3. Material, Tiere und Methoden
4.3 Charakterisierung der gewonnenen monoklonalen Antikörper
4.3.9 Vergleich der prozentualen Anteile und mittleren Fluoreszenz-
Membran-immunfluoreszenz erkannter Zellen
Zur besseren Vergleichbarkeit sind in Tabelle 16 die Prozentzahlen der von den neu entwickelten mAk erkannten Zellpopulationen und die Prozentzahlen der von den ähn-lich reagierenden bekannten mAk erkannten Zellpopulationen miteinander vergähn-lichen.
Die ähnlichen Bindungseigenschaften der zusammengefaßten mAk bestätigen sich größtenteils auch in Hinblick auf die Prozentzahl der erkannten Zellpopulationen.
So zeigte der mAk 2A3 nahezu identische Prozentzahlen wie der bekannte mAk Dog27 (unbekannte Spezifität). Dog28 (unbekannte Spezifität) zeigte ebenfalls die gleiche Prozentzahl in Bezug auf erkannte Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten Tabelle 16: Vergleich der prozentualen Anteile der von den neu entwickelten und
bekannten mAk erkannten positiven Zellen mAk Granulozyten
Vergleich der nach indirekter Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) im Durchfluß-zytometer (s. 3.2.12.2) ermittelten Anteile positiver Zellen.
und Blasten. Lediglich in der Prozentzahl positiver Thrombozyten unterschieden sie sich quantitativ. Der mAk Dog16 (unbekannte Spezifität) zeigte im phänotypischen Bild zwar ebenfalls ein ähnliches Verteilungsmuster auf Monozyten, Lymphozyten und Bla-sten wie der neu entwickelte mAk 2A3. Allerdings hat er an eine größere Anzahl von Granulozyten gebunden und war negativ auf Thrombozyten.
2B5 und die ihm in der Reaktivität ähnlichen bekannten mAk Dog25 (CD45 o.
CD45RA), Dog34 (CD45 o. CD45RA) und Dog36 (CD45 o. CD45RA) reagierten alle annähernd gleich auf Granulozyten und Monozyten. Schwankungen gab es in Bezug auf das Bindungsverhalten auf Lymphozyten und Blasten. Daher müssen weitere Un-tersuchungen zur Abklärung durchgeführt werden.
4A6 und Dog20 (CDw41) unterschieden sich in ihrer Reaktivität auf Blasten etwas deutlicher und auch ihr Bindungsverhalten auf Thrombozyten sprach gegen ein ge-meinsam erkanntes Molekül. So erkannte Dog20 65% der Thrombozytenpopulation wogegen 4A6 negativ reagierte.
3C2 schließlich zeigte sowohl im Dotplot als auch in der ermittelten Prozentzahl po-sitiver Zellen große Übereinstimmung mit dem bekannten mAk Dog10 (CD8). Dagegen war die Ähnlichkeit mit Dog18 (T-Zell-Rezeptor assoziiert) in Bezug auf die Anzahl po-sitiver Zellen deutlich geringer.
Zur Feindifferenzierung der Ähnlichkeiten wurde die mittlere Fluoreszenzintensität der jeweils erkannten Zellpopulationen bestimmt und in bezug zur Prozentzahl der er-kannten Zellen miteinander verglichen (s. Abb. 18).
141
Abb. 18: Vergleich der Prozent positiver Zellen in bezug zur mittleren Fluoreszenzintensität
Nach Immunisierung mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) von Mäusen gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s. 3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Mem-branimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf caninen Zellen des peri-pheren Blutes (s. 3.2.1) sowie auf ConA aktivierten Blasten (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchflußzytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Die Prozent der erkannten Zellen sind in Bezug zur mittleren Fluoreszenzinten-sität (logarithmische Darstellung der positiven Kanäle im Durchflußzytometer, s. 3.2.12.2) aufgetragen.
2A3
erkannte Zellen
Thrombozyten Granulozyten Blasten Monozyten Lymphozyten
1000 mittlere Fluoreszenzintensität
Dog 27
erkannte Zellen
2000 Thrombozyten Granulozyten Blasten Monozyten Lymphozyten 1000
mittlere Fluoriszenzintensität
142
Abb. 18: (Forts.) Vergleich der Prozent positiver Zellen in bezug zur mittleren Fluoreszenzintensität
Nach Immunisierung mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) von Mäusen gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s. 3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Mem-branimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf caninen Zellen des peri-pheren Blutes (s. 3.2.1) sowie auf ConA aktivierten Blasten (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchflußzytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Die Prozent der erkannten Zellen sind in Bezug zur mittleren Fluoreszenzinten-sität (logarithmische Darstellung der positiven Kanäle im Durchflußzytometer, s. 3.2.12.2) aufgetragen.
