Prüfung der Hybridomzellkulturen auf die Produktion spezifischer

Um zu überprüfen, welche Zellkulturen weitergeführt werden sollen, wurde zunächst ein ELISA (s. 3.2.12.1) auf Antikörperproduktion durchgeführt. Positive Überstände wurden im nächsten Schritt auf ihre Spezifität hin überprüft. Dazu wurde eine indirekte Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) durchgeführt. Positiv auf Hundeleukozyten reagierende Kulturen wurden daraufhin kloniert (s. 3.2.13).

3.2.12.1 Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay (ELISA)

3.2.12.1.1 Optimierung des Substrats 3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine an die gegebenen Puffersysteme

Zur Überprüfung der Kulturüberstände der Hybridomzellen auf Produktion von Im-munglobulinen wurde ein asymmetrischer ELISA durchgeführt.

Da zu Beginn dieser Untersuchungen in der Arbeitsgruppe für den ELISA das als kanzerogen (BOS et al. 1981) bekannte Substrat o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (OPD) verwendet wurde, sollte zuerst eine weniger gefährliche Alternative gesucht werden. In der Literatur wurde das Substrat 3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine (TMB) als geeignete Alternative empfohlen (MADERSBACHER u. BERGER 1991). Daher sollte der ELISA von OPD auf TMB umgestellt werden, ohne die bis dahin optimierten Puf-fersysteme zu verändern.

Zunächst sollte die optimale Konzentration des TMB ermittelt werden, um einen sen-sitiven Nachweis von gebundenem Konjugat mit den gegebenen Puffersystemen zu erzielen. Es sollte eine geeignete Konzentration ermittelt werden, bei der schon gerin-ge Konzentrationen eine deutlich positive Reaktion ergerin-geben, und andererseits auch stark positive Reaktionen noch quantitativ im Spektrometer differenziert werden kön-nen.

Durchführung

Es wurde eine Flachboden-Mikrotiterplatte (s. 3.1.1) mit 100 µl/well des Beschich-tungsantikörpers (Ziege-anti-Maus Ig G (H + L), s. 3.1.6) beschichtet. Die Endkonzen-tration des in ELISA-Beschichtungspuffer (A-Puffer, s. 3.1.4.1) verdünnten Antikörpers betrug 4 µg/ml. Die beschichtete Mikrotiterplatte wurde mit einer Abdeckfolie für ELISA-Platten (s. 3.1.1) abgedeckt, zunächst bei RT für eine Stunde auf den Mikroti-terplattenschüttler (s. 3.1.1) gestellt und anschließend bei + 4° C über Nacht inkubiert.

Anschließend wurde die Platte dreimal von Hand mit einer Eppendorfpipette gewa-schen (350 µl A-Puffer pro well). Die freien Bindungsstellen wurden durch Zugabe von 100 µl/well 1% iger Gelatine (s. 3.1.6) während einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei RT (mit Abdeckfolie abgedeckt auf dem Mikrotiterplatten-Schüttler) geblockt. Da-nach wurde die Platte fünfmal in einem automatischen Mikrotiter-Waschsystem (s. 3.1.1) mit B-Puffer (s. 3.1.4.1) gewaschen und die Restflüssigkeit aus der Platte auf einem Handtuch gründlich ausgeschlagen. Anschließend wurden 75 µl/well der unver-dünnten zu testenden Überstände pipettiert. Die Inkubationszeit betrug 45 Minuten bei RT, ebenfalls mit Abdeckolie abgedeckt auf dem Schüttler. Nach fünfmaligem Wa-schen in dem automatiWa-schen Mikrotiter-Waschsystem mit B-Puffer und gründlichen Ausschlagens wurden 75 µl eines Peroxidase konjugierten Ziege-anti-Maus Ig G + M (H + L) (Endkonzentration 0,4 µg/ml, verdünnt in B-Puffer, s. 3.1.6) pro well dazugege-ben und 45 Minuten abgedeckt auf dem Schüttler bei RT inkubiert. Nach Entfernen der nicht gebundenen Antikörper durch fünfmaliges Waschen in dem automatischen Mi-krotiter-Waschsystem mit B-Puffer und gründlichen Ausschlagens wurden 75 µ/well Substrat 3,3´,5,5´-Tertramethylbenzidine (TMB) (s. 3.1.6) in den Konzentrationen von 80 µg/ml, 100µg/ml, 150 µg/ml und 300 µg/ml gelöst in C-Puffer (s. 3.1.4.1) +

Wasser-stoffperoxid (40 µl 3%-ige H₂O₂ /11 ml Substratlösung, s. 3.1.6) zugegeben. Die Inku-bation erfolgte zur Vermeidung von Spontanreaktionen 20 Minuten im Dunkeln, bei RT.

Die Reaktion wurde mit 50 µl/well 1 N Schwefelsäure (s. 3.1.2) gestoppt.

