Reaktivität auf in vitro mit Concanavalin A stimulierten

Um zu überprüfen, ob die von den mAk erkannten Strukturen nach Mitogenstimulie-rung verstärkt exprimiert wurden, ist eine Untersuchung auf ConA-aktivierten mononu-kleären Zellen durchgeführt worden.

Die Bindungseigenschaften der neu entwickelten mAk auf aktivierten mononukle-4A6

(IgG2a)

Granulozyten, Monozyten

Tabelle 9: (Forts.) Reaktivität von fünf selbst entwickelten mAk auf ruhenden caninen Leukozyten

mAk Erkannte Zellpopulation

Nach Immunisierung mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) von Mäusen gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s. 3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirek-ten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markier-ten Konjugats (s. 3.1.3) auf ruhenden caninen LeukozyFITC-markier-ten (s. 3.2.1) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchflußzytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Als Darstellungsform wurde der Dotplot in Zweiparameterdarstellung (Komplexität der Zelle [SSC] gegen die Fluoreszenzintensität [FL1]) gewählt.

Bei der Negativkontrolle wurde statt eines mAk nur das Konjugat eingesetzt, um eine mögliche dadurch bedingte unspezifische Bindungsreaktion zu erfassen.

In den Isotypkontrollen wurden statt der auf ihre Bindung zu prüfenden mAk je ein mAk aus derselben Fusion ohne spezifische Bindung auf caninen Zellen aber mit entspre-chendem Isotyp (IgG1, IgG2a, IgG2b) eingesetzt. Damit sollten unspezifische isotyp-bedingte Bindungen an die Zellen erfaßt werden.

ären Zellen zeigten, daß alle mAk Strukturen auf den Blasten erkannt haben. Dabei gab es jedoch die Expressionsdichte betreffend deutliche Unterschiede. Während die Antikörper 1D2 und 2A3 Strukturen erkannten, die auf allen blastisch transformierten mononukleären Zellen exprimiert wurden, haben die restlichen mAk nur Strukturen er-kannt, welche auf Subpopulationen exprimiert wurden.

Die Ergebnisse der Reaktivität auf ConA stimulierte Zellen sind in Tabelle 10 darge-stellt

Tabelle 10: Reaktivität von fünf selbst entwickelten mAk auf mit ConA aktivierten caninen mononukleären Zellen

mAk Erkannte Zellpopulation

Negativ-kontrolle (Zellen+ PBS + Konjugat)

SSC/FSC SSC/FL1

Nach Immunisierung von Mäusen mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s.

3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf ConA akti-vierten mononukleären Zellen (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchfluß-zytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Als Darstellungsform wurde der Dotplot in Zweiparameterdarstellung (Komplexität der Zelle [SSC] gegen FSC [Oberflächenbeschaf-fenheit]) bzw. SSC gegen die Fluoreszenzintensität [FL1] gewählt.

Bei der Negativkontrolle wurde statt eines mAk nur das Konjugat eingesetzt, um eine mög-liche dadurch bedingte unspezifische Bindungsreaktion zu erfassen.

In den Isotypkontrollen wurden statt der auf ihre Bindung zu prüfenden mAk je ein mAk aus derselben Fusion ohne spezifische Bindung auf caninen Zellen aber mit entsprechendem Isotyp (IgG1, IgG2a, IgG2b) eingesetzt. Damit sollten unspezifische isotypbedingte Bindun-gen an die Zellen erfaßt werden.

Isotyp-kontrolle IgG1

SSC/FSC SSC/FL1

Isotyp-kontrolle IgG2a

SSC/FSC SSC/FL1

Tabelle 10: (Forts.) Reaktivität von fünf selbst entwickelten mAk auf mit ConA aktivierten caninen mononukleären Zellen

mAk Erkannte Zellpopulation

Nach Immunisierung von Mäusen mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s.

3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf ConA akti-vierten mononukleären Zellen (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchfluß-zytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Als Darstellungsform wurde der Dotplot in Zweiparameterdarstellung (Komplexität der Zelle [SSC] gegen FSC [Oberflächenbeschaf-fenheit]) bzw. SSC gegen die Fluoreszenzintensität [FL1] gewählt.

Bei der Negativkontrolle wurde statt eines mAk nur das Konjugat eingesetzt, um eine mög-liche dadurch bedingte unspezifische Bindungsreaktion zu erfassen.

In den Isotypkontrollen wurden statt der auf ihre Bindung zu prüfenden mAk je ein mAk aus derselben Fusion ohne spezifische Bindung auf caninen Zellen aber mit entsprechendem Isotyp (IgG1, IgG2a, IgG2b) eingesetzt. Damit sollten unspezifische isotypbedingte Bindun-gen an die Zellen erfaßt werden.

