Entwicklung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen CD-Moleküle beim Hund

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Entwicklung und Charakterisierung von

monoklonalen Antikörpern gegen CD-Moleküle beim Hund

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Rita Gisela Weber geb. Schlegel aus Marburg

Hannover 2001

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1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. W. Leibold 2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. R. Mischke

Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2001

Die Arbeit wurde freundlicherweise gefördert von der Hans-Böckler-Stiftung, Düsseldorf

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2. Literaturübersicht ... 13

2.1 Antigene und antigenspezifische Rezeptoren ... 13

2.2 Antikörper ... 14

2.2.1 Aufbau der variablen Region ... 15

2.2.2 Aufbau der konstanten Region ... 16

2.2.3 Isotyp, Allotyp, Idiotyp ... 17

2.2.4 Der B-Zell-Antigenrezeptor-Komplex ... 17

2.2.5 Funktionen der sezernierten Antikörper ... 18

2.3 Monoklonale Antikörper ... 19

2.3.1 Eigenschaften und Bedeutung von monoklonalen Antikörpern ... 19

2.4 Zelloberflächenmoleküle (CD-Moleküle) ... 20

2.4.1 Definition und Nomenklatur ... 20

2.4.2 Eigenschaften und Funktionen von CD-Molekülen ... 22

2.4.3 Expression von CD-Molekülen auf Zellen ... 25

2.4.3.1 Mitogene Stimulation von Lymphozyten ... 26

2.4.4 Aktivierungsantigene ... 26

2.5 Canine CD-Moleküle ... 31

2.5.1 Besonderheiten der Expression von CD-Molekülen beim Hund ... 31

2.5.2 Für canine Leukozytenantigene spezifische monoklonale Antikörper 31 2.5.3 Kreuzreaktive monoklonale Antikörper ... 34

3. Material, Tiere und Methoden ... 37

3.1 Geräte und Materialien ... 37

3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf ... 37

3.1.2 Reagenzien ... 41

3.1.3 Antikörper und Konjugate ... 45

3.1.4 Puffer, Lösungen und Medien ... 46

3.1.4.1 Puffer und Lösungen ... 46

3.1.4.2 Zellkulturmedien ... 48

3.1.5 Materialien für die Separation und Vitalitätsbestimmung von Zellen . 49 3.1.6 Materialien für den Standard- und Isotypen- Enzym-linked-immunosorbent-assay (ELISA) ... 49

3.1.7 Materialien für die Membranimmunfluoreszenz ... 50

3.1.8 Materialien für die SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese ... 51

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3.1.11 Material für die Immunpräzipitation mit Dynabeads Protein A ... 54

3.1.12 Probanden ... 54

3.2 Methoden ... 55

3.2.1 Isolierung caniner Leukozyten aus dem peripheren Blut ... 55

3.2.2 Gewinnung von Thrombozyten und Erythrozyten aus dem peripheren Blut ... 56

3.2.3 Bestimmung der Zellzahl ... 57

3.2.4 Lymphozytenstimulation ... 58

3.2.5 Immunisierung von Mäusen zur Gewinnung von Antikörperproduzierenden Zellen ... 59

3.2.6 Auftauen und Kultivieren der Myelomzellen ... 60

3.2.7 Zellfusion ... 61

3.2.8 Gewinnung von Kolonien nach der Fusion ... 63

3.2.9 Zellkultur ... 63

3.2.10 Einfrieren der Zellen ... 64

3.2.11 Auftauen der Zellen ... 65

3.2.12 Prüfung der Hybridomzellkulturen auf die Produktion spezifischer Immunglobuline ... 65

3.2.12.1 Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay (ELISA) ... 65

3.2.12.1.1 Optimierung des Substrats 3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine an die gegebenen Puffersysteme ... 65

3.2.12.1.2 Asymmetrischer Standard-ELISA ... 67

3.2.12.2 Durchflußzytometrie ... 68

3.2.12.3 Indirekte Membranimmunfluoreszenz ... 69

3.2.13 Klonieren der Zellen ... 70

3.2.14 Isotyp-ELISA ... 71

3.2.15 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese ... 72

3.2.15.1 Färbung des SDS-Gels mit Coomassie blau ... 73

3.2.16 Gewinnung fragmentierter Zellmembranteile mittels Triton X-Lyse und Acetonfällung ... 74

3.2.17 Immunoblot ... 76

3.2.18 Immunopräzipitation mit Dynabeads Protein A ... 77

3.2.19 Biotinylierung von Zellkulturüberständen ... 79

3.2.20 Indirekte Membranimmunfluoreszenz mit zwei Probenantikörpern (Doppelfärbung) ... 80

3.2.21 Indirekte Membranimmunfluoreszenz mit Co-capping und Doppelmarkierung von Zellen ... 82

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4.2.1 Kontrolle des Immunisierungserfolges ... 87

4.2.2 Auswahl geeigneter Zellkulturen ... 89

4.3 Charakterisierung der gewonnenen monoklonalen Antikörper ... 90

4.3.1 Bestimmung des Isotyps der monoklonalen Antikörper ... 90

4.3.2 Reaktivität der monoklonalen Antikörper ... 91

4.3.2.1 Reaktivität auf ruhenden canine Leukozyten ... 91

4.3.3 Reaktivität auf in vitro mit Concanavalin A stimulierten mononukleären Zellen ... 96

4.3.4 Reaktivität auf Thrombozyten und Erythrozyten ... 105

4.3.5 Bestimmung der prozentualen Anteile der von den neu entwickelten monoklonalen Antikörpern erkannten Zellen ... 110

4.3.6 Vergleich der neu entwickelten monokonalen Antikörper mit bekannten monoklonalen Antikörpern auf ihre Reaktivität gegen canine Leukozyten ... 114

4.3.7 Vergleich der neu entwickelten monoklonalen Antikörper mit bekannten monoklonalen Antikörpern auf ihre Reaktivität gegen ConA aktivierte mononukleäre Zellen ... 126

4.3.8 Vergleich der neu entwickelten monokonalen Antikörper mit bekannten monoklonalen Antikörpern auf ihre Reaktivität gegen Thrombozyten ... 137

4.3.9 Vergleich der prozentualen Anteile und mittleren Fluoreszenz- intensität von neu entwickelten und bekannten mAk in der indirekten Membran-immunfluoreszenz erkannter Zellen ... 139

4.3.10 Vergleich des Bindungsverhaltens der neu entwickelten mit bekannten monoklonalen Antikörpern mittels der Doppelmarkierung ... 146

4.3.10.1 Vergleich des Bindungsverhaltens der neu entwickelten mit bekannten monoklonalen Antikörpern mit Hilfe der Doppel- färbung in der Membranimmunfluoreszenz ... 146

4.3.10.2 Vergleich des Bindungsverhaltens der neu entwickelten mit bekannten monoklonalen Antikörpern mit Hilfe der Doppel- färbung nach Co-Capping ... 154

4.3.11 Bestimmung des Molekulargewichts des erkannten Moleküls ... 155

4.3.11.1 Bestimmung des Molekulargewichts mit Hilfe eines SDS-Gels und Immunoblots ... 155

4.3.11.2 Bestimmung des Molekulargewichts mit Hilfe von Protein A Dynabeads® ... 158

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5.2 Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 2A3 ... 163

5.3 Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 2B5 ... 166

5.4 Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 3C2 ... 167

5.5 Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 4A6 ... 168

5.6 Ausblick ... 169

6. Zusammenfassung ... 170

7. Summary ... 171

8. Literaturverzeichnis: ... 172

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µ mikro (x10^-6)

µl Mikroliter

A. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)

A. tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser)

Abb. Abbildung

AIM activation inducer molecule

BSA bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

ca canin(e)

caCD canine cluster of differentiation (Bezeichnung für canine Homologe zu humanen Lymphozytendifferenzierungsantigenen mit CD-

Nomenklatur)

caIg canines Immunglobulin

CD cluster of differentiation (System zur Bezeichnung humaner Lymphozytendifferenzierungsantigene)

ConA Concanavalin A

d.h. das heißt

DMSO Dimethylsulfoxid

ELISA Enzym-linked immunosorbent assay (Enzym-gekoppelter Immu- nadsorptionstest)

FITC Fluoreszeinisothiocyanat FKS Fetales Kälberserum

FL1,2,3 Meßkanäle des Durchflußzytometers für emittierte Fluoreszenz (s. 3.2.12.2)

FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht)

g Gramm

gp Glykoprotein

I.U. international unit (internationale Einheit)

IFN Interferon

(10)

kD Kilodalton (10³ Dalton)

l Liter

LFA-1 Leukozytenfunktions-Antigen-1

m milli

mAk monoklonale(r) Antikörper

MHC major histocompatibility complex (Haupthistokomatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz

min Minute

ml Milliliter

PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)

PJ Propidiumjodid

RT Raumtemperatur

s. siehe

s.o. siehe oben

SDS Sodiumdodecylsulfat (Natriumdodecylsulfat)

sog. sogenannte(r)

SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht)

Tab. Tabelle

TMB Tetramethylbenzidine

TNF Tumornekrosefaktor

u.a. unter anderem

well Vertiefung einer Mikrotiterplatte

z.B. zum Beispiel

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1. Einleitung und Zielsetzung

Antikörper sind spezifische Moleküle, die von B-Lymphozyten gebildet werden und dort den spezifischen Teil des Antigen-Rezeptor-Komplexes ausmachen. Durch den Kontakt des B-Zell-Antigenrezeptors mit einem passenden Antigen wird der ruhende B-Lymphozyt aktiviert und differenziert in verschiedenen Phasen und unter mehreren Einflüssen, insbesondere von T-Zellen, zur Antikörper produzierenden Plasmazelle.

Diese geben die ursprünglich membranständigen Antikörper in unterschiedlichen For- men (Isotypen) aber identischer Spezifität als freie Antikörper ab (BURMESTER u.

