Vergleich des Bindungsverhaltens der neu entwickelten mit

Drei der fünf neu entwickelten mAk zeigten Ähnlichkeiten mit bekannten mAk.

Der Durchführung der Doppelfärbung in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.20) lag folgende Überlegung zugrunde: Wenn zwei mAk (hier: der neu entwik-kelte und der bekannte mAk) auf derselben Zelle binden, wird diese Zelle doppelt (hier grün und orange fluoreszierend) gefärbt. Würden die mAk an unterschiedlichen Zellen binden, gäbe es keine Doppelfluoreszenz derselben Zelle, sondern lediglich getrennte Fluoreszenz im FL1-(grün) als auch im FL2-(orange) Bereich.

4.3.10.1 Vergleich des Bindungsverhaltens der neu entwickelten mit bekannten monoklonalen Antikörpern mit Hilfe der Doppelfärbung in der Membranimmunfluoreszenz

Bis auf den Ansatz von 3C2 mit Dog10 war bei allen anderen mAk eine deutliche Doppelfluoreszenz zu erkennen. Das spricht dafür, daß die gleichen Zellen erkannt werden. Die mAk 3C2 und Dog10 schienen auf demselben Molekül zu binden, da in der Doppelfluoreszenz nur die Bindung von dem zuerst inkubierten FITC markierten mAk Dog10 nachgewiesen wurde. Offensichtlich wurde die Bindungsstelle durch den mAk Dog10 blockiert, so daß der mAk 3C2 nicht binden konnte. Die mAk 3C2 und Dog18 dagegen banden auf derselben Lymphozytenpopulation aber auf unterschied-lichen Epitopen, was an der deutunterschied-lichen Doppelfluoreszenz zu erkennen war.

Die Ergebnisse der Doppelfärbung sind in Tabelle 17 dargestellt.

147 Neu entwickelte mAk wurden mit bereits entwickelten mAk in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.20) auf ihr

Bindungsverhal-ten auf ruhenden caninen LeukozyBindungsverhal-ten in der Doppelfärbung geprüft. Es wurde zunächst der unmarkierte mAk (als Dog-Ak bezeichnet) ein-gesetzt und dann mit einem FITC-konjugierten Antiserum gegen Mäuse- bzw. Rattenimmunglobuline (s. 3.1.3) inkubiert. Diese Zellen fluoreszierten im positiven Falle grün (FL1). Anschließend wurde der biotinylierte mAk (neu entwickelte mAk) inkubiert und mit Streptavidin-Phycoerythrin (orange fluoreszierend = FL2) sichtbar gemacht. Zusätzlich wurde als Kontrolle jeder Antikörper alleine geprüft (linke und mittlere Spalte). Die Auswertung erfolgte im Durchflußzytometer im FL2/FL1-Diagramm (s. 3.2.12.2)

Abkürzungen: GAM-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Maus-Antikörper GAR-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Ratte-Antikörper SA-PE: Streptavidin-Phycoerythrin

Neg.-Kontr.: Negativ-Kontrolle

148

Dog27 2A3 Dog27 + 2A3

Neu entwickelte mAk wurden mit bereits entwickelten mAk in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.20) auf ihr Bindungsverhal-ten auf ruhenden caninen LeukozyBindungsverhal-ten in der Doppelfärbung geprüft. Es wurde zunächst der unmarkierte mAk (als Dog-Ak bezeichnet) ein-gesetzt und dann mit einem FITC-konjugierten Antiserum gegen Mäuse- bzw. Rattenimmunglobuline (s. 3.1.3) inkubiert. Diese Zellen fluoreszierten im positiven Falle grün (FL1). Anschließend wurde der biotinylierte mAk (neu entwickelte mAk) inkubiert und mit Streptavidin-Phycoerythrin (orange fluoreszierend = FL2) sichtbar gemacht. Zusätzlich wurde als Kontrolle jeder Antikörper alleine geprüft (linke und mittlere Spalte). Die Auswertung erfolgte im Durchflußzytometer im FL2/FL1-Diagramm (s. 3.2.12.2)

Abkürzungen: GAM-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Maus-Antikörper GAR-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Ratte-Antikörper SA-PE: Streptavidin-Phycoerythrin

Neg.-Kontr.: Negativ-Kontrolle

149 Neu entwickelte mAk wurden mit bereits entwickelten mAk in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.20) auf ihr