2B5
erkannte Zellen
1000 Thrombozyten
Granulozyten Blasten Monozyten Lymphozyten 70%
mittlere Fluoreszenzintensität mittlere Fluoreszenzintensität
Dog 25
erkannte Zellen
2000 Thrombozyten Granulozyten Blasten Monozyten Lymphozyten 1000
143
Abb. 18: (Forts.) Vergleich der Prozent positiver Zellen in bezug zur mittleren Fluoreszenzintensität
Nach Immunisierung mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) von Mäusen gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s. 3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Mem-branimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf caninen Zellen des peri-pheren Blutes (s. 3.2.1) sowie auf ConA aktivierten Blasten (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchflußzytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Die Prozent der erkannten Zellen sind in Bezug zur mittleren Fluoreszenzinten-sität (logarithmische Darstellung der positiven Kanäle im Durchflußzytometer, s. 3.2.12.2) aufgetragen.
2B5
erkannte Zellen
1000 Thrombozyten
Granulozyten Blasten Monozyten Lymphozyten
mittlere Fluoreszenzintensität
erkannte Zellen
2000 Thrombozyten Granulozyten Blasten Monozyten Lymphozyten 1000
0%
mittlere Fluoreszenzintensität
144
Abb. 18: (Forts.) Vergleich der Prozent positiver Zellen in bezug zur mittleren Fluoreszenzintensität
Nach Immunisierung mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) von Mäusen gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s. 3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Mem-branimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf caninen Zellen des peri-pheren Blutes (s. 3.2.1) sowie auf ConA aktivierten Blasten (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchflußzytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Die Prozent der erkannten Zellen sind in Bezug zur mittleren Fluoreszenzinten-sität (logarithmische Darstellung der positiven Kanäle im Durchflußzytometer, s. 3.2.12.2) aufgetragen.
2B5
erkannte Zellen
1000 Thrombozyten
Granulozyten Blasten Monozyten Lymphozyten 70%
mittlere Fluoreszenzintensität
Dog 36
erkannte Zellen
2000 Thrombozyten Granulozyten Blasten Monozyten Lymphozyten
80% 368
1000 0%
mittlere Fluoreszenzintensität
145
Abb. 18: (Forts.) Vergleich der Prozent positiver Zellen in bezug zur mittleren Fluoreszenzintensität
Nach Immunisierung mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) von Mäusen gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s. 3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Mem-branimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf caninen Zellen des peri-pheren Blutes (s. 3.2.1) sowie auf ConA aktivierten Blasten (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchflußzytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Die Prozent der erkannten Zellen sind in Bezug zur mittleren Fluoreszenzinten-sität (logarithmische Darstellung der positiven Kanäle im Durchflußzytometer, s. 3.2.12.2) aufgetragen.
974
erkannte Zellen
48%
1000 Thrombozyten
Granulozyten Blasten Monozyten Lymphozyten
55% 816
mittlere Fluoreszenzintensität
erkannte Zellen
2000 Thrombozyten Granulozyten Blasten Monozyten Lymphozyten
48% 289
492
1000 0%
46%
mittlere Fluoreszenzintensität
Betrachtet man die Ergebnisse, so kann man sehen, daß bei zwei der selbstentwik-kelten mAk große phänotypische Übereinstimmungen mit den getesteten bekannten mAk bestehen. Sowohl in bezug auf die Fluoreszenzintensität der einzelnen Zellpopu-lation als auch in der prozentualen Verteilung der erkannten Zellen bestehen große Ähnlichkeiten zwischen 2A3 und Dog27 bzw. 3C2 und Dog10. Im Gegensatz dazu sind die Übereinstimmungen der restlichen miteinander verglichenen mAk nicht so groß.
Die mAk Dog25, Dog34 und Dog36 zeigen zwar untereinander relativ große Ähnlich-keiten (alle haben die Spezifität CD45R o. CD45RA), im Vergleich zu 2B5 unterschei-den sie sich jedoch vor allem in bezug auf die Fluoreszenzintensität.
4.3.10 Vergleich des Bindungsverhaltens der neu entwickelten mit bekannten