PEZZUTTO 1998).

Freie Antikörper haben im wesentlichen zwei unterschiedliche Funktionen. Sie über- nehmen zum einen spezifische Erkennungsfunktionen, wobei der Antikörper an sein passendes Antigen bindet, und zum anderen bestimmte Vermittlungsfunktionen, wo- durch anderen Zellen oder Molekülen ermöglicht wird, Antigene zu eliminieren (JANE- WAY u. TRAVERS 1997).

In vivo findet man ein breites Spektrum an Antikörpern im Serum und anderen Kör- perflüssigkeiten. Um die Spezifität von Antikörpern gegen die von ihnen erkannten Epi- tope in vitro besser erforschen aber auch nutzen zu können, ist es sinnvoll, den einzelnen Antikörper zu untersuchen. Dabei ist von entscheidender Hilfe, daß eine B- Zelle bzw. Plasmazelle nur Antikörper einer einzigen Spezifität (identischer variabler Region) produziert. Somit produzieren auch alle Nachkommen einer Zelle (ein Zell- klon) Antikörper identischer Spezifität, also monoklonale Antikörper (mAk).

Durch die von Cesar Milstein und Georges Köhler etablierte Hybridomtechnik zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist es gelungen, antikörperproduzierende Zellen mit Myelomzellen zu fusionieren und durch Klonierung unsterbliche, nur einen Antikörper produzierende Zellen zu isolieren und durch Kultivierung zu vermehren (PETERS u. BAUMGARTEN 1990).

Erst mit Hilfe monoklonaler Antikörper war man in der Lage, einzelne Oberflächen- moleküle auf Zellen zu erfassen und zu charakterisieren.

Immunologisch unterscheidet man auf Körperzellen drei Gruppen von Oberflächen- molekülen: die Antigenrezeptoren, welche spezifische Erkennungsfunktionen haben, die MHC (major histocompatibility complex = Haupthistokompatibilitätskomplex) - Mo- leküle, welche die Individualität der einzelnen Individuen ausmachen und den T-Zellen Antigene präsentieren, und die CD-Moleküle, welche ein breites Spektrum von Regu- lierungsfunktionen besitzen.

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Die Untersuchung der CD-Moleküle war in den letzten Jahren bei Mensch und Maus ein Schwerpunkt in der Untersuchung von Oberflächenantigenen. In mehreren internationalen Workshops wurden neue CD-Moleküle und neue spezifische monoklonale An- tikörper dagegen vorgestellt und diskutiert.

Mit Hilfe dieser monoklonalen Antikörper wurden Normalfunktionen und Erkrankun- gen des Immunsystems untersucht. Primär werden sie heute zur Phänotypisierung von Zellen genutzt. Aufgrund ihrer immunmodulierenden Wirksamkeit finden sie zuneh- mend Einsatz bei immunsuppressiven Therapien, Transplantationen und Autoimmun- erkrankungen.

Inzwischen kann man in der Humanmedizin auf eine stattliche Anzahl von kommer- ziell erhältlichen mAk zurückgreifen. Im veterinärmedizinischen Bereich ist die Situati- on schwieriger. Insbesondere für den Hund gibt es nur sehr wenig käufliche mAk.

Dabei gilt es, auch für den Hund geeignete Diagnostik und Therapien für Krankheiten des Immunsystem zu entwickeln.

In der Veterinärmedizin ist die eigene Herstellung neuer monoklonaler Antikörper immer noch die beste Methode, um ein größeres Angebot dieser grundlegenden wichti- gen Reagenzien für solche Untersuchungen zu erhalten.

Anliegen dieser Arbeit war es, neue monoklonale Antikörper gegen bisher nicht zu- gängliche Oberflächenantigene, bevorzugt Aktivierungsantigene, auf Leukozyten des Hundes zu entwickeln und sie phänotypisch und biochemisch zu charakterisieren.

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2. Literaturübersicht

Zelloberflächenmoleküle spielen eine wichtige Rolle bei der Erkennung und Kommu- nikation von Zellen untereinander. Die Zusammensetzung der exprimierten Moleküle definiert u. a. die Art, den Differenzierungsgrad und den funktionellen Zustand einer Zelle.

Zur Identifizierung und Charakterisierung von Zelloberflächenmolekülen werden in erster Linie monoklonale Antikörper eingesetzt. Damit stehen hochspezifische "Instru- mente" zur Verfügung, mit deren Hilfe phänotypische, biochemische und funktionelle Untersuchungen dieser Strukturen durchgeführt werden können.

Im Folgenden wird ein allgemeiner Literaturüberblick über Zelloberflächenantigene und über die Bedeutung von monoklonalen Antikörpern gegeben.

Etwas genauer wird auf die Definition, Funktion und Bedeutung von CD-Molekülen des humanen und caninen Systems eingegangen.

2.1 Antigene und antigenspezifische Rezeptoren

Antigene sind Strukturen, die von T- und B-Zell-Rezeptoren bzw. löslichen Antikör- pern erkannt werden, wobei der Rezeptor bzw. Antikörper mit seinem Paratop an ein Epitop auf dem Antigen bindet. Ein Antigen besteht in der Regel aus einer Summe von vielen unterschiedlichen wie repetitiven Epitopen.

Kontinuierliche bzw. lineare Epitope bestehen aus einer direkten Abfolge von Ami- nosäuren einer Polypeptidkette. Bei einem Konformations- oder diskontinuierlichen Epitop stammen die Aminosäuren dieser Molekülabschnitte von verschiedenen Teilen der Sequenz, die durch Faltungsvorgänge nebeneinander zu liegen kommen (JANE- WAY u. TRAVERS 1997).

Antigene sind relativ großmolekulare, häufig komplex zusammengesetzte Struktu- ren. Um als Antigen zu wirken muß ein Molekül mindestens eine Masse von 4.000 Dal- ton haben. Ein gutes Antigen hat eine Molekülmasse von 10.000, ein hochpotentes von mehr als 100.000 Dalton.

Aber auch kleinmolekulare Substanzen, sog. Haptene, können eine Immunantwort auslösen, wenn sie an ein geeignetes Carriermolekül gekoppelt sind (SCHWICK u.

BRÄUER 1980).

Ein weiterer Faktor, der die Antigenität beeinflußt, ist die chemische Komplexität. Je komplexer ein Molekül ist, desto besser wirkt es als Antigen.

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Unter den Antigenen sind die Proteine am wirksamsten. Die Variabilität unter verschiedenen Proteinen in Hinblick auf ihre Antigenität hängt zum Teil von ihrer Amino- säuresequenz ab. Schon minimale Unterschiede können starke Abweichungen in bezug auf die Antigenität bewirken. Hierbei spielt vor allem das Verhältnis von aromatischen und nicht-aromatischen Aminosäuren eine große Rolle. Proteine, die einen großen Anteil aromatischer Aminosäuren (vor allem Tyrosin) enthalten, sind häufig bessere Antigene als Proteine, die überwiegend aus nicht-aromatischen Aminosäuren aufgebaut sind (KLEIN 1991).

Im Vergleich zu den Proteinen wirken alle anderen Stoffklassen einschließlich der Polysaccharide weniger antigen. Außerdem sind nur Proteine in der Lage, eine signi- fikante T-Zell Antwort auszulösen, während alle anderen Antigene vorwiegend B-Lym- phozyten aktivieren. Polysaccharide induzieren bei einigen Spezies (z.B. Mensch u.

Maus) eine starke Antikörperantwort, bei anderen (z.B. Kaninchen u. Meerschwein- chen) nur eine schwache oder gar keine. Die Ursache dieser Differenz ist noch weitge- hend unbekannt (KLEIN 1991).

Durch die Bindung eines Antigens an seine T- und B-Zell-Rezeptoren können Lym- phozyten unterschiedlich beeinflußt werden. Sie können zur Vermehrung (Proliferati- on), zur Reaktionslosigkeit (Anergie) oder zum Zelltod (Apoptose) aktiviert werden. Die Reaktionen der dabei interagierenden Zellen hängen entscheidend von den dabei mit- wirkenden costimulierenden Molekülen und Signalen ab (JANEWAY u. TRAVERS 1997).

Antigenrezeptoren auf B-Lymphozyten haben bei deren Aktivierung nach Antigen- kontakt zwei Funktionen. Erstens übertragen sie bei Antigenbindung direkt ein Signal in das Zellinnere. Zweitens transportieren sie Antigene in das Zellinnere, wo sie zu kleinen Peptiden abgebaut werden und von wo sie als an MHC-Klasse-II-Moleküle gebun- dene Peptide an die B-Zell-Oberfläche zurückkehren. Die Peptid:MHC-Klasse-II- Komplexe können dann von antigenspezifischen T-Helferzellen (T_H-Zellen) erkannt werden. Diese bilden daraufhin Regulationsmoleküle und Zytokine, welche die B-Zelle zur Proliferation und deren Nachkommen zur Differenzierung zu antikörpersezernie- renden Zellen anregen (JANEWAY u. TRAVERS 1997).

2.2 Antikörper

Immunglobuline (Ig), oder Antikörper, werden ausschließlich von B-Lymphozyten (B- Zellen) synthetisiert. Sie bestehen aus vier Polypeptidketten, zwei leichten oder L (light)-Ketten und zwei schweren oder H (heavy)-Ketten, die über Disulfidbrücken so

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verknüpft sind, daß jeweils eine schwere Kette mit einer leichten Kette und die beiden schweren Ketten miteinander verbunden sind. Die Verbindung zwischen beiden schweren Ketten am Übergang von C_H1 zu C_H2 (s.u.) ist dabei sehr beweglich und wird als Gelenkregion (hinge region) bezeichnet.

