einzelnen Kolonien hergestellt. Diese wurden am darauf folgenden Tag 20-fach in frisches LB-Medium mit dem entsprechendem Antibiotikum verdünnt und bis zur OD600

zwischen 0,6 und 0,8 bei 37 °C unter Schütteln bei 200 rpm inkubiert. Die Expression wurde durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Nach 4 h Inkubation bei 37 °C und 200 rpm wurde die Kultur durch Zentrifugation (4000 rpm, 4 °C) pelletiert und auf -20 °C gelagert.

5.4.2 Lyse von Plattenexpressionskulturen

Die 96-Deepwellplatte wurde auf Eis aufgetaut. Mit Hilfe des Multidrop Combi von Thermo Electron Corporation wurden pro well 300 µl Lysepuffer (Tab. 24) zugegeben.

Tab. 24: Zusammensetzung der Lysepuffers.

Reagenz Konzentration

Tris HCl, pH 8,0 50 mM

NaCl 400 mM

Lysozym 0,1 mg/ml

Nach Abdichten der 96-Deepwellplatte mit einer wasserdichten Folie erfolgte das Resuspendieren der Pellets durch Vortexen und die anschließende 45-minütige Inkubation im Kühlschrank. Nach Zugabe von 900 µl Lagerpuffer (Tab. 25) mithilfe des Multidrop Combi wurden die Platten erneut 45 min bei 4 °C inkubiert und anschließend 45 min bei 4000 rpm zentrifugiert.

Tab. 25: Zusammensetzung der Lagerpuffers.

Das nach der Expression (5.4.1.2) erhaltende Pellet wurde auf Eis aufgetaut und sodann in 25 ml Waschpuffer 1 sowie 0,1 mg/ml Lysozym und 1 mM PmSF resuspendiert und 1 h auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte die dreimalige Sonifikation für jeweils 30 s.

Zwischen den Sonifikationsschritten wurde die Probe jeweils 30 s auf eis gehalten.

Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugation (20.000 rpm, 40 min, 4 °C) entfernt und das N-terminal His-getaggte Protein aus dem erhaltenen Überstand durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie bei 4 °C aufgereinigt.

5.4.3.1 Verwendung von mit Nickel-Ionen beladene Chelating Sepharose^TM Fast Flow Matrix

Hierzu wurde zunächst die mit Nickel-Ionen beladene Chelating Sepharose^TM Fast Flow Matrix (GE Helathcare) mit Ni-NTA-Puffer, der 5 mM Imidazol enthielt, äquilibriert.

Anschließend wurde der Überstand der Zentrifugation zugegeben und für 1 h bei 4 °C im Überkopfschüttler inkubiert. Die Lösung wurde über eine zuvor mit Waschpuffer 1 äquilibrierte Fritte in einer 20 ml Spritze gegeben und der Durchfluss in einem Falcon aufgefangen. Nach dreimaligem Waschen der Matrix (Waschpuffer 1-3, Tab. 26) erfolgte die Elution des Proteins mit Elutionspuffer 1-3 (Tab. 26). Alle Durchläufe wurden separat in Falcons aufgefangen.

Tab. 26: Zusammensetzung der Wasch- und Elutionspuffer.

Reagenz Konzentration Konzentration

Reagenz Konzentration Konzentration

Elutionspuffer 2 Ni-NTA-Puffer 1x

Imidazol 200 mM

Elutionspuffer 3 Ni-NTA-Puffer 1x

Imidazol 500 mM

Von den Wasch- und Elutionsfraktionen wurden je 20 µl zur Analyse mittels SDS-PAGE entnommen. Die sauberen Elutionsfraktionen wurden gepoolt, zweimal in 2 l 2x Lagerpuffer bei 4 °C für mindestens 2 h dialysiert und über einen Vivaspin Zentrifugalkonzentrator (Vivaspin 20, 10000 MWCO PES, Sartorius Stedim) in 2x Lagerpuffer (Tab. 25) aufkonzentriert. Nach Zugabe eines Volumens 100% Glycerol wurde die Proteinlösung bei -20 °C gelagert. Die Konzentration der aufgereinigten Enzyme wurde mittels Bradford-Assay bestimmt.

