Bestimmung des Molekulargewichts mit Hilfe von Protein A

Eine weitere Möglichkeit, um das Molekulargewicht der erkannten Moleküle zu be-stimmen ist, die lysierte Zellmembran über die Kopplung der mAk an Protein A Dyna-beads^® (s. 3.2.5.6) zu gewinnen. Protein A bindet in erster Linie IgG2a, IgG2b und IgG3, während IgG1 nur schwach gebunden wird. Von den nicht im Immunoblot rea-gierenden mAk war 4A6 vom Isotyp IgG2b und damit zur Bindung an Protein A geeig-net.

Das über die Eluierung von dem an die Dynabeads^® gekoppelten mAk 4A6 gewon-nene Molekül hatte ein Molekulargewicht von ca. 58 kD.

Das Ergebnis der Molekulargewichtsbestimmung des mAk 4A6 ist in Tabelle Tabelle 19 zu sehen.

Weil nicht alle mAk vom Isotyp IgG1 im Immunoblot etwas erkannten, wurde auch versucht, einen IgG1 Antikörper bekannter Konzentration und Spezifität an die Dyna-beads^® zu koppeln. Es stellte sich jedoch heraus, daß Antikörper vom Isotyp IgG1 in nicht ausreichender Konzentration an die Protein A Dynabeads^® gebunden haben und somit die von ihnen erkannten Moleküle auf diese Weise nicht aufzureinigen und zu charakterisieren waren.

Tabelle 19: Ergebnisse des Immunoblots zur Bestimmung des Molekulargewichts des von dem mAk 4A6 erkannten Moleküls

mAk MG Erkanntes Epitop unter unreduzierten Bedingungen

4A6 ~ 58

94→

67→

43→

30→

Standard/Leukos

Immunoblot-Analyse zur Bestimmung des Molekulargewichts der erkannten Moleküle nach Eluierung über Protein A Dynabeads^®.

Es wurde der mAk 4A6 kovalent an Protein A- Dynabeads^® gekoppelt (s. 3.2.5.6) und durch Zugabe der mittels Triton-X gelösten (s. 3.2.5.4) Zell-membranbestandteile das zugehörige Zielmolekül spezifisch herausgefischt.

Das Zielmolekül wurde anschließend eluiert und im SDS-Gel (s. 3.2.5.2) auf-getrennt, anschließend auf eine Membran geblottet (s. 3.2.5.5) und mit dem mAk 4A6 inkubiert.

Abkürzungen: mAk: monoklonaler Antikörper, MG: Molekulargewicht, kD: Kilo-dalton, Leukos: Leukozyten

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß fünf neue monoklonale Antikörper gegen canine Zelloberflächenstrukturen entwickelt wurden, die alle ein unterschiedliches Ver-teilungsmuster auf ruhenden caninen Leukozyten, mit ConA aktivierten mononukle-ären Zellen und Thrombozyten zeigten. Es wurde der Isotyp bestimmt und durch biochemische Charakterisierung von drei der durch die mAk erkannten Molekülen das Molekulargewicht bestimmt.

Der mAk 1D2, welcher auf allen Leukozyten und aktivierten Zellen und einer Subpo-pulation von Thrombozyten bindet, erkennt ein Molekül mit einem Molekulargewicht von ca. 85 kD. Das erkannte Epitop liegt in diskontinuierlicher Anordnung (ein sog.

Konformationsepitop) vor.

Der mAk 2A3 bindet ebenfalls an ein diskontinuierliches Epitop, welches auf einem Molekül unbekannter Größe liegt. Das erkannte Molekül wird auf Lymphozyten, Mono-zyten, GranuloMono-zyten, aktivierten mononukleären Zellen und einer Subpopulation von Thrombozyten in unterschiedlicher Dichte exprimiert.

Die von dem mAk 2B5 erkannte Struktur hat ebenfalls ein Molekulargewicht unbe-kannter Größe und wird auf Monozyten und jeweils einer Subpopulation von Lympho-zyten und aktivierten Zellen exprimiert. Das von 2B5 erkannte Epitop ist ebenfalls ein Konformationsepitop. Eine vergleichende Untersuchung mit einem bekannten mAk ge-gen canine Zelloberflächenstrukturen zum Verteilungsmuster, zeigt eine Ähnlichkeit mit einem anti-CD45R- oder anti-CD45RA-Antikörper.