Jede leichte Kette besteht aus einer variablen Region (V_L) und einer konstanten Re- gion (C_L). Die schweren Ketten bestehen ebenfalls aus einer variablen Domäne (V_H) aber drei konstanten Domänen (C_H1, C_H2, und C_H3). Die Antigenbindungstellen der Antikörper am N-terminalen Ende des Moleküls setzen sich aus der V_H- und der V_L- Domäne zusammen (JANEWAY u. TRAVERS 1997).

Mit Hilfe von Proteasen kann ein Antikörpermolekül gespalten werden. Das Enzym Papain spaltet zwei identische Fragmente, auf denen sich das Paratop (s. 2.2.1) befin- det (Fab-Fragmente = fragment antigen binding), von einem nicht antigenbindenden Fc-Fragment (Fc = kristallisierbar). Die Fab-Fragmente enthalten die kompletten leichten Ketten und die V_H- und C_H1-Domänen der schweren Ketten. Die Fc-Fragmente entsprechen den C_H2 und C_H3-Domänen der schweren Ketten, und sind der Teil des Antikörpermoleküls, der mit Effektormolekülen und - zellen interagiert (JANEWAY u.

TRAVERS 1997).

2.2.1 Aufbau der variablen Region

Die variablen Bereiche der einzelnen Immunglobuline unterscheiden sich, im Ge- gensatz zu den konstanten Bereichen, erheblich in ihrer aminoterminalen Sequenz.

Die Sequenzvariabilität ist dabei nicht gleichmäßig verteilt. Besonders die an der Struk- tur der V-Domäne beteiligten Aminosäuren sind konserviert. Es gibt drei besonders variable Regionen (hypervariable Regionen [HV]: HV1, HV2, HV3), und zwar ungefähr von Aminosäure 28 bis 35, von 49 bis 59 und von 92 bis 102. In der HV3-Region liegt der variabelste Teil der Domäne. Die Regionen zwischen den hypervariablen Berei- chen sind die sog. Gerüstregionen (framework regions = FR): FR1, FR2, FR3 und FR4 (JANEWAY u. TRAVERS 1997).

Die Gerüstregionen bilden die strukturelle Basis, während die hypervariablen Regio- nen Schleifen bilden, die nebeneinander zum Liegen kommen. Die Sequenzvielfalt ist somit nicht nur auf bestimmte Bereiche der Oberfläche der variablen Regionen be- schränkt, sondern auch räumlich einem bestimmten Bereich der Oberfläche des Mole- küls zugeordnet. Darüber hinaus kommen durch das Aneinanderliegen der V_H- und V_L- Domänen im Immunglobulin die hypervariablen Schleifen jeder Domäne zusammen und bilden so einen einzigartigen hypervariablen Bereich am N-terminalen Ende des

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Antikörpermoleküls, der als Antigenbindungsstelle (= Paratop) fungiert. Da die hypervariablen Schleifen die Bindungsstelle für Antigene bilden und die Spezifität durch eine Oberflächenstruktur festlegen, die zum Antigen komplementär ist, werden sie auch als komplementaritätsbestimmende Regionen (complementarity determining regions:

CDR1, CDR2 und CDR3) bezeichnet (JANEWAY u. TRAVERS 1997).

Ebenfalls für die hohe Variabilität der Antigenbindungstelle verantwortlich sind die Gene, welche die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten codieren. Die- se Gene liegen bei den Säugetieren auf unterschiedlichen Chromosomen und bestehen jeweils aus einer ganzen Reihe von verschiedenen Gensegmenten: V- (variable), D- (diversity), J- (joining) und C- (constant) Segmenten (KLEIN 1991). Diese erbliche Grundlage der Diversität wird verstärkt durch die zufällige Rekombination separater V-, D-, und J-Gensegmente bei der Bildung vollständiger Gene für die variablen Regio- nen. Zusätzlich kann es zum Einfügen einer zufälligen Zahl von Nucleotiden kommen, was ebenfalls die somatische Variabilität erhöht (KLEIN 1991).

2.2.2 Aufbau der konstanten Region

Die konstanten Regionen variieren nicht in der gleichen Weise wie die variablen Re- gionen. Ihre Aufgabe besteht in der Vermittlung von Effektormechanismen.

Die leichten Ketten liegen in zwei verschiedenen Formen vor: entweder als kappa (κ) oder als lambda (λ), aber nie gemischt (CRUSE u. LEWIS 1999). Sie scheinen funktionell unbedeutend.

Bei den konstanten Regionen der schweren Ketten unterscheidet man beim Men- schen fünf Hauptklassen, welche die funktionellen Eigenschaften eines Antikörpermo- leküls bestimmen. Dieses sind IgG (γ-Kette), IgM (µ-Kette), IgA (α-Kette), IgE (ε-Kette) und IgD (δ-Kette). Beim Menschen existieren IgG- und IgA-Subklassen, die sich durch verschiedene Aminosäuresequenzen auf dem konstanten Teil der H-Kette voneinan- der unterscheiden. Die IgG-Klasse ist, gemäß ihren schweren Ketten γ1, γ2, γ3 und γ4, in die vier Subklassen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 unterteilt, IgA dementsprechend in die Subklassen IgA1 (α1-Kette) und IgA2 (α2-Kette) (KLEIN 1991).

Auch bei Tieren unterscheidet man Ig-Klassen und -Subklassen. Beim Hund sind bisher IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA und IgE bekannt (PASTORET et al. 1998a).

Bei der Maus dagegen unterscheidet man IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, IgE und IgD (PASTORET et al. 1998b).

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2.2.3 Isotyp, Allotyp, Idiotyp

Immunglobuline können als Proteine selbst als Antigene fungieren, welche eine An- tikörperantwort auslösen. Mit so gewonnenen anti-Antikörpern können drei verschiedene Typen unterschieden werden: Isotypen, Allotypen und Idiotypen.

Anti-Isotypantikörper erkennen alle Immunglobuline desselben Isotyps bei allen In- dividuen derselben Spezies. Beim Mensch liegen die schweren Ketten in den Isotypen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE und die leichten Ketten in den Isotypen kappa und lambda vor (BURMESTER u. PEZZUTTO 1998).

Allotypen zeigen die Unterschiede zwischen den Immunglobulinisotypen von Indivi- duen derselben Spezies an. Diese Unterschiede beruhen auf der genetischen Variabi- lität. Sie repräsentieren polymorphe Unterschiede der Genloci, die die konstanten Regionen der schweren und leichten Ketten codieren (BURMESTER u. PEZZUTTO 1998)

Idiotope sind die antigen wirkenden Epitope der variablen Region spezifischer Anti- körper. Die Gesamtheit der Idiotope bilden den Idiotyp eines Individuums (JANEWAY u. TRAVERS 1997).

2.2.4 Der B-Zell-Antigenrezeptor-Komplex

Die Antigenrezeptoren der B-Zellen sind membranständige Immunglobuline. Ge- meinsam mit je zwei Signalübertragungsmolekülen, Igα (CD79a) und Igβ (CD79b), bildet ein membranständiger Antikörper einen B-Zell-Antigenrezeptor-Komplex.

Trifft der Antigenrezeptor einer B-Zelle auf sein passendes Antigen, wird durch die Bindung von dem Paratop an das Epitop die Proliferation der B-Zelle und letztlich ihre Differenzierung in eine antikörpersezernierende Zelle ausgelöst (CRUSE u. LEWIS 1999).

Die Stadien der primären B-Zell-Entwicklung sind durch die schrittweise Umordnung und Expression der konstanten Immunglobulingene der schweren und der leichten Ketten definiert (EHRLICH u. KUPPERS 1995). Im Verlauf dieser Entwicklung beginnt die Immunglobulin-Synthese. Zunächst werden IgM-Rezeptoren auf der Oberfläche exprimiert. Wenn das passende Antigen an den IgM-Rezeptor der B-Zelle gebunden hat, durchlaufen die B-Zellen eine Entwicklung, innerhalb derer die konstanten Teile der µ-Kette (des IgM-Moleküls) durch andere konstante Teile (γ−Kette [IgG], α−Kette

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[IgA] o. ε −Kette[IgE]) ersetzt werden, während der variable Teil unverändert erhalten bleibt (BURMESTER u. PEZZUTTO 1998). Durch diesen sog. Isotypenswitch wird der Isotyp der membranständigen und freien Antikörper festgelegt. Somit ändert der Anti- körper nur seine Möglichkeiten für Sekundärfunktionen, aber nicht seine Spezifität.

2.2.5 Funktionen der sezernierten Antikörper

Die sezernierten freien humanen Antikörper erfüllen je nach Isotyp unterschiedliche Funktionen.

Durch die Bindung des Antikörpers an das Antigen verändert sich die räumliche An- ordnung bestimmter Aminosäuren im Bereich des Fc-Fragments. Durch diese strukturelle Veränderung kann der Antikörper verschiedene Effektorfunktionen vermitteln.

Dazu gehören u. a. die Bindung der Komplementkomponente C1q, die Bindung an Fc-Rezeptoren oder die Bindung an Protein A oder Protein G, welches auf der Zell- oberfläche von Staphylokokken bzw. Streptokokken vorkommt (CRUSE u. LEWIS 1999).

Innerhalb der Immunglobulinklassen gibt es allerdings Unterschiede in der Fähigkeit einzelne Funktionen auszuführen.

Alle IgG-Subklassen z.B. vermögen Antigene zu neutralisieren, d.h. in ihrer Infektio- sität zu hemmen. Außer IgG4 sind sie auch in der Lage das Komplementsystem zu aktivieren. Zur Opsonisierung (Veränderung der Antigenoberfläche, damit Phagozyten das Antigen aufnehmen können) fähig sind besonders IgG1, aber auch IgG3 und IgG4.

IgM liegt in der Regel als Pentamer vor, und hat von allen Isotypen die stärkste Fä- higkeit zur Komplementbindung.