5.4.3.2 Verwendung der Ni-NTA Spin Columns (Qiagen)

Die Aufreinigung im Anschluss an die Sonifikation orientierte sich an dem Protokoll

„Protein Purification under Native Conditions From E. coli Lysates“ aus dem Ni-NTA Spin Kit Handbuch (Qiagen). Die im Protokoll vorgesehenen Standardpuffer wurden gegen die in 5.4.3.1, Tab. 26 aufgeführten Puffer ausgetauscht und die entsprechenden Wasch- und Elutionsschritte hinzugefügt. Die Kontrolle der Aufreinigung sowie die Aufkonzentrierung und Lagerung erfolgte wie zuvor beschrieben.

5.4.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Zur Vorbereitung der Proteinproben für eine diskontinuierliche Auftrennung in einem SDS-Polyacrylamidgel (SDS-PA) wurden die Proteinproben mit SDS-Ladepuffer (Tab. 27) versetzt, bei 95 °C hitzedenaturiert und anschließend aufgetragen.

Tab. 27: Zusammensetzung des Glycin-SDS-Ladepuffers.

Reagenz Konzentration

Tris HCl, pH 6.8 50 mM

SDS 2 % (w/v)

Glycerin 10 % (w/v)

ß-Mercaptoethanol 1 % (v/v)

Bromphenolblau 0,05 % (w/v)

Die Proteintrennung erfolgte in SDS-PA Laufpuffer (Tab. 28) bei einer Stromstärke von 35 mA über einen Zeitraum von ca. 45 min. Bei den eingesetzten SDS-PA handelte es sich ausschließlich um 12 °%ige Gele mit der aus (Tab. 29) ersichtlichen Zusammensetzung.

Tab. 28: Zusammensetzung des Glycin-SDS-Laufpuffers.

Die SDS-PA wurden durch Inkubation in Coomassie-Färbelösung (Tab. 30) angefärbt und anschließend so lange in Entfärbelösung (Tab. 31) geschwenkt, bis ein ausreichender Kontrast zwischen Proteinbanden und Hintergrund erreicht war. Mit einem Molecular Imager ChemiDoc XRS Sysstem (BioRad) wurden die Gele dokumentiert.

Tab. 30: Zusammensetzung der Coomassie-Färbelösung (Endvolumen 100 ml)

Reagenz Konzentration

Coomassie Brilliant Blue R250

(Roth) 20 ml

Methanol 20 ml

H2O 60 ml

Tab. 31: Zusammensetzung der Entfärbelösung für Coomassiefärbungen (Endvolumen 100 ml)

Reagenz Konzentration

Methanol 20 ml

H2O 80 ml

5.4.6 Proteinquantifizierung mittels Bradford-Test

Nach Reinheitskontrolle der aufgereinigten Proteine durch SDS-Page und Coomassie-Färbung wurden die erhaltenen Proteinmengen mittels Bradford-Test quantifiziert. Dieser

beruht auf der Eigenschaft des Farbstoffs Coomassie-Brillant-Blau G250, in saurer Lösung sowohl mit den kationischen als auch mit den nichtpolaren, hydrophoben Seitenketten der Proteine Komplexe zu bilden. Das Absorptionsspektrum der ungebundenen (kationischen), rot gefärbten Form liegt bei 470 nm. Durch die Komplexbildung mit Proteinen wird der Farbstoff in seiner blauen, unprotonierten, anionischen Sulfatform stabilisiert und das Absorptionsspektrum verschiebt sich auf ein Maximum bei 595 nm.

Zur Quantifizierung wurde eine 1x Lösung des Farbstoffs im Verdünnungspuffer hergestellt und damit eine Verdünnungsreihe von BSA als Standard erstellt. Zu untersuchende Proteine wurden ebenfalls in verschiedenen Konzentrationen in 1x Lösung verdünnt. Von allen Lösungen wurde 1 ml in eine Küvette überführt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde am UV-Visible Spectrophotometer Cary 100 Bio (Varian) die OD595 gemessen. Durch Erstellen einer Eichkurve der BSA-Standardreihe konnten die unbekannten Proteinkonzentrationen ermittelt werden.