Dagegen erkennt der mAk 3C2 ein Molekül mit einem Molekulargewicht von ca. 35 kD, welches lediglich auf einer Subpopulation von Lymphozyten und aktivierten Zellen exprimiert wird. Alle hier durchgeführten Untersuchungen sprechen dafür, daß der mAk 3C2 das CD8-Molekül des Hundes erkennt, vermutlich am selben Epitop wie der bereits bekannte mAk Dog10.

Der neu entwickelte mAk 4A6 schließlich bindet auf Zellen der myeloischen Reihe und auf einer Subpopulation aktivierter Zellen. Das erkannte Molekül mit einem Mole-kulargewicht von ca. 58 kD wird auf allen erkannten Zellen in geringer, aber gleich-mäßiger Dichte exprimiert.

5. Diskussion

Leukozyten exprimieren neben MHC-Molekülen und Antigenrezeptoren Zelloberflä-chenmoleküle, die als Differenzierungsantigene oder CD-Moleküle bezeichnet werden.

Zur Untersuchung dieser Moleküle bedient man sich mAk wegen ihrer hohen Spezifi-tät.

Beim Hund liegen, im Vergleich zum Menschen, nur wenige Daten über nachgewie-sene CD-Moleküle vor. Ein Grund ist das Fehlen einer ausreichenden Zahl an mAk.

Auch kreuzreagierende Antikörper lieferten nur unbefriedigende Ergebnisse. Dabei ist der Hund sowohl als Patient als auch stellvertretend für den Menschen für die Erfor-schung des Immunsystems und immunbedingter Erkrankungen von Interesse.

Um aber phänotypische Untersuchungen, wie in der Humanmedizin bereits üblich, klinisch zu etablieren, müssen die dazu notwendigen Reagenzien (z.B. mAk) verfügbar und normale Parameter ermittelt sein.

Ziel dieser Arbeit war daher, neue monoklonale Antikörper gegen Oberflächenstruk-turen von Leukozyten beim Hund zu entwickeln und deren ZielstrukOberflächenstruk-turen phänotypisch auf ihre Verteilung im peripheren Blut sowie biochemisch zu charakterisieren. Dazu wurden Milzzellen einer mit caninen Lymphoblasten immunisierten Maus mit syngenen Myelomzellen fusioniert. Fünf stabil wachsende und Antikörper-produzierende Hybri-domzellklone wurden aus dieser Fusion für die Charakterisierung ausgesucht.

In vergleichenden Untersuchungen zeigen einige CD-Moleküle verschiedener Spe-zies gute Korrelationen zu humanen CD-Molekülen in Verteilung, Molekulargewicht und Funktion, so daß daraus Rückschlüsse von Ergebnissen der neu entwickelten mAk in Bezug auf Bindungseigenschaften und Molekulargewicht zu in anderen Spezi-es bekannten CD-Molekülen gezogen werden können (WILLIAMS 1997).

5.1 Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 1D2

Der mAk 1D2 vom Isotyp IgG1 bindet an einem weit verbreitetem Molekül (MG: 85 kD) auf peripheren Blutzellen (Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten, Subpopulati-on Thrombozyten, aktivierte mSubpopulati-onSubpopulati-onukleäre Zellen). Die erkannte Zielstruktur wird auf allen erkannten Zellen in gleichmäßiger Dichte exprimiert.

Orientiert man sich allein an den Bindungseigenschaften des mAk 1D2, kommen mehrere potentielle CD-Moleküle, die er erkennen könnte, in Frage, wie z.B CD11a, CD18, CD29, CD44, CD45, CD47, CD48, CD50, CD52, CD53, CD58, CD59, CD82, CD120a, CD120b, CD130 und CD147.