Bindungsverhal-ten auf ruhenden caninen LeukozyBindungsverhal-ten in der Doppelfärbung geprüft. Es wurde zunächst der unmarkierte mAk (als Dog-Ak bezeichnet) ein-gesetzt und dann mit einem FITC-konjugierten Antiserum gegen Mäuse- bzw. Rattenimmunglobuline (s. 3.1.3) inkubiert. Diese Zellen fluoreszierten im positiven Falle grün (FL1). Anschließend wurde der biotinylierte mAk (neu entwickelte mAk) inkubiert und mit Streptavidin-Phycoerythrin (orange fluoreszierend = FL2) sichtbar gemacht. Zusätzlich wurde als Kontrolle jeder Antikörper alleine geprüft (linke und mittlere Spalte). Die Auswertung erfolgte im Durchflußzytometer im FL2/FL1-Diagramm (s. 3.2.12.2)

Abkürzungen: GAM-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Maus-Antikörper GAR-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Ratte-Antikörper SA-PE: Streptavidin-Phycoerythrin

Neg.-Kontr.: Negativ-Kontrolle

150

Dog34 2B5 Dog34 + 2B5

Neu entwickelte mAk wurden mit bereits entwickelten mAk in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.20) auf ihr Bindungsverhal-ten auf ruhenden caninen LeukozyBindungsverhal-ten in der Doppelfärbung geprüft. Es wurde zunächst der unmarkierte mAk (als Dog-Ak bezeichnet) ein-gesetzt und dann mit einem FITC-konjugierten Antiserum gegen Mäuse- bzw. Rattenimmunglobuline (s. 3.1.3) inkubiert. Diese Zellen fluoreszierten im positiven Falle grün (FL1). Anschließend wurde der biotinylierte mAk (neu entwickelte mAk) inkubiert und mit Streptavidin-Phycoerythrin (orange fluoreszierend = FL2) sichtbar gemacht. Zusätzlich wurde als Kontrolle jeder Antikörper alleine geprüft (linke und mittlere Spalte). Die Auswertung erfolgte im Durchflußzytometer im FL2/FL1-Diagramm (s. 3.2.12.2)

Abkürzungen: GAM-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Maus-Antikörper GAR-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Ratte-Antikörper SA-PE: Streptavidin-Phycoerythrin

Neg.-Kontr.: Negativ-Kontrolle

151 Neu entwickelte mAk wurden mit bereits entwickelten mAk in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.20) auf ihr

Bindungsverhal-ten auf ruhenden caninen LeukozyBindungsverhal-ten in der Doppelfärbung geprüft. Es wurde zunächst der unmarkierte mAk (als Dog-Ak bezeichnet) ein-gesetzt und dann mit einem FITC-konjugierten Antiserum gegen Mäuse- bzw. Rattenimmunglobuline (s. 3.1.3) inkubiert. Diese Zellen fluoreszierten im positiven Falle grün (FL1). Anschließend wurde der biotinylierte mAk (neu entwickelte mAk) inkubiert und mit Streptavidin-Phycoerythrin (orange fluoreszierend = FL2) sichtbar gemacht. Zusätzlich wurde als Kontrolle jeder Antikörper alleine geprüft (linke und mittlere Spalte). Die Auswertung erfolgte im Durchflußzytometer im FL2/FL1-Diagramm (s. 3.2.12.2)

Abkürzungen: GAM-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Maus-Antikörper GAR-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Ratte-Antikörper SA-PE: Streptavidin-Phycoerythrin

Neg.-Kontr.: Negativ-Kontrolle

152

Dog10 3C2 Dog10+ 3C2

Neu entwickelte mAk wurden mit bereits entwickelten mAk in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.20) auf ihr Bindungsverhal-ten auf ruhenden caninen LeukozyBindungsverhal-ten in der Doppelfärbung geprüft. Es wurde zunächst der unmarkierte mAk (als Dog-Ak bezeichnet) ein-gesetzt und dann mit einem FITC-konjugierten Antiserum gegen Mäuse- bzw. Rattenimmunglobuline (s. 3.1.3) inkubiert. Diese Zellen fluoreszierten im positiven Falle grün (FL1). Anschließend wurde der biotinylierte mAk (neu entwickelte mAk) inkubiert und mit Streptavidin-Phycoerythrin (orange fluoreszierend = FL2) sichtbar gemacht. Zusätzlich wurde als Kontrolle jeder Antikörper alleine geprüft (linke und mittlere Spalte). Die Auswertung erfolgte im Durchflußzytometer im FL2/FL1-Diagramm (s. 3.2.12.2)