IgA bildet meist Dimere und hat vor allem die Funktion, Antigene in den Sekreten (besonders im Darm und im Respirationstrakt) zu neutralisieren (JANEWAY u.

TRAVERS 1997).

Da ein Antigen meist zahlreiche unterschiedliche Epitope trägt, werden in vivo bei einem Antigenkontakt eine Vielzahl von verschiedenen B-Lymphozyten aktiviert, die unterschiedliche spezifische Antikörper produzieren. Dadurch erzielt man eine polyklonale Antikörperantwort und somit ein polyklonales Antiserum gegen dieses An- tigen. Obwohl die Oberfläche eine ganze Reihe potentieller Epitope enthalten kann, scheint nur eine kleine Zahl von Epitopen, häufig nicht mehr als sechs, besonders ef- fizient in der Induktion einer Immunantwort, somit "immundominat", zu sein. Das heißt, daß in erster Linie gegen diese Epitope Antikörper gebildet werden. Dazu wurden verschiedene Thesen aufgestellt, wobei die Erklärung, daß die Antigenität in erster Linie

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von der Erreichbarkeit der jeweiligen Region auf der Moleküloberfläche für Antikörper abhängt, die wahrscheinlichste ist (KLEIN 1991).

Polyklonale Antiseren können für Untersuchungen von Antigenen eingesetzt werden. Allerdings sind Antisera in ihrer Zusammensetzung an Spezifität und Isotyp der Antikörper variabel und nicht reproduzierbar. Somit können die funktionellen Eigen- schaften unterschiedlicher Serumchargen eines Spenders ebenso erheblich schwan- ken, wie die unterschiedlichen Spezifitäten der darin enthaltenen Antikörper (MAYER 1988).

Für analytische bzw. diagnostische Zwecke hingegen will man möglichst Antikörper mit einer sehr hohen Spezifität für ein Antigen, niedriger Kreuzreaktion (s. 2.5.3) und in reproduzierbaren, großen Mengen zur Verfügung haben (MAYER 1988).

Zu diesem Zweck wird heute die von César Milstein und Georges Köhler entwickelte Hybridomtechnik zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern eingesetzt. Hierbei wird eine Myelomzelle mit einer B-Zelle fusioniert, so daß eine unsterbliche Zelle ent- steht, die in vitro kultiviert werden kann, und die nur einen einzigen Antikörper gleich- bleibender Spezifität und Isotyps produziert (PETERS u. BAUMGARTEN 1990).

2.3 Monoklonale Antikörper

2.3.1 Eigenschaften und Bedeutung von monoklonalen Antikörpern

MAk sind die sezernierten Produkte von Nachkommen einer einzelnen B-Zelle bzw.

Plasmazelle (CRUSE u. LEWIS 1999). Die Hybridomtechnik ermöglicht die Gewin- nung großer Mengen mAk gegen nahezu jedes Antigen (MARX et al. 1997). Dadurch erhält man über lange Zeit konstante Reagenzien.

Aufgrund der selektiven Bindung der mAk und der Möglichkeit, sie relativ einfach zu markieren (z.B. mit einem Enzym), ist die Verwendung von mAk sehr vielfältig.

Mit Hilfe mehrerer mAk z.B. kann man ein Antigen nahezu abtasten und somit einen Überblick über dessen unterschiedlichen Epitopstrukturen ("Epitop-Mapping") bekom- men (PETERS u. BAUMGARTEN 1990).

Aber auch bei der Erforschung von Signalübertragungsmechanismen, werden mAk an Stelle der häufig unbekannten natürlichen Liganden eingesetzt, um durch eine Bin- dung an den Rezeptor den Effekt der Rezeptor-Ligand-Interaktion (z.B. Kalziumaus- schüttung oder Zellproliferation) zu untersuchen (CLARK u. LEDBRETTER 1986).

Bei der Herstellung von Vakzinen verspricht man sich die Möglichkeit einer Verbes- serung aus der Isolierung von spezifischen Antigenen aus Mikroorganismen mit Hilfe mAk.

(20)

Weiterhin werden mAk vielfach in der Diagnostik von körpereigenen (z.B. Autoanti- gene) oder körperfremden (Krankheitserregern) Strukturen eingesetzt.

Ein weiterer wichtiger Bereich ist der Einsatz von mAk in der Tumordiagnostik. Ge- sunde und maligne Zellen zeigen qualitative und quantitative Unterschiede in der Ex- pression von Zelloberflächenmolekülen. Maligne Lymphome und Leukämien sind mit mAk viel genauer zu klassifizieren, als dies aufgrund morphologischer Untersuchun- gen möglich ist. Eine möglichst exakte Klassifikation kann vor allem in der Humanme- dizin für die Prognose und Therapie von entscheidender Bedeutung sein (ANDERS u.

SCHMIDT 1988).

Neben den Vorteilen die ein mAk hat, gibt es aber auch einige Nachteile. Es läßt sich für keinen Antikörper die biologische Wirksamkeit vorhersagen. So können verschiedene, gegen dasselbe Epitop gerichtete mAk eine unterschiedliche Affinität besitzen, unterschiedliche Komplementfixation und Zytotoxizität bewirken oder sich unterschiedlich gut für eine gewünschte Immunfärbung oder ELISA-Technik eignen (PETERS u.

BAUMGARTEN 1990).

Aber auch die physikochemischen Eigenschaften sind sehr vielfältig. Man weiß nicht, wie lagerfähig ein Antikörper ist oder ob er zur Selbstaggregation neigt (PETERS u. BAUMGARTEN 1990).

Hieraus sollte die Konsequenz gezogen werden, bei der Suche nach einem geeig- neten mAk die gewünschte Anwendung schon im Suchtest einzusetzen. So sollte ein für die immunhistologische Diagnostik gewünschter Antikörper auch auf histologischen Schnitten und nicht im ELISA ausgetestet werden (PETERS u. BAUMGARTEN 1990).

2.4 Zelloberflächenmoleküle (CD-Moleküle)

2.4.1 Definition und Nomenklatur

Untersuchungen an isolierten Lymphozytenpopulationen zeigten, daß Lymphozyten, die bestimmte Kombinationen von Oberflächenproteinen aufweisen, verschiedene Entwicklungsstadien mit bestimmten Funktionen repräsentieren. Daher wurden die Oberflächenmoleküle ursprünglich als Differenzierungsantigene bezeichnet (BOYSE u. OLD 1969).

Die Entdeckung und Charakterisierung von Oberflächenmolekülen wurde durch die Technik, monoklonale Antikörper gegen diese Strukturen herzustellen, enorm voran- getrieben. Um eine internationale Vergleichbarkeit von monoklonalen Antikörpern zu gewährleisten, wurde in sog. CD-Workshops (cluster of differentiation, CD) eine Zuord- nung von Antikörpern gegen Oberflächenmoleküle mit ähnlichen Bindungseigenschaf-

(21)

ten zunächst zu einer Gruppe vorgenommen (SEILER et al. 1985). Die von den mAk erkannten Moleküle werden als CD-Moleküle bezeichnet. In regelmäßigen Workshops werden neu entwickelte mAk, aber auch neu entdeckte CD-Moleküle vorgestellt und diskutiert. Seit dem "7. Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (HLDA)" 2000 in Harrogate (GB) sind 247 CD-Moleküle im humanen System beschrieben. Das Clustering erfolgt nach Funktion bzw. nach Lokalistion der CD-Mo- leküle. In Harrogate wurde eine Unterteilung der CD-Moleküle in folgende Sektionen vorgenommen (Quelle: http://gryphon.jr2.ox.ac.uk/studies.html):

Im veterinärmedizinischen Sektor erfolgt das Clustering nach dem gleichen Prinzip.

Zur Unterscheidung vom humanen System werden den CD-Bezeichnungen tierartspe- zifische Kürzel vorangestellt: z.B. "ca" für canin (COBBOLD u. METCALFE 1994) "ov"

für ovin, "bo" für bovin (NAESSENS u. HOPKINS 1996) oder "eq" für equin (LUNN et al. 1998). Auch hier fanden Workshops zur systematischen Erfassung von mAk und CD-Molekülen statt (COBBOLD u. METCALFE 1994, NAESSENS u. HOPKINS 1996, SAALMÜLLER et al. 1998). Zu beachten ist jedoch, daß es Unterschiede zum humanen System gibt, weil bei der Charakterisierung durch mAk unterschiedliche Maßstäbe gesetzt werden. So werden z.B. beim caninen System die Bezeichnungen bereits dann vergeben, wenn ein ähnliches Verteilungsmuster wie beim humanen Äquivalent auf verschiedenen Zellen gezeigt wird (COBBOLD u. METCALFE 1994). Im Gegensatz dazu werden beim Schwein die CD-Bezeichnungen erst dann endgültig vergeben, wenn die Homologie zum humanen CD-Molekül durch Aminosäuresequenzierungen eindeutig feststeht (SAALMÜLLER et al. 1998). Beim Rind schließlich werden CD-Be- zeichnungen vergeben, wenn die Homologie entweder durch eine Sequenzierung, durch kreuzreaktive Antikörper oder durch eine Kombination aus besonderen funktionellen und biochemischen Eigenschaften bewiesen wurde (NAESSENS u. HOPKINS 1996).

T-Zellen Cytokin/Chemokin Rezeptoren

B-Zellen Myeloidzellen

Natürliche Killerzellen Homologe CDs bei Mensch und Tier Adhäsionsmoleküle Carbohydrat- und Lektinstrukturen

Non-lineage Moleküle Ektoenzyme

Erythrozyten Stamm- und Vorläuferzellen

Thrombozyten Kreuzreaktive Antigene

Endothelzellen

(22)

Alle Nomenklatursysteme haben die gemeinsame Regelung, daß ein "w" (workshop- defined) vor die CD-Bezeichnung gesetzt wird, wenn die Zuordnung noch nicht eindeutig bestätigt wurde, z.B. CDw32 (Fcγ RII) im humanen System.