Davon können vermutlich ausgeschlossen werden: CD11a (HOGG u. MARTZ 1999), CD48 (LO u. SANDRIN 1999) und CD53 (CONJEAUD et al. 1999), da sie im Gegensatz zum vom mAk 1D2 erkannten Molekül bisher bei keiner anderen Spezies auf Thrombozyten gefunden wurden. Ob sie auf caninen Thrombozyten ebenfalls nicht exprimiert werden, ist bisher unbekannt. Weiterhin kommen folgende CD-Moleküle aufgrund ihrer Expression auf Erythrozyten (auf humanen Zellen) wahrscheinlich nicht in Frage: CD58 (TAKEUCHI et al. 1997), CD59 (LOVELAND et al. 1997), CD120a, CD120b (SUGAMURA et al. 1997), CD130 (TAGA u. KUMANOGO 1997) und CD147 (STOKKINGER et al. 1997). Auch hier bleibt zu prüfen, ob diese CD-Moleküle auch auf caninen Erythrozyten exprimiert werden.

Auf caninen Leukozyten und Thrombozyten werden caCD18, caCD44 (COBBOLD u. METCALFE, 1994), auf entsprechenden humanen Zellen CD45, CD47, CD50 und CD52 (BARCLAY et al. 1993) exprimiert.

Eine Einbeziehung der Verteilung auf stimulierten mononukleären Zellen ermöglich-te keinen weiermöglich-teren Ausschluß, da alle verdächtigen Moleküle auch auf aktivierermöglich-ten Zel-len exprimiert werden.

Bezieht man das Molekulargewicht des Moleküls in den Vergleich samt den anhand des Verteilungsmusters in Frage kommenden CD-Moleküle mit ein, kommen CD18 und CD44 als potentielle Zielstrukturen am ehesten in Frage.

CD18, die β₂-Untereinheit der Integrine, wurde von DANILENKO et al. (1992) auf caninen Zellen untersucht. Sie beschreiben zwar nicht, ob CD18 auf Thrombozyten ex-primiert wird, im Rahmen des "First International Canine Leukocyte Antigen Workshop"

(CLAW) wird aber eine schwache Expression auf Thrombozyten angegeben (COBBOLD u. METCALFE 1994). DANILENKO et al. (1992) haben allerdings gezeigt, daß CD18 auf caninen Granulozyten und Monozyten fünfmal stärker exprimiert wird als

auf caninen Lymphozyten. 1D2 zeigte aber eine gleichmäßige Reaktion auf Lympho-zyten und GranuloLympho-zyten und eine starke Expression auf ThromboLympho-zyten, so daß CD18 als potentielles Molekül wenig wahrscheinlich ist.

CD44 bindet Hyaluronsäure und vermittelt die Adhäsion der Leukozyten.

ALLDINGER et al. (1999) beschreibt für CD44 eine Verteilung auf caninen Leukozy-ten von 99,5% auf GranulozyLeukozy-ten und 93,5% auf LymphozyLeukozy-ten. Dieses stimmt in etwa mit dem Verteilungsmuster von 1D2 überein (100% bzw. 98%). Er hat aber ebenfalls nicht beschrieben, ob CD44 beim Hund auf Thrombozyten exprimiert wird. Aber auch für CD44 wurde eine Expression auf Thrombozyten mit den Workshopantikörpern nachgewiesen. Für das humane System dagegen haben LIAO u. PATEL (1999) eine Expression von CD44 auf Thrombozyten explizit ausgeschlossen. Laut COBBOLD u.

METCALFE (1994) wird caCD44 auf aktivierten T-Zellen stärker exprimiert. Das vom mAk 1D2 erkannte Molekül wird aber nach ConA-Aktivierung nicht heraufreguliert.

Somit ist auch CD44 als möglicherweise erkannte Zielstruktur eher unwahrschein-lich.

Es bleibt zu prüfen, ob der mAk ein bisher unbekanntes Molekül erkennt, oder ob er ein bereits bekanntes CD-Molekül erkennt, welches auf caninen Zellen nur ein anderes Verteilungsmuster als auf humanen Zellen zeigt. Zur Abklärung der von mAk 1D2 er-kannten Struktur bedarf es daher eingehender Untersuchungen, insbesondere eine Aminosäuresequenzierung.