Auswertung

Anhand der photometrisch gemessenen Extinktion im ELISA-Reader wurde eine op-timale Endkonzentration von 150 µg/ml ermittelt.

3.2.12.1.2 Asymmetrischer Standard-ELISA Durchführung

Es wurde eine Flachboden-Mikrotiterplatte (s. 3.1.1) mit 100 µl/well des Beschich-tungsantikörpers (Ziege-anti-Maus Ig G (H + L), s. 3.1.6) beschichtet. Die Endkonzen-tration des in ELISA-Beschichtungspuffer (A-Puffer, s. 3.1.4.1) verdünnten Antikörpers betrug 4 µg/ml. Die beschichtete Mikrotiterplatte wurde mit einer Abdeckfolie für ELISA-Platten (s. 3.1.1) abgedeckt, erst bei RT für eine Stunde auf den Mikrotiterplat-tenschüttler (s. 3.1.1) gestellt und anschließend bei + 4° C über Nacht inkubiert. An-schließend wurde die Platte dreimal von Hand mit einer Eppendorfpipette gewaschen (350 µl A-Puffer pro well). Die freien Bindungsstellen wurden durch Zugabe von 100 µl/

well 1% iger Gelatine (s. 3.1.6) während einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei RT, mit Abdeckfolie abgedeckt auf dem Mikrotiterplatten-Schüttler, geblockt. Danach wur-de die Platte fünfmal in einem automatischen Mikrotiter-Waschsystem (s. 3.1.1) mit B-Puffer (s. 3.1.4.1) gewaschen und die Restflüssigkeit aus der Platte auf einem Hand-tuch gründlich ausgeschlagen. Anschließend wurden 75 µl/well der unverdünnten zu testenden Überstände pipettiert. Die Inkubationszeit betrug 45 Minuten bei RT, eben-falls mit Abdeckolie abgedeckt auf dem Schüttler. Nach fünfmaligem Waschen in dem automatischen Mikrotiter-Waschsystem mit B-Puffer und gründlichen Ausschlagens wurden 75 µl eines Peroxidase konjugierten Ziege-anti-Maus Ig G + M (H + L) (End-konzentration 0,4 µg/ml, verdünnt in B-Puffer, s. 3.1.6) pro well dazugegeben und 45 Minuten abgedeckt auf dem Schüttler bei RT inkubiert. Nach Entfernen der nicht ge-bundenen Antikörper durch fünfmaliges Waschen in dem automatischen Mikrotiter-Waschsystem mit B-Puffer und gründlichen Ausschlagens wurden 75 µ/well Substrat 3,3´,5,5´-Tertramethylbenzidine (TMB) (s. 3.1.6) in einer Konzentration von 150 µg/ml gelöst in C-Puffer (s. 3.1.4.1) + Wasserstoffperoxid (40 µl 3%-ige H₂O₂ / 11 ml Sub-stratlösung, s. 3.1.6) zugegeben. Die Inkubation erfolgte zur Vermeidung von Spont-anreaktionen 20 Minuten im Dunkeln, bei RT. Die Reaktion wurde mit 50 µl/well 1 N Schwefelsäure (s. 3.1.2) gestoppt.

Auswertung

Die photometrische Auswertung erfolgte in einem ELISA-Reader mit Computerein-heit (s. 3.1.1) im Dualmodus bei 450nm (Testfilter) und 520 nm (Referenzfilter).

3.2.12.2 Durchflußzytometrie

Mit dem Durchflußzytometer (FACScan^®, s. 3.1.1) kann man von einer großen Zell-zahl in kürzester Zeit mehrere Parameter zur Charakterisierung erfassen. Das Prinzip beruht darauf, daß ein Flüssigkeitsstrahl mit Überdruck durch eine Stahlkapillare ge-schickt und beschleunigt wird. Dadurch werden die Zellen vereinzelt und kreuzen dann einen Argon-Ionen-Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm. Das dadurch ge-streute Licht unveränderter Wellenlänge wird zum einen in Richtung des Strahls (Vor-wärtsstreulicht, Forward Scatter, FSC) und im 90°-Winkel dazu (Seit(Vor-wärtsstreulicht, Side Scatter, SSC) aufgefangen, in elektronische Signale umgewandelt und an den Computer weitergeleitet. Die Vorwärtsstreuung ist dabei abhängig von Form, Durch-messer und Oberflächenstruktur ("Größe"), die Seitwärtsstreuung von der Oberflä-chenbeschaffenheit und Granularität ("Komplexität") einer Zelle. Somit ist eine Charakterisierung aufgrund mehrerer morphologischer Parameter einer Zelle möglich (s. Abb 5).