Die Numerierung der CD-Moleküle erfolgt in der Regel nach „Entdeckung“ des CD- Moleküls, so daß sich aus der Bezeichnung keine Rückschlüsse auf die Funktion des jeweiligen Moleküls ziehen lassen.

2.4.2 Eigenschaften und Funktionen von CD-Molekülen

Bei den CD-Molekülen handelt es sich um eine sehr heterogene Gruppe. Zum Teil sind die Moleküle Monomere, wie z.B. CD4 (Abb.1).

Abb. 1: Molekülstruktur von CD4

Dabei handelt es sich um ein Zelloberflächenglykoprotein mit vier Ig-ähnlichen Domänen (aus: KISHIMOTO et al. 1997a).

CD = cluster of differentiation

Es kann sich aber auch um ein sehr komplexes Molekül handeln, welches sich aus mehreren Untereinheiten zusammensetzt. So zum Beispiel CD3, welches aus sechs unterschiedlichen Polypeptidketten mit normalerweise vier verschiedenen Ketten besteht (Abb. 2).

Abb. 2: Molekülstruktur von CD 3

Die Bezeichnung CD3 wird normalerweise für die γ-, δ- und ε-Kette des CD3-Komplexes verwendet. CD3 setzt sich aus zwei Dimeren (γε und δε) zusammen (aus: KISHIMOTO et al. 1997b).

(23)

Teilweise erhalten Einzelketten von Heterodimeren eines CD-Moleküls unterschiedliche CD-Bezeichnungen. Der Komplex CD11/CD18 setzt sich aus der gemeinsamen ß-Kette (CD18), die mit drei verschiedenen α-Ketten (CD11a,11b,11c) assoziiert sein kann (s. Abb. 3), zusammen (DANILENKO et al. 1992). Diese bilden dann gemeinsam die funktionellen Moleküle LFA-1 (CD11a/CD18), Mac-1 (CD11b/CD18) und gp150,95 (CD11c/CD18).

Abb. 3: Molekülstruktur von CD11a (links) und CD18 (rechts), die gemeinsam das Leukozytenfunktionsantigen (LFA 1) bilden (aus: KISHIMOTO et al. 1997c).

Antikörper, die einem Cluster zugeordnet sind, erkennen häufig verschiedene Epito- pe auf einem komplexen CD-Molekül, so daß diese auch unterschiedliche Einflüsse (z.B. aktivierend oder hemmend) haben können.

Nicht nur strukturell, auch funktionell sind CD-Moleküle sehr unterschiedlich: sie kön- nen als Enzyme, Rezeptoren, Korezeptoren, Adhäsionsmoleküle, Inhibitoren oder auch signaltransduzierende Moleküle fungieren (JANEWAY u. TRAVERS 1997). Die Funktionen können sich aber auch überlappen (BARCLAY et al. 1993). In Tabelle 1 sind einige Beispiele gut untersuchter CD-Moleküle eingeteilt nach ihren Funktionen aufgeführt.

(24)

Tabelle 1: Beispiele für humane CD-Moleküle unterteilt nach funktionellen Eigenschaften (nach JANEWAY u. TRAVERS 1997) Funktion CD-Molekül Zelluläre Expression auf Adhäsion

" CD2 T, ThyZ, NK

" CD22 B

" CD106 Endo

Aktivierung

" CD2R T (akt.)

" CD28 T (Subpop.), B (akt.)

" CD69 T (akt.), B (akt.), Makro (akt.), NK

Enzym

Zink Metallproteinase CD13 Myelomonozytische Zellen Exopeptidase CD26 T (akt.), B (akt.), Makro Tyrosinphosphatase CD45 alle hämatopoetischen Zellen Komplement-Inhibitor

DAF CD55 hämatopoetische und nicht

hämatopoetische Zellen Mac-Inhibitor CD59 hämatopoetische und nicht

hämatopoetische Zellen Rezeptor für

MHC -Klasse-II CD4 ThyZ (Subpop.), T (H), Mono, Makro

MHC-Klasse-I CD8 ThyZ (Subpop.), T (Zytotox.)

IgG (FcγRI) CD64 Mono, Makro

Abkürzungen: B: B-Zellen, B (akt.): aktivierte B-Zellen, B (Subpop.): Subpopulation von B-Zellen, DAF: decay accelerating factor, Endo: Endothelzellen, FDZ: follikuläre dendritische Zellen, Granu: Granulozyten, Mac: Mem- branangreifender Komplex, Makro: Makrophagen, Makro (akt): akti- vierte Makrophagen, Mono: Monozyten, Neutro: Neutrophile Granulo- zyten, NK: Natürliche Killerzellen, T: T-Zellen, T (akt.): aktivierte T- Zellen, T(H):T-Helfer-Zelle, T (Subpop.): Subpopulation von T-Zellen, T (Zytotox): zytotoxische T-Zellen, Thrombo: Thrombozyten, ThyZ:

Thymozyten, ThyZ (Subpop.): Subpopulation von Thymozyten

(25)

2.4.3 Expression von CD-Molekülen auf Zellen

Durch den Nachweis von CD-Molekülen können Zellen, welche anhand ihrer Mor- phologie nur begrenzt auf ihren Differenzierungsgrad oder Funktionszustand beurteilt werden können, genauer charakterisiert und eingeteilt werden. So werden z.B. in verschiedenen Entwicklungsstadien der Zelle bestimmte Oberflächenmoleküle exprimiert, die bei der Heranreifung wieder verloren gehen (JANEWAY u. TRAVERS 1997).

Beispielsweise exprimieren T-Vorläuferzellen weder CD4 noch CD8. Sie werden als doppelt negativ bezeichnet. Während der Heranreifung im Thymus werden die T-Zel- len doppelt positiv, das heißt, sie exprimieren CD4 und CD8. Die reife T-Zelle, die in die Peripherie entlassen wird, ist dann schließlich einfach positiv, d.h. sie exprimiert entweder nur CD4 oder CD8 (BURMESTER u. PEZZUTTO 1998).

Ein weiteres Beispiel sind die exprimierten Isoformen des CD45-Moleküls bei T-Lym- phozyten, anhand der erkannt werden kann, ob es sich um naive (CD45RA-positive) oder um aktivierte (CD45RO-positive) T-Zellen handelt (MICHIE et al. 1992).

Diese Beispiele zeigen, wie wichtig der Nachweis von CD-Antigenen für die Erken- nung und Einteilung von Zellen ist. Dabei spielt oft nicht der Nachweis eines einzelnen Moleküls eine Rolle, sondern vielmehr des Spektrums der exprimierten CD-Antigene.

IgE (FcεRII) CD23 B, Makro, FDZ, Thrombo

IgA (FcαR) CD89 Mono, Makro, Granu, Neutro,

B (Subpop.), T (Subpop.) Komplementkompo-

nente C3bi (CR2)

CD21 B, FDZ

Transferrinrezeptor CD71 alle proliferierenden Zellen Tabelle 1: (Forts.) Beispiele für humane CD-Moleküle unterteilt nach funktio-

nellen Eigenschaften (nach JANEWAY u. TRAVERS 1997) Funktion CD-Molekül Zelluläre Expression auf

Abkürzungen: B: B-Zellen, B (akt.): aktivierte B-Zellen, B (Subpop.): Subpopulation von B-Zellen, DAF: decay accelerating factor, Endo: Endothelzellen, FDZ: follikuläre dendritische Zellen, Granu: Granulozyten, Mac: Mem- branangreifender Komplex, Makro: Makrophagen, Makro (akt): akti- vierte Makrophagen, Mono: Monozyten, Neutro: Neutrophile Granulo- zyten, NK: Natürliche Killerzellen, T: T-Zellen, T (akt.): aktivierte T- Zellen, T(H):T-Helfer-Zelle, T (Subpop.): Subpopulation von T-Zellen, T (Zytotox): zytotoxische T-Zellen, Thrombo: Thrombozyten, ThyZ:

(26)

So sagt z.B. der Nachweis nur von CD4 auf T-Zellen nicht aus, ob es sich um einen Thymozyten (CD4 + und CD8 +) oder um einen reifen T-Lymphozyten (nur CD4) handelt. Deshalb sind -je nach Fragestellung- die differenzierenden CD-Moleküle an der individuellen Zellprobe gemeinsam zu unterscheiden (BARCLAY et al. 1993). Ebenso ist häufig die Expressionsdichte bei den unterschiedlichen Funktionen einer Zelle von Bedeutung. Dies gilt besonders für die sog. Aktivierungsantigene, welche bestimmte Strukturen aktivierungsabhängig verstärkt oder vermindert exprimieren (STEIN et al.

1989).

2.4.3.1 Mitogene Stimulation von Lymphozyten

Um ruhende Lymphozyten zum Wachstum anzuregen, wird ein Stimulationsreiz be- nötigt. Unter in vivo Bedingungen wird aber immer nur ein bestimmter Teil der Lympho- zyten zur Teilung angeregt. Die Entdeckung von Substanzen, die viele oder sogar alle Lymphozyten eines bestimmten Typs in vitro stimulieren, ermöglichte die Erforschung der Aktivierungsantigene. Diese Substanzen werden Mitogene genannt, weil sie durch Bindung an spezifische Zuckerreste bei Lymphozyten mit ganz unterschiedlicher klo- naler Herkunft und Spezifität eine Mitose auslösen. T- und B- Lymphozyten werden jedoch, abhängig von ihrer Kohlehydratrestausstattung, durch unterschiedliche Mitogene stimuliert. Aktivierte Lymphozyten erfahren mit dem Eintritt in die G1-Phase des Zellzyklus eine starke Vergrößerung ihres Volumens und werden zu sog.

Lymphoblasten. Zudem verändern sie die Expression ihrer CD-Moleküle (JANEWAY u. TRAVERS 1997).