Abkürzungen: GAM-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Maus-Antikörper GAR-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Ratte-Antikörper SA-PE: Streptavidin-Phycoerythrin

Neg.-Kontr.: Negativ-Kontrolle

153 Neu entwickelte mAk wurden mit bereits entwickelten mAk in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.20) auf ihr

Bindungsverhal-ten auf ruhenden caninen LeukozyBindungsverhal-ten in der Doppelfärbung geprüft. Es wurde zunächst der unmarkierte mAk (als Dog-Ak bezeichnet) ein-gesetzt und dann mit einem FITC-konjugierten Antiserum gegen Mäuse- bzw. Rattenimmunglobuline (s. 3.1.3) inkubiert. Diese Zellen fluoreszierten im positiven Falle grün (FL1). Anschließend wurde der biotinylierte mAk (neu entwickelte mAk) inkubiert und mit Streptavidin-Phycoerythrin (orange fluoreszierend = FL2) sichtbar gemacht. Zusätzlich wurde als Kontrolle jeder Antikörper alleine geprüft (linke und mittlere Spalte). Die Auswertung erfolgte im Durchflußzytometer im FL2/FL1-Diagramm (s. 3.2.12.2)

Abkürzungen: GAM-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Maus-Antikörper GAR-FITC: Fluoresceinisothiocyanat markierte Ziege-anti-Ratte-Antikörper SA-PE: Streptavidin-Phycoerythrin

Neg.-Kontr.: Negativ-Kontrolle

4.3.10.2 Vergleich des Bindungsverhaltens der neu entwickelten mit bekannten monoklonalen Antikörpern mit Hilfe der Doppelfärbung nach Co-Capping

Zur weiteren Feindifferenzierung der mAk 3C2 und 2A3 im Vergleich des Bindungs-verhaltens mit den mAk Dog10 bzw. Dog27, wurde mit den unmarkierten mAk Dog 10, Dog18, Dog 27 und Dog28 ein "Capping" (s.3.2.21) auf den Zellen eingeleitet, und an-schließend eine Doppelfärbung (s. 3.2.20) mit dem biotinylierten neu entwickelten mAk durchgeführt.

Prinzipiell gibt es bei diesem Verfahren vier mögliche Ergebnisse:

1. Es leuchten verschiedene Zellen grün bzw. rot auf. Das bedeutet, daß verschie-dene Zellen von den beiden mAk erkannt werden.

2. Es leuchtet auf denselben Zellen, aber an unterschiedlichen Stellen grün bzw. rot auf. Dann werden von den mAk zwar die gleichen Zellen, aber unterschiedliche Moleküle erkannt.

3. Die Kappe leuchtet grün und rot. In diesem Fall erkennen beide mAk das gleiche Molekül.

4. Es werden nur Zellen gefunden, die grün aufleuchten, obwohl die entsprechende Positivkontrolle des biotinylierten mAk rot fluoresziert. Dann hat der erste mAk das Epitop besetzt oder blockiert, so daß der zweite mAk nicht mehr binden konnte.

Die Ergebnisse diese Versuchs waren gut zu interpretieren:

So erkannte der mAk 2A3 dasselbe Molekül, wie der ein ähnliches Verteilungs-muster aufweisende mAk Dog27. Leider ist von diesem mAk die Spezifität unbekannt.

Der zur Kontrolle mitgetestete mAk Dog28 hat ebenfalls an dieselben Zellen gebun-den. Allerdings hat er ein unterschiedliches Molekül erkannt.

Der neu entwickelte mAk 3C2 dagegen, welcher rot fluoreszieren müßte, konnte nicht nachgewiesen werden. Es konnte lediglich die Grünfluoreszenz des FITC-mar-kierten mAk Dog10 festgestellt werden, obwohl der mAk 3C2 in der Positivkontrolle ge-bunden hatte. Das bestätigt das Ergebnis aus der Doppelfärbung in der Membranimmunfluoreszenz (s. 4.3.10.2). Auch dort konnte der zweite zugegebene biotinylierte mAk 3C2 nicht nachgewiesen werden. Dies bestätigt die Vermutung, daß der mAk 3C2 wie der mAk Dog10 das CD8-Molekül erkennt. Der ebenfalls auf eine Subpopulation von Lymphozyten reagierende mAk M18 erkannte dagegen ein ande-res Molekül auf denselben Zellen.