Isotyp-kontrolle IgG2b

SSC/FSC SSC/FL1

Tabelle 10: (Forts.) Reaktivität von fünf selbst entwickelten mAk auf mit ConA aktivierten caninen mononukleären Zellen

mAk Erkannte Zellpopulation

Nach Immunisierung von Mäusen mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s.

3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf ConA akti-vierten mononukleären Zellen (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchfluß-zytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Als Darstellungsform wurde der Dotplot in Zweiparameterdarstellung (Komplexität der Zelle [SSC] gegen FSC [Oberflächenbeschaf-fenheit]) bzw. SSC gegen die Fluoreszenzintensität [FL1] gewählt.

Bei der Negativkontrolle wurde statt eines mAk nur das Konjugat eingesetzt, um eine mög-liche dadurch bedingte unspezifische Bindungsreaktion zu erfassen.

In den Isotypkontrollen wurden statt der auf ihre Bindung zu prüfenden mAk je ein mAk aus derselben Fusion ohne spezifische Bindung auf caninen Zellen aber mit entsprechendem Isotyp (IgG1, IgG2a, IgG2b) eingesetzt. Damit sollten unspezifische isotypbedingte Bindun-gen an die Zellen erfaßt werden.

1D2 (IgG1)

SSC/FSC

Kreis = nicht aktivierte Lymphozyten (Zyten) Darüber= blastisch trans-formierte Zellen (Blasten)

Blasten

Zyten

SSC/FL1

Tabelle 10: (Forts.) Reaktivität von fünf selbst entwickelten mAk auf mit ConA aktivierten caninen mononukleären Zellen

mAk Erkannte Zellpopulation

Nach Immunisierung von Mäusen mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s.

3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf ConA akti-vierten mononukleären Zellen (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchfluß-zytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Als Darstellungsform wurde der Dotplot in Zweiparameterdarstellung (Komplexität der Zelle [SSC] gegen FSC [Oberflächenbeschaf-fenheit]) bzw. SSC gegen die Fluoreszenzintensität [FL1] gewählt.

Bei der Negativkontrolle wurde statt eines mAk nur das Konjugat eingesetzt, um eine mög-liche dadurch bedingte unspezifische Bindungsreaktion zu erfassen.

In den Isotypkontrollen wurden statt der auf ihre Bindung zu prüfenden mAk je ein mAk aus derselben Fusion ohne spezifische Bindung auf caninen Zellen aber mit entsprechendem Isotyp (IgG1, IgG2a, IgG2b) eingesetzt. Damit sollten unspezifische isotypbedingte Bindun-gen an die Zellen erfaßt werden.

2A3 (IgG1)

SSC/FSC

Kreis = nicht aktivierte Lymphozyten (Zyten) Darüber= blastisch trans-formierte Zellen (Blasten)

Blasten

Zyten

SSC/FL1

Tabelle 10: (Forts.) Reaktivität von fünf selbst entwickelten mAk auf mit ConA aktivierten caninen mononukleären Zellen

mAk Erkannte Zellpopulation

Nach Immunisierung von Mäusen mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s.

3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf ConA akti-vierten mononukleären Zellen (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchfluß-zytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Als Darstellungsform wurde der Dotplot in Zweiparameterdarstellung (Komplexität der Zelle [SSC] gegen FSC [Oberflächenbeschaf-fenheit]) bzw. SSC gegen die Fluoreszenzintensität [FL1] gewählt.

Bei der Negativkontrolle wurde statt eines mAk nur das Konjugat eingesetzt, um eine mög-liche dadurch bedingte unspezifische Bindungsreaktion zu erfassen.

In den Isotypkontrollen wurden statt der auf ihre Bindung zu prüfenden mAk je ein mAk aus derselben Fusion ohne spezifische Bindung auf caninen Zellen aber mit entsprechendem Isotyp (IgG1, IgG2a, IgG2b) eingesetzt. Damit sollten unspezifische isotypbedingte Bindun-gen an die Zellen erfaßt werden.

2B5 (IgG1)

SSC/FSC

Kreis = nicht aktivierte Lymphozyten (Zyten) Darüber= blastisch trans-formierte Zellen (Blasten)

Blasten

Zyten

SSC/FL1

Subpopulation Tabelle 10: (Forts.) Reaktivität von fünf selbst entwickelten mAk auf mit ConA

aktivierten caninen mononukleären Zellen

mAk Erkannte Zellpopulation

Nach Immunisierung von Mäusen mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s.