Zu den Mitogenen gehört Concanavalin A. Es stammt von der Schwertbohne Cana- valia ensiformis und hat beim Mensch einen proliferierenden Einfluß bevorzugt auf T- Zellen (HAWRYLOWIC u. KLAUS 1984).

2.4.4 Aktivierungsantigene

Aktivierungsantigene werden als Zelloberflächenstrukturen definiert, deren Expres- sion nach einer Stimulation induziert oder erhöht wird (STEIN et al. 1989).

Die ersten beiden Cluster von Aktivierungsantigenen, die als CD23, dem p45 Anti- gen auf aktivierten B-Zellen, und CD25, der α-Kette des IL-2 Rezeptor, bezeichnet wurden, sind auf dem 2. Internationalen Workshop 1984 in Boston definiert worden (BEVERLY 1987). Einem dritten Antigen auf aktivierten T-Zellen wurde die vorläufige Bezeichnung CDw26 gegeben. Daraufhin wurde den Antigenen auf stimulierten Zellen mehr Aufmerksamkeit geschenkt, vor allem weil es Hinweise gab, daß solche Antigene häufig als Rezeptormoleküle für die Signalübertragung bei Wachstum bzw. Differen- zierung von Zellen fungieren (BEVERLY 1987).

(27)

Während der Vorbereitung zum 3. Internationalen Workshop in Oxford 1986 wurde daher die Notwendigkeit erkannt, mAk gegen exprimierte Strukturen auf aktivierten Zellen von mAk gegen Moleküle auf ruhenden Zellen getrennt zu bewerten. Aufgrund dieser Vorgabe konnte jedoch nur ein neues Aktivierungsantigen identifiziert werden, so daß die Organisatoren des 4. Internationalen Workshops in Wien (1989) die Suche forcieren wollten, indem sie eine eigene Sektion für Aktivierungsantigene beschlossen.

Auf dem 5. Workshop 1993 in Boston (USA) wurden die in Tabelle 2 aufgeführten Mo- leküle als Aktivierungsantigene vorgestellt (SCHLOSSMANN et al. 1993).

Tabelle 2: Übersicht über Aktivierungsantigene (Quelle: SCHLOSSMANN et al. 1993 u. KISHIMOTO et al. 1996)

CD- Molekül

Andere

Bezeichnung Funktion Expression auf

CD9 p24, MRP-1 Aggregation und Akti- vierung von Blutplätt- chen

T (akt.), Mono, Eos, Baso, Pl

CDw17 LacCer Lactosylceramid Neutro, Mono, Pl CD23 Fcε RII, Leu-20,

BLAST-2, Low affinity IgE

niederaffiner Rezeptor für IgE; reguliert IgE- Synthese von B-Zellen;

Ligand für

CD19:CD21:CD81- Corezeptor

B, Makro (akt.), Eos, Pl

Abkürzungen: AIM: activation inducer molecule (Aktivierungsantigen), B: B-Zellen, B (akt.): aktivierte B-Zellen, B (Subpop.): Subpopulation von B-Zellen, B (zirk.): zirkulierende B-Zellen, Baso: Basophile Granulozyten, DC: Dendritische Zellen, DPP: Dipeptidylpeptidase, Endo: Endothelzellen, Endo (akt.): aktivierte Endothelzellen, Eos: Eosinophile Granulozyten, Granu: Granulozyten, LAMP: lysosomal assoziiertes Membranprotein, Leukos.: Leukozyten, Lympho: Lymphozyten, Makro: Makrophagen, Makro (akt):

aktivierte Makrophagen, Mono: Monozyten, Neutro: neutrophile Granulozyten, NK:

Natürliche Killerzellen, NK (akt.): aktivierte Natürliche Killerzellen, Pl: Thrombozyten, Pl (akt.): aktivierte Thrombozyten, Plasmaz.: Plasmazellen, T: T-Zellen, T (akt.):

aktivierte T-Zellen, T (H/Infl): T-Helferzellen bzw. inflammatorische T-Zellen, T (Subpop.): Subpopulation von T-Zellen,T (Zytotox): zytotoxische T-Zellen, ThyZ:

(28)

CD25 IL-2R, Tac antigen α-Kette des IL-2-Rezep- tors, assoziiert mit CD122 (IL-2β-Kette) und der IL-2γ-Kette zum hochaffinen IL-2-Rezep- tor

T (akt.), B, Mono

CD26 DPP IV Exopeptidase B (akt.), T (akt.), Makro CD27 T14, S152 bindet CD70; kann bei

T-u. B-Zellen als Costi- mulator wirken

T, NK, B (Subpop.)

CD30 Ki-1, Ber-H2 bindet CD30L; Vernet- zung von CD30; ver- stärkt Proliferation von B- u. T-Zellen

T (akt.), B (akt.), NK (akt.), Mono

CD39 unbekannt B (akt.), NK (akt.),

Makro, DC CD49d VLA-4 α⁴-Integrin;verbindet

sich mit CD29

Fast alle Zelltypen

CD69 AIM, EA 1, VEA unbekannt, frühes Akti- vierungsantigen

T (akt.), B (akt.), Makro (akt.), NK

CD70 Ki-24, CD27 ligand

Ligand für CD27, mögli- cherweise Costimulie- rung von B- u. T-Zellen

B (akt.), T (akt.), Makro

CD71 T9, Transferrin receptor

Transferrinrezeptor alle proliferierende Zel- len

Tabelle 2: (Forts.) Übersicht über Aktivierungsantigene (Quelle: SCHLOSSMANN et al. 1993 u. KISHIMOTO et al. 1996)

CD- Molekül

Andere

(29)

CD80 B7.1, BB1 Costimulator; Ligand für CD28 und CTLA-4 (CD152)

B (Subpop.)

CD84 GR6 unbekannt Mono, Pl, B (zirk.)

CD86 B7.2, B70 Ligand für CD28; bindet CD152 (CTLA-4)

B (akt.), Mono CD95 Apo-1, Fas bindet TNF-ähnlichen

Fas-Liganden; induziert Apoptose

Vielzahl von Zellinien, in vivo-Verteilung unbekannt

CD96 TACTILE unbekannt T (akt.), NK

CD97 bindet CD55 (DAF) B (akt.), T (akt.), Mono,

Granu CD98 4F2, FRP-1 möglicherweise ein Ami-

nosäuretransportpro- tein; involviert in der Regulation zellulärer Aktivierung

T, B, NK, Granu, alle menschlichen Zellinien

CD100 GR3 assoziiert mit PTPase u.

Serinekinase Aktivität;

hämatopoetische Stammzellen CD103 HML-1, α₆, α_E-

Integrin

α_E-Integrin Lympho (Subpop.) Tabelle 2: (Forts.) Übersicht über Aktivierungsantigene (Quelle: SCHLOSSMANN et

al. 1993 u. KISHIMOTO et al. 1996) CD-

Molekül

Andere

(30)

Auf dem Workshop in Wien wurde allerdings auch über die Problematik der exakten Zuteilung von CD-Antigenen zu den Aktivierungsantigenen diskutiert. So wurden einige Moleküle, die unter bestimmten Umständen heraufreguliert werden, nicht den Akti- vierungsantigenen zugeordnet (ARNOUT 1990). Ebenso kann die Definition, Aktivierungsantigene erleichtern die Proliferationsvorgänge von T-Zellen, nicht allge- mein gelten, da sonst auch die Adhäsionsmoleküle den Aktivierungsantigenen zugeordnet werden müßten (GARCIÁ-CÓZAR et al. 1993). Aus diesen Gründen wurde beschlossen, die Sektion "Aktivierungsantigene" wieder aufzuheben. In der Zwischen- zeit jedoch hat sich dieser Begriff so etabliert, daß er, wie in dieser Arbeit, noch vielfach Verwendung findet.

CD107a LAMP-1 unbekannt; lysosoma- les Membranprotein, das nach Aktivierung an Zelloberfläche verlagert wird

T (akt.), Pl (akt.), Neutro (akt.), Endo (akt.)

CD119 IFN-γR Rezeptor für IFN-γ B, Makro, Mono, Endo CD126 IL-6R α-Untereinheit des IL-6-

Rezeptors

B (akt.) + Plasmaz.

(stark), fast alle Leukos (schwach)

Tabelle 2: (Forts.) Übersicht über Aktivierungsantigene (Quelle: SCHLOSSMANN et al. 1993 u. KISHIMOTO et al. 1996)

CD- Molekül

Andere

(31)

2.5 Canine CD-Moleküle

Die steigende Qualität der Diagnostik und Therapie beim Hund macht die Einbezie- hung von caninen CD-Molekülen unumgänglich.

Aber auch zur Erforschung des humanen Immunsystems wird der Hund immer noch als Versuchstier eingesetzt. Einige Erkrankungen beim Hund sind denen des Men- schen relativ ähnlich und lassen sich nicht an kleinen Labortieren nachvollziehen.

Canine Leukozyten konnten bisher aber nur unbefriedigend charakterisiert werden, weil nur eine geringe Anzahl an mAk zur Verfügung stand (GALKOWSKA et al. 1996).

Aus diesen Gründen wurde die Untersuchung von mAk gegen CD-Moleküle beim Hund in den letzten Jahren forciert (BYRNE et al. 2000). In einigen Fällen konnten auch kreuzreagierende mAk von anderen Spezies verwendet werden (JACOBSON et al. 1993, SCHUBERTH et al. 1996).

2.5.1 Besonderheiten der Expression von CD-Molekülen beim Hund

Im Verteilungsmuster der exprimierten Leukozytenoberflächenstrukturen beim Hund gibt es einige Unterschiede zum humanen System.

