Indirekte Membranimmunfluoreszenz mit Co-capping und

Eine einfache Methode, um zu überprüfen, ob verschiedene Antikörper an die glei-chen Moleküle binden, ist das Einleiten eines Cappings mit anschließender Doppel-markierung. Membranrezeptorproteine vermögen nach Kreuzvernetzung durch Antikörper an einen Zellpol zu wandern. Nach Bindung der Antikörper aggregieren die Zellmembranproteine zunächst zu sog. Patches. Anschließend bewegen sich die Ag-gregate und schließen sich mit anderen Patches zusammen, so daß sie eine regel-rechte Kappe (=Cap) bilden (s. Abb. 10).

Durchführung

Zunächst wurde eine indirekte Membranimmunfluoreszenz wie unter 3.2.12.3 durch-geführt. Es wurden die nach Erythrozytenlyse mit PBS (s. 3.1.4.1) gewaschenen Zellen in eine Mikrotiterplatte pipettiert, abzentrifugiert und 25 µl des unmarkierten, in diesem Fall mAk bekannter Spezifität von Dr. Kremmer (s. 4.3.6), hinzugegeben. Nach 30 mi-nütiger Inkubation auf Eis, wurden die Zellen wie unter 3.2.12.3 beschrieben, allerdings nur mit PBS(!) gewaschen und der FITC-markierte in PBS verdünnte Konjugatantikör-per dazugegeben und ebenfalls 20 min auf Eis inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen nun in SFM0-Medium (s. 3.1.4.2) aufgenommen und im Brutschrank bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Nach15 min wurden 5 µl Zellsuspension pro well herausgenommen und unter dem Mikroskop anhand der Verteilung der grünfluo-reszierenden Aggregate beurteilt, ob bereits ein Capping erfolgt ist. War dies der Fall, wurden die Zellen sofort auf Eis gestellt und mit Natriumazid-haltigem MIF-Puffer (s. 3.1.4.1) dreimal gewaschen, um das dem Capping folgende Shadding, die Absto-ßung des Antikörper-Rezeptor-Komplexes, zu verhindern. Nun wurde der zweite bioti-nylierte (hier: die neu entwickelte) mAk dazugegeben, 30 min auf Eis inkubiert, dreimal mit MIF-Puffer gewaschen und das 1:10 mit PBS verdünnte Streptavidin-Phycoerythrin dazugegeben. Nach 20 minütiger Inkubation und dreimaligem Waschen (s. 3.2.12.3) wurde die Fluoreszenz der an die Zellen gebundenen Antikörper im Mikroskop beur-teilt.

Auswertung:

Anhand der unterschiedlichen Fluoreszenz konnte beurteilt werden, an welche Zel-len die unterschiedlich markierten mAk gebunden haben, und ob sie eventuell am sel-ben Molekül gebunden hasel-ben. Zunächst betrachtet man sich die grünfluoreszierende Kappe einer Zelle, stellt dann den Filter auf Orangefluoreszenz um und schaut, wo der mit Biotin markierte mAk gebunden hat. Er kann auf einer anderen Zelle gebunden

ha-ben, dann leuchtet die Zelle mit der grünen Kappe in der Orangefluoreszenz nicht. Hat er an dieselbe Zelle, aber an ein anderes Molekül gebunden, leuchtet die gleiche Zelle an einer anderen Stelle orange. Erkennen beide Antikörper dasselbe Molekül, leuchtet die Kappe sowohl grün als auch orange.

Abb. 10: Capping

Nach Kreuzvernetzung durch Antikörper aggregieren die Zellmembranprotei-ne zu sog. Patches. Anschließend bewegen sich die Aggregate, schließen sich mit anderen Patches zusammen und bilden an einem Zellpol eine Kap-pe.

Aus: Atlas of Immunology (CRUSE u. LEWIS 1999)

Ausgangs-verteilung

Patching

Capping

4. Ergebnisse

Aus der Vielzahl der durch die Fusion (s. 3.2.7) gewonnenen mAk wurden fünf sta-bile Klone ausgewählt.

Die Ergebnisse der phänotypischen und biochemischen Charakterisierung der fünf neu entwickelten mAk werden hier dargelegt.

4.1 Methodische Vorarbeiten

Der in der Arbeitsgruppe verwendete ELISA wurde von dem kanzerogenen Substrat OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) auf das weniger gefährliche Substrat TMB (3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine) umgestellt.