Abb. 5: Durchflußzytometrie

Darstellung der Leukozyten im FACScan^® in Zweiparameterdarstellung (SSC/

FSC)

R1: Lymphozyten, R2: Monozyten, R3: Granulozyten

Zusätzlich zu den Streulichtsignalen mißt das Gerät Fluoreszenzlichtemmisionen.

Durch Markierung der Zellen mit bis zu drei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, die sich bei 488 nm anregen lassen, erfolgt eine weitere Charakterisierung. Die Detek-toren werden dazu bei unterschiedlichen Wellenlängen angesprochen. „FL1” mißt im

R 1 R 2

R 3

Bereich von 515 -545 nm (Grünfluoreszenz), „FL2” von 564 - 606 nm (Orangefluores-zenz) und „FL3” schließlich mißt Wellenlängen von > 650 nm (Rotfluores(Orangefluores-zenz).

Die ermittelten Daten wurden computergestützt mit dem Programm „WinMDI Versi-on 2.8” ausgewertet.

3.2.12.3 Indirekte Membranimmunfluoreszenz

Zur Beurteilung der von den produzierten Antikörpern erkannten Epitope wurde eine indirekte Membranimmunfluoreszenz durchgeführt. Dabei reagierten die Antikörper mit ihrem Molekül und es konnte durchflußzytometrisch beurteilt werden, auf welchen Zel-len sich dieses Molekül befindet.

Durchführung

Die folgenden Arbeitsschritte wurden unter unsterilen Bedingungen durchgeführt.

Leukozyten (nach Erythrozyten-Lyse s. 3.2.1) bzw. 72 Stunden Blasten (s. 3.2.4) wurden jeweils in einem 12 ml Zentrifugenröhrchen (s. 3.1.1) auf eine Konzentration von 4 x 10⁶ / ml in PBS (s. 3.1.4.1) eingestellt. Von diesen Zellsuspensionen bzw. von der Thrombozytensuspension (s. 3.2.2) wurden jeweils 25 µl/well mit einer Eppendorf-pipette (s. 3.1.1) in eine 96-well Rundbodenmikrotiterplatte (s. 3.1.1) pipettiert. Das ent-sprach einer Zellkonzentration von 1 x 10⁵ Zellen/well. Die Mikrotiterplatte wurde fünf Minuten bei 221 x g und 4°C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Nun wurden je 25 µl des zu testenden unverdünnten Kulturüberstandes mit einer Eppendorfpipette auf die Zellen pipettiert und auf einem Rüttelgerät (s. 3.1.1) resuspendiert. Die Inkuba-tion erfolgte 20 Minuten auf Eis. Nach der InkubaInkuba-tion wurden die Zellen mit Hilfe einer Eppendorfpipette mit 150 µl MIF-Puffer (s. 3.1.7) gewaschen, fünf Minuten bei 221 x g und 4°C abzentrifugiert und der Überstand verworfen, um den überschüssigen Kul-turüberstand zu entfernen. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Nun wur-den 25 µl/well des 1:100 verdünnten (Endkonzentration 1,5 µg/ml) Fluores-zeinisothiozyanat (FITC) konjugierten Ziege-anti-Maus IgG + IgM (H + L, s. 3.1.3) Kon-jugatantikörpers auf die Zellen gegeben. Die Inkubation erfolgte wiederum 20 Minuten bei + 4°C im Dunkeln. Anschließend wurde die Platte wie oben beschrieben dreimal mit MIF-Puffer gewaschen, um nicht gebundenes Konjugat zu entfernen. Die Zellen wurden mit einer Eppendorfpipette in 200 µl Sheath-Puffer + Propidiumjodid (s.3.1.7) resuspendiert, in ein spezielles 5 ml Röhrchen für die Durchflußzytometrie (s. 3.1.1) überführt und im FACScan^® (s. 3.1.1) gemessen.

Auswertung

Um eine unspezifische Bindung der mAk auszuschließen, wurden Isotypkontrollen eingesetzt. Die Isotypkontrollen, die im Isotyp-ELISA positiv in der indirekten Mem-branimmunfluoreszenz auf caninen Zellen jedoch negativ waren, wurden aus dersel-ben Fusion gewonnen und kloniert (s. 3.2.13).

Anhand der nachgewiesenen Fluoreszenz konnten die positiven Proben festgestellt werden (s. Abb. 6). Zur Negativkontrolle wurde kein Probenantikörper gegeben, son-dern lediglich der Konjugatantikörper, um zu kontrollieren, ob dieser unspezifisch auf den Zellen bindet, und somit falsch positive Werte übermittelt.

Abb.6: Indirekte Membranimmunfluoreszenz

Darstellung der Leukozyten im FACScan^® in Zweiparameterdarstellung (SSC/

FL1)

R1: Granulozyten / R2: Monozyten / R3: Lymphozyten

Durch die Zunahme der Fluoreszenzintensität wird eine positive Reaktion des eingesetzten mAk deutlich