Besonders auffällig ist dabei die konstitutive Expression von MHC-Klasse-II-Antigen auf ruhenden caninen T-Zellen. Die funktionelle Bedeutung dieser Expression ist dabei noch unklar (DEEG et al. 1982, DOVEREN et al. 1985). Ebenso wird CD4 beim Hund auf reifen polymorphkernigen Granulozyten (PMN) stark exprimiert. Beim Menschen dagegen wird es nur auf einer Subpopulation von T-Zellen exprimiert (MOORE et al.

1992). Das Molekül Thy-1 ist auf caninen T-Zellen, Monozyten und PMN zu finden. Hu- mane Leukozyten exprimieren es nur auf Prothymozyten. Das CD5 Molekül dagegen wird beim Hund nur auf T-Zellen die den γδ−Rezeptor exprimieren und natürlichen Kil- lerzellen (NK), beim Mensch dagegen auf allen T-Zellen und einer Subpopulation von B-Zellen exprimiert (HAHN et al. 1991, COBBOLD u. METCALFE 1994).

2.5.2 Für canine Leukozytenantigene spezifische monoklonale Antikörper Im Juli 1993 fand der "First International Canine Leucocyte Antigen Workshop"

(CLAW) in Cambridge, Großbritannien statt. Ziel war es, Daten über mAk gegen Leu- kozytenoberflächenantigene zu sammeln und auszuwerten. Die Motivation war, neue Reagenzien zu erhalten, die einen Fortschritt für die Diagnose, die Behandlung und das Monitoring in der Veterinärmedizin bedeuten. Ein besonderes Augenmerk sollte

(32)

dabei auch auf für die Humanmedizin nützliche Aspekte gelegt werden (COBBOLD u.

METCALFE 1993).

Die mAk wurden an ausgewählte Labore verschickt und in sog. "Blind-Panel"-Studi- en untersucht. Auf dem Workshop wurden 73 mAk zu 14 Clustern zusammengefaßt (s. Tabelle 3). Sechs mAk konnten nicht geclustert werden, weil bei der Analyse keine eindeutigen Reaktionspartner identifiziert werden konnten. Andere Antikörper wieder- um wurden in sog. Workshop Clustern zusammengefaßt. Hierbei wurde zunächst eine Einteilung nach dem Verteilungsmuster vorgenommen.

Mit Hilfe dieser Antikörper wurden die in Tabelle 3 aufgeführten CD-Moleküle auf Leukozyten vom Hund charakterisiert:

Tabelle 3: Im "First International Canine Leucocyte Antigen Workshop" vorgestellte CD-Moleküle (Quelle: COBBOLD u. METCALFE 1994)

Antigen Andere Bezeichnung

Mole- kular- gewicht

mAk

(n) Zelluläre Expression auf

CD1a 49 1 ThyZ, Langerhans u. DC

CD1c 43 ThyZ, Langerhans u. DC

CD4 MHC II-Rezeptor 58 7 ThyZ, T (Subpop.), Neutro

CD5 67 8 ThyZ, T, B (Subpop.)

CD8a MHC I- Rezeptor 35 3 ThyZ, T (Subpop.)

CD11a LFA-1 180 Leukos

CD11b Mac-1, Mo-1, CR3

175 Granu, Mono

CD18 ß₂-Integrin 95 5 Leukos

CD21 p150/95 150 B, Follikuläre DC

CDw41 GPIIb/IIIa 3 Pl, Megakaryozyten

CD44 Ppg-1 90 5 Leukos, T (akt)

CD45 LCA 180-220 6 Pan Leukos

Abkürzungen: B: B-Zellen, B (Subpop.): Subpopulation von B-Zellen, CD: Cluster of differentiation, DC: Dendritische Zellen, Endo: Endothelzellen, Granu: Granulozyten, ICAM:

interzelluläre Adhäsionsmoleküle, LCA: leucocyte common antigen (gemeinsames Leukozytenantigen), Leukos.: Leukozyten, LFA: Lymphozyten Funktionsassoziiertes Antigen, mAk: monoklonale Antikörper, Makro: Makrophagen, Makro (Subpop.):

Subpopulation von Makrophagen, Mono: Monozyten, n: Anzahl geclusterter mAk, Neutro: neutrophile Granulozyten, Pl: Thrombozyten, T: T-Zellen, T (akt.): aktivierte T-Zellen, T (Subpop.): Subpopulation von T-Zellen, ThyZ: Thymozyten

(33)

Damit standen erste international definierte monoklonale Antikörper gegen einige CD-Moleküle des Hundes zur Verfügung, auch wenn die Definitionskriterien weit hinter denen des Menschen zurückblieben.

CD45RA 205,220 6 B, T (Subpop.)

CD49d VLA-4 130,150 1 ThyZ, T, Myeloidzellen

CD54 ICAM-1 95 weites Spektrum

CD62 P-Selektin, GMP-140

140 Pl, Megakaryozyten, Endo

CD90 Thy-1 29 9 ThyZ, T

MHC II 28, 34 6 B, T, Mono, DC

TCRαβ ThyZ, T

TCRγδ ThyZ, T

αδ CD11d? 155 Makro (Subpop.)

caIg 7 B

T-Zellen ThyZ, Pan T-Zellen

B-Zellen B

Granulo- zyten

Granu Monozy-

ten

Mono, Makro

Tabelle 3: (Forts.) Im "First International Canine Leucocyte Antigen Workshop"

vorgestellte CD-Moleküle (Quelle: COBBOLD u. METCALFE 1994)

Antigen Andere Bezeichnung

Mole- kular- gewicht

mAk

(n) Zelluläre Expression auf

Abkürzungen: B: B-Zellen, B (Subpop.): Subpopulation von B-Zellen, CD: Cluster of differentiation, DC: Dendritische Zellen, Endo: Endothelzellen, Granu: Granulozyten, ICAM:

interzelluläre Adhäsionsmoleküle, LCA: leucocyte common antigen (gemeinsames Leukozytenantigen), Leukos.: Leukozyten, LFA: Lymphozyten Funktionsassoziiertes Antigen, mAk: monoklonale Antikörper, Makro: Makrophagen, Makro (Subpop.):

Subpopulation von Makrophagen, Mono: Monozyten, n: Anzahl geclusterter mAk, Neutro: neutrophile Granulozyten, Pl: Thrombozyten, T: T-Zellen, T (akt.): aktivierte T-Zellen, T (Subpop.): Subpopulation von T-Zellen, ThyZ: Thymozyten

(34)

2.5.3 Kreuzreaktive monoklonale Antikörper

Monoklonale Antikörper anderer Spezies gegen canine Differenzierungsantigene wurden auf Kreuzreaktionen getestet, um die Auswahl an mAk gegen canine Oberflä- chenantigene zu erweitern (SCHUBERTH et al. 1996). Dies ist auch eine gute Alterna- tive zur kosten- und arbeitsintensiven Herstellung von mAk (AASTED et al. 1988).

In den folgenden Tabellen (4 + 5) ist eine Auswahl über kreuzreagierende Antikörper mit caninen Leukozyten gegeben.

Tabelle 4: Mit caninen Leukozyten kreuzreagierende humane mAk (Quelle: BEER 1998)

Antigen mAk Isotyp Expression auf caninen:

CD6 MT606 IgG2b Thyz, T

CD8 MT811 IgG1 ThyZ, T (Subpop.)

CD14 TÜk4 IgG2a Mono

CD18 MHM23

MCA 503 IOT 18 AM 18

IgG1 IgG2b IgG1 IgG1

Leukos Leukos Leukos Leukos

CD21 IOB 1a

S-B2

IgG1 IgG1

B B

CD23 MHM6 IgG1 Eos

CDw29 4B4 IgG1 T (akt.)

CD45R0 UCHL 1 IgG2a Leukos

CD45RB PD7/26 IgG1 Leukos

CD49d HP2/1 IgG1 Lymphos (Subpop.)

anti-B1 ? Lymphos (Subpop.)

Abkürzungen: B: B-Zellen, CD: Cluster of differentiation, Eos: Eosine Granulozyten, Leukos: Leukozyten, Lymphos (Subpop): Subpopulation von Lymphozyten, mAk: monoklonale(r) Antikörper, T: T-Zellen,

T (akt.): aktivierte T-Zellen, T (Subpop.): Subpopulation von T-Zellen, ThyZ: Thymozyten

(35)

Neben humanen mAk wurden auch mAk anderer Spezies gestestet (s. Tabelle 5)

Kreuzreaktionen können auf unterschiedlichen Bindungseigenschaften beruhen.

Zum einen können die mAk auf derselben Zelle mit sehr unterschiedlichen Strukturen reagieren und an sehr unterschiedlichen Stellen binden. In diesem Fall erkennen sie zwar die gleichen Zellpopulationen, es handelt sich aber nicht um eine Kreuzreaktion, sondern um ein binden anderer Moleküle, die jedoch ein für den mAk passendes Epi- top tragen. Zum anderen kann dieselbe Struktur erkannt werden. In diesem Fall han- Tabelle 5: Mit caninen Leukozyten kreuzreagierende mAk verschiedener Spezies

(Quelle: BEER 1998)

Antigen mAk Isotyp Expression auf caninen:

boCD1b CC20 ? keine Angabe

CD8 OKT8 IgG2a Lymphos (Subpop.)

CD11b 904

LM2/1 17 BEAR-1

?

PMN PMN PMN PMN

CD11c BU15 ? PMN

CD16 3G8 ? PMN

CD18 1B4

60.3 MHM23 TS1/18

?

PMN PMN PMN PMN

CD35 C3b-R

To5

IgG2a

?

Lymphos (Subpop.) PMN

CD44 S5

Hermes-1 Hutch-1 IM7 P3H9

IgG1 IgG2a

?

keine Angabe keine Angabe keine Angabe keine Angabe keine Angabe

CD62 KC4.1

AC1.2

IgG1

?