Zunächst wurde die optimale Konzentration des TMB (s. 3.2.12.1.1) ermittelt (s. Ab-bildung 11):

Abb. 11: Darstellung der konzentrationsabhängigen Extinktionsrate von TMB Es wurde ein indirekter ELISA (s. 3.2.12.1) durchgeführt, um die zur Anpas-sung an die verwendeten Puffer nötige Konzentration des TMB zu ermit-teln.

Dazu wurde eine Mikrotiterplatte mit einem bekannten Antikörper (s. 3.1.3) in einer Endkonzentration von 4 µg/ml beschichtet (s. 3.2.12.1). Die Kon-zentration des Antigens wurde so gewählt, daß eine deutlich positive Reak-tion im ELISA mit dem Substrat OPD (EndkonzentraReak-tion 3 mg/ml) erreicht wurde. Das Konjugat (s. 3.1.3) wurde in einer Endkonzentration von 0,4 µg/

ml eingesetzt. Das Substrat TMB wurde in den oben angegebenen Kon-zentrationen eingesetzt.

Aufgrund der Ergebnisse dieses Versuchs wurde für TMB die Konzentration 150 µg/

ml gewählt, da hierbei der Nachweis des Antigens sensitiv genug gemessen werden konnte, um eine geringe positive Reaktion deutlich anzuzeigen, aber anderseits nicht zu sensitiv, um auch deutlich positive Reaktionen quantitativ im Spektrometer differen-zieren zu können.

Der Vergleich der Sensitivität der Substrate OPD mit TMB wurde ebenfalls in einem ELISA ermittelt. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 12-15 dargestellt.

Konjugatverdünnung 1:100

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

1:300 1:1000 1:3000

Antigenverdünnung

Extinktion

TMB OPD

Konjugatverdünnung 1:300

0 0,5 1 1,5 2 2,5

1:300 1:1000 1:3000

Antigenverdünnung

Extinktion

TMB OPD

Abb. 12-15: Vergleich der Sensitivität der Substrate TMB/OPD

Es wurde ein indirekter ELISA (s. 3.2.12.1) mit identischer Beschichtung und Substratverdünnung durchgeführt. Beschichtet wurde mit einem Zie-ge-anti-Maus- Ak (s. 3.1.3) in der Endkonzentration von 4 µg/ml. Zur Be-stimmung der Sensitivität wurden unterschiedliche Konjugat- und Antigenverdünnungen (s.o.) eingesetzt. Das Antigen (Maus-anti-Rind-Ig aus Zellkulturüberstand) wurde 1:300, 1:1.000 und 1:3.000 verdünnt ein-gesetzt. Der Peroxidase-Konjugat-Antikörper (s. 3.1.3) wurde in vier Ver-dünnungsstufen eingesetzt (1:100, 1:300, 1:1.000, 1:3.000). Das Substrat OPD wurde in der Endkonzentration von 3 mg/ml, das Substrat TMB in der ermittelten Endkonzentration von 150 µg/ml eingesetzt.

Konjugatverdünnung 1:1000

0 0,4 0,8 1,2 1,6 2

1:300 1:1000 1:3000

Antigenverdünnung

Extinktion

TMB OPD

Konjugatverdünnung 1:3000

0 0,25 0,5 0,75

1:300 1:1000 1:3000

Antigenverdünnung

Extinktion

TMB OPD

Abkürzungen: Ig: Immunglobuline

OPD: o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid TMB: 3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine

TMB hatte bei allen eingesetzten Antigen- und Konjugatverdünnungen eine höhere Sensitivität als OPD. Aus diesem Grund wurde nun standardmäßig das weniger ge-fährliche TMB als Substrat für den ELISA eingesetzt (s. 3.2.12.1).

4.2 Gewinnung von monoklonale Antikörpern

Zur Herstellung von mAk sind folgende Entwicklungsschritte erforderlich:

- Immunisierung einer Maus eines geeigneten Mäusestammes (hier Balb/c-Maus, s. 3.1.12) mit dem Antigen (hier ConA-aktivierte mononukleäre Zellen des Hundes, s. 3.2.4)

- Überprüfung der Immunantwort durch Bestimmung des Titers in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3)

- Gewinnung von Milzzellen der hinreichend immunreaktiven Maus und Fusion mit geeigneten, möglichst syngenen Mausmyelomzellen (hier X63.Ag8.653, s. 3.2.7) - Heranzüchten der erfolgreich fusionierten Hybridomzellen in geeignetem

Selekti-onsmedium (hier SFM-Medium mit Zusatz von HAT, s. 3.1.4.2)

- Prüfung der Kulturen, die gewünschte Antikörper produzieren und in den Zellkul-turüberstand sezernieren (s. 3.2.12)

- Klonierung der Zellen, die gewünschte Antikörper produzieren (s. 3.2.13)