3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf ConA akti-vierten mononukleären Zellen (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchfluß-zytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Als Darstellungsform wurde der Dotplot in Zweiparameterdarstellung (Komplexität der Zelle [SSC] gegen FSC [Oberflächenbeschaf-fenheit]) bzw. SSC gegen die Fluoreszenzintensität [FL1] gewählt.

Bei der Negativkontrolle wurde statt eines mAk nur das Konjugat eingesetzt, um eine mög-liche dadurch bedingte unspezifische Bindungsreaktion zu erfassen.

In den Isotypkontrollen wurden statt der auf ihre Bindung zu prüfenden mAk je ein mAk aus derselben Fusion ohne spezifische Bindung auf caninen Zellen aber mit entsprechendem Isotyp (IgG1, IgG2a, IgG2b) eingesetzt. Damit sollten unspezifische isotypbedingte Bindun-gen an die Zellen erfaßt werden.

3C2 (IgG2b)

SSC/FSC

Kreis = nicht aktivierte Lymphozyten (Zyten) Darüber= blastisch trans-formierte Zellen (Blasten)

Blasten

Zyten

SSC/FL1

Subpopulation Tabelle 10: (Forts.) Reaktivität von fünf selbst entwickelten mAk auf mit ConA

aktivierten caninen mononukleären Zellen

mAk Erkannte Zellpopulation

Nach Immunisierung von Mäusen mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s.

3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf ConA akti-vierten mononukleären Zellen (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchfluß-zytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Als Darstellungsform wurde der Dotplot in Zweiparameterdarstellung (Komplexität der Zelle [SSC] gegen FSC [Oberflächenbeschaf-fenheit]) bzw. SSC gegen die Fluoreszenzintensität [FL1] gewählt.

Bei der Negativkontrolle wurde statt eines mAk nur das Konjugat eingesetzt, um eine mög-liche dadurch bedingte unspezifische Bindungsreaktion zu erfassen.

In den Isotypkontrollen wurden statt der auf ihre Bindung zu prüfenden mAk je ein mAk aus derselben Fusion ohne spezifische Bindung auf caninen Zellen aber mit entsprechendem Isotyp (IgG1, IgG2a, IgG2b) eingesetzt. Damit sollten unspezifische isotypbedingte Bindun-gen an die Zellen erfaßt werden.

4A6 (IgG2a)

SSC/FSC

Kreis = nicht aktivierte Lymphozyten (Zyten) Darüber= blastisch trans-formierte Zellen (Blasten)

Blasten

Zyten

SSC/FL1

Subpopulation Tabelle 10: (Forts.) Reaktivität von fünf selbst entwickelten mAk auf mit ConA

aktivierten caninen mononukleären Zellen

mAk Erkannte Zellpopulation

Nach Immunisierung von Mäusen mit ConA aktivierten mononukleären Zellen des Hundes (s. 3.2.5) gewonnene Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen X63.Ag8.653 fusioniert (s.

3.2.7). Die daraus entwickelten mAk wurden in der indirekten Membranimmunfluoreszenz (s. 3.2.12.3) unter Verwendung eines FITC-markierten Konjugats (s. 3.1.3) auf ConA akti-vierten mononukleären Zellen (s. 3.2.4) auf ihr Bindungsverhalten geprüft, und im Durchfluß-zytometer (s. 3.2.12.2) ausgewertet. Als Darstellungsform wurde der Dotplot in Zweiparameterdarstellung (Komplexität der Zelle [SSC] gegen FSC [Oberflächenbeschaf-fenheit]) bzw. SSC gegen die Fluoreszenzintensität [FL1] gewählt.

Bei der Negativkontrolle wurde statt eines mAk nur das Konjugat eingesetzt, um eine mög-liche dadurch bedingte unspezifische Bindungsreaktion zu erfassen.

In den Isotypkontrollen wurden statt der auf ihre Bindung zu prüfenden mAk je ein mAk aus derselben Fusion ohne spezifische Bindung auf caninen Zellen aber mit entsprechendem Isotyp (IgG1, IgG2a, IgG2b) eingesetzt. Damit sollten unspezifische isotypbedingte Bindun-gen an die Zellen erfaßt werden.

Zur Absicherung der Ergebnisse wurden die mAk ebenfalls auf drei Tage mit Poke-weed Mitogen (PWM, 1µg/ml Endkonzentration) stimulierten caninen mononukleären Zellen ausgetestet (s. 3.2.4). Auch dort reagierten sie alle wie oben beschrieben. Damit war eine Bindung an das stimulierende Mitogen (ConA bzw. PWM) ausgeschlossen.

Im Dokument Entwicklung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen CD-Moleküle beim Hund (Seite 96-105)