Thrombozyten Thrombozyten

Abkürzungen: bo: bovin, CD: cluster of differentiation, Lymphos (Subpop.): Subpopulation von Lymphozyten, mAk: monoklonale(r) Antikörper, PMN: Polymorphkernige Granulozyten, ?: unbekannt

(36)

delt es sich um eine echte Kreuzreaktion (LENNOX 1983).

Binden mAk einer Spezies auf Zellen einer anderen Spezies, zeigen aber ein ande- res Expressionsmuster, so kommt neben der Möglichkeit der Erkennung einer anderen Struktur (s.o.) auch in Betracht, daß die Verteilung desselben Antigens auf bestimmten Zelltypen der untersuchten Spezies anders ist (SOPP u. HOWARD 1997).

Ob nun aber eine echte Kreuzreaktion vorliegt oder nicht, bedarf stets weitergehen- der Untersuchungen, z.B. Molekulargewichtsbestimmungen, Sequenzanalysen oder Funktionsuntersuchungen.

Aufgrund der Spezifität von mAk ist der Erfolg bei Untersuchungen auf Kreuzreaktio- nen häufig nicht sehr groß. So testeten CHABANNE et al. (1994) 78 mAk, die gegen humane Leukozytenantigen gerichtet waren, auf ihre Kreuzreaktivität mit caninen Lym- phozyten. Von diesen 78 mAk reagierten lediglich 9 positiv auf canine Leukozyten.

SCHUBERTH et al. (1996) prüften 308 rinderspezifische mAk auf Kreuzreaktion mit peripheren caninen Blutleukozyten. 30 mAk zeigten eine positive Reaktion, wobei jedoch lediglich für sechs mAk die Spezifität im Rahmen eines Workshops bestätigt waren. Auch zeigten einige der kreuzreaktiven Antikörper auf caninen Zellen andere Verteilungsmuster als auf bovinen Zellen.

(37)

3. Material, Tiere und Methoden

3.1 Geräte und Materialien

3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf Geräte

Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage, Fa. Kloos, Langenhagen/Hannover

Aqua tridest. Aufbereitungsanlage Millipore ZWSO 050 FO, Milli-RO4, Milli- Q I Reagent Grade Water System, D 20 29 230 84, Fa. Millipore, Eschborn/Taunus

Autoklav Typ GE 406 Fa. Getinge AB, Getinge,Schweden Dynal MPC ^® (Magnetic Particle Con-

centrator)-E-1

Deutsche Dynal GmbH (Kat.-Nr.:120.07), Hamburg Eismaschine Typ UBE 30-10 Fa. Ziegra, Isernhagen Electrophoresis Power Supply, ST 305 Fa. GIBCO BRL, Eggenstein Elektrophoresekammer Mini-Protean II

mit Zubehör (Gelgießstand, Glasplat- ten, Spacer, Kämme)

Fa. Bio Rad, München

Fluoreszenz-Durchflußzytometer Modell FACScan^ mit angeschlossener Computereinheit

Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Fluoreszenz-Mikroskop mit Ploemilumi-

nator und Phasenkontrasteinrichtung Okular: Kpl W 12,5

Objektive: Neofluor 16x / 0,4 Neofluor 40x / 0,75 Neofluor 63x / 1,25 Öl Neofluor 100x / 1,25 Öl Filtereinsatz 09:Erregerfilter 450-490 nm Farbteiler 510 nm

Sperrfilter 520 nm

Fa. Zeiss, Oberkochen

Heißluftsterilisator Typ ST 5050 Fa. Heraeus, Hanau Hochgeschwindigkeitszentrifuge

Biofuge 28 RS

Fa. Heraeus, Hanau

(38)

Geräte für Zellkulturarbeiten

Invertmikroskop, Invertoskop D Fa. Carl Zeiss, Oberkochen Laborwaage L 310 Fa. Sartorius, Göttingen Magnetrührer mit Heizplatte,

Modell IKAMAG RH

Fa. Janke und Kunkel, Staufen Mikrotiterplatten-Filterphotometer

ELISA-Reader Dynatech MR 5000

Art. Nr. 992-2000-05, mit angeschlosse- nem Computer und Seikosha-Nadel- drucker

Fa. Dynatech, Denkendorf

Mikrowelle R-4A54 Fa. Sharp Electronics GmBH, Hamburg

pH-Meter Typ 766 Fa. Knick, Berlin

Pipetten, einstellbar

(100-1000 µl, 20–200 µl, 10-100 µl, 1-20 µ)l

Fa. Abimed, Langenfeld

Plattenrüttler

IKA - Mikrotiterplattenschüttler MTS 4

Fa. IKA Labortechnik, Janke und Kunkel GmbH & Co. KG, Staufen

Röhrchen-Schüttler, Typ Reamix Fa. ASID, Unterschleißheim Schalen-Schüttler GFL Fa. Jürgens, Hannover

Vakuumpumpe Fa. Dynatech, Denkendorf

Wasch-/Absauggerät Multi-Reagenz-Waschgerät, Version 1.6, Teile-Nr. 9926-0060-17

Fa. Dynatech, Denkendorf Wasserbad mit Temperaturregelung und

Schütteleinrichtung

Fa. Köttermann, Hannover

Brutschrank mit CO₂- Begasung (Baureihe 5060)

Fa. Heraeus, Hanau

Bunsenbrenner Fireboy Fa. Tecnomara AG, Zürich, Schweiz Einfrierbehälter

Nalgene^TM Cryo Freezing Container

Fa. Nalge Company (Kat.-Nr.:5100- 0001), Rochester, USA

Einmal-Filter, 0,2 µm Fa. Renner (Kat.-Nr.: AX0558-3), Darmstadt

Feuchte Kammer (Plastikbox mit Gittereinsatz)

Eigene Anfertigung

(39)

Klinikbedarf

Laborbedarf

Sterile Werkbank Laminair HL 4228 Fa. Heraeus, Hanau

Zellzählkammer nach Bürker Glaswarenfabrik K. Hecht, Sontheim/Röhn

Kanülen 0,9 x 40 mm, steril Fa. Becton Dickinson

(Kat.-Nr.: 301300450), Heidelberg

Vakutainer Brand Luer Adapters Fa. Becton Dickinson (Kat.-Nr.: 367291), Heidelberg

Vakutainerröhrchen, 5 ml,

Na-Heparin (143 I.E.) beschichtet

Fa. Becton Dickinson (Kat.-Nr.: 606480), Heidelberg

Vakutainer-Systemhalterung Fa. Becton Dickinson (Kat.-Nr.: 607213), Heidelberg

Valu-Set, Luer lok, 21G3/4 (8/10 x 19 mm),

(Perfusionsbesteck mit kurzer Kanüle, flexiblen Bügeln und Sicherheits- schlauch)

Abdeckfolie für ELISA-Platten Fa. Costar GmbH (Kat.-Nr.: 3095), Bodenheim

Combitips biopur, 1,25 ml Fa. Becton Dickinson

(Kat.-Nr.: 38161024), Heidelberg

Einmalpipetten, 10 ml Fa. Renner (Kat.-Nr.: 13017), Darmstadt Filterpapier G B001 + GB 003 Fa. Schleicher u. Schuell GB 001

(Kat.-Nr.: 4263) + GB003 (4268), Dassel

Frischhaltefolie Einzelhandel

Kryoröhrchen 1,8 ml aus Polypropylen Fa. Nunc (Kat.-Nr.: 363 401), Wiesbaden

Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml Fa. Jürgens (Kat.-Nr.: 9.072995), Hannover

(40)

Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden, (steril, Polystyren)

für die Zellkultur

Fa. Costar GmbH (Kat.-Nr.: 3799), Bodenheim

Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden, (unsteril, geringe Zelladhärenz)

für die Membranimmunfluoreszenz

Fa. Nunc (Kat.-Nr.: 439 454), Wiesbaden

Mikrotiterplatten Nunc-Immuno-Plate Maxisorb (Flachboden)

für den ELISA

Fa. Nunc (Kat.-Nr.: 363 401), Wiesbaden

Nylonmembranen, Genescreen plus, Nr. NEF 986001

Fa. Dupont de Nemours, Bad Homburg Pasteurpipetten 230 mm Roth (Kat.-Nr.: 45221.1), Karlsruhe Petrischalen (o90 mm) Fa. Greiner (Kat.-Nr.: 633180),

Frickenhausen

Pipettenspitzen, blau und gelb Fa. Sarstedt (Kat.-Nr.: 70/762002 und 70/760002), Nürnbrecht

Probenröhrchen 12 ml (steril) Fa. Greiner (Kat.-Nr.: 191161), Frickenhausen

Probenröhrchen 4,5 ml (steril) Fa. Greiner (Kat.-Nr.: 120161), Frickenhausen

PVDF (Polyvinyldifluorid)-Blotmembran (Immobilon P^®)

Fa. Millipore (Kat.-Nr.: IPV 4000010), Eschborn

Reaktionsgefäße 1,5 ml Fa. Greiner (Kat.-Nr.: 616201), Frickenhausen

Röhrchen für die Durchflußzytometrie, 5 ml

Sterilfilter, 0,22 µm, Millex GP Fa. Millipore (Kat.-Nr.: SLGPR 25 LS), Eschborn/Taunus

Zellkulturflaschen, 260 ml Fa. Nunc (Kat.-Nr.: 147589), Wiesbaden Zellkulturflaschen, 50 ml Fa. Nunc (Kat.-Nr.: 156367), Wiesbaden Zellkulturplatten 24-well Fa. Costar (Kat.-Nr.: 3524), Wiesbaden Zellkulturplatten 6-well Fa. Greiner (Kat.-Nr.: 657160),

Frickenhausen Zentrifugenröhrchen 15 ml (steril),

Polypropylen

Fa. Greiner (Kat.-Nr.: 188261), Frickenhausen

Zentrifugenröhrchen 50 ml (steril), Polypropylen

Fa. Greiner (Kat.-Nr.: 227261), Frickenhausen