der Tier¨ arztlichen Hochschule Hannover und
dem Institut f¨ ur Umwelt- und Tierhygiene der Universit¨ at Hohenheim
Charakterisierung aktueller Wildtyp-Hundestaupevirus-Isolate
mit polyklonalen und monoklonalen Antik¨orpern
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterin¨armedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tier¨ arztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Andrea Sch¨anzler
aus Soltau
Hannover 2001
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. L. Haas 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Brenig
Tag der m¨undlichen Pr¨ufung: 26.11.2001
1. Einleitung 1
2. Literatur¨ubersicht 3
2.1. Das Staupevirus . . . 3
2.1.1. Taxonomie . . . 3
2.1.2. Aufbau des Virions . . . 3
2.1.3. Genomorganisation . . . 3
2.1.4. Proteine des CDV . . . 4
2.1.5. Klinik der Staupeerkrankung . . . 7
2.1.6. Epidemiologie . . . 8
2.1.7. Diagnostik . . . 9
2.1.7.1. Methoden des Antik¨orpernachweises . . . 9
2.1.7.2. Methoden des Antigennachweises . . . 11
2.1.7.3. Methoden des Nukleins¨aurenachweises . . . 12
2.1.8. Prophylaxe . . . 12
2.2. Methoden zur Charakterisierung von Virusisolaten . . . 13
2.2.1. Molekularbiologische Methoden (Charakterisierung auf Nukleins¨auree- bene) . . . 13
2.2.2. Molekulargewicht der Virusproteine . . . 16
2.2.3. Immunologische Methoden . . . 16
2.2.3.1. Kreuzreaktivit¨at polyklonaler Seren mit verschiedenen Virusisolaten . . . 16
2.2.3.2. Kreuzreaktivit¨at monoklonaler Antik¨orper mit verschie- denen Virusisolaten . . . 17
2.2.3.3. Verwendung von sequenz¨uberlappenden Peptiden zur Epi- topsuche und -charakterisierung . . . 18
2.2.3.3.1. Peptide als Epitope . . . 18
2.2.3.3.2. Determinantensuche und -charakterisierung mit sequenz¨uberlappenden Peptiden . . . 21
3. Material und Methoden 23 3.1. Zellkulturen . . . 23
3.1.1. Verozellen . . . 24
3.1.2. Myelom- und Hybridomzellen . . . 24
3.2. Viren . . . 24
3.2.1. Vermehrung in Zellkultur . . . 25
3.2.2. Quantitiative Bestimmung der Infektiosit¨at . . . 25
3.2.3. Virusisolierung . . . 27
3.2.3.1. Isolierung aus Blutproben . . . 27
3.2.3.2. Nachweis des isolierten Virus . . . 28
3.2.3.3. Nachweis von Antik¨orpern gegen das Hundestaupevirus aus Seren von Tieren mit Staupeverdacht . . . 28
3.3. Monoklonale Antik¨orper . . . 29
3.3.1. Produktion monoklonaler Antik¨orper . . . 29
3.3.1.1. Gewinnung und Fusion der Splenozyten . . . 30
3.3.1.2. ”Screening“ der Hybridzellkultur¨uberst¨ande auf die Pro- duktion CDV-spezifischer Antik¨orper und Etablierung von Hybridomaklonen . . . 31
3.3.2. Charakterisierung monoklonaler Antik¨orper . . . 33
3.3.2.1. Western-Blot-Verfahren . . . 33
3.3.2.1.1. Antigenaufbereitung . . . 33
3.3.2.1.2. Western-Blot . . . 33
3.4. Charakterisierung der verschiedenen CDV-Isolate mittels polyklonaler und monoklonaler Antik¨orper . . . 35
3.4.1. Charakterisierung der CDV-Isolate mit polyklonalen Seren . . . . 36
3.4.1.1. Art und Herkunft der Seren . . . 36
3.4.1.2. ”Neutralizing-Peroxidase-linked Antibody Assay“ . . . . 36
3.4.1.3. Kreuzneutralisation verschiedener Virusisolate mit poly- klonalen Seren . . . 37
3.4.2. Charakterisierung der CDV-Isolate mit monoklonalen Antik¨orpern 38 3.4.2.1. Indirekter Immunfluoreszenztest (IFT) mit monoklona- len Antik¨orpern . . . 38
3.4.2.2. Western-Blot . . . 39
3.5. Charakterisierung der Virusisolate mit Hilfe sequenz¨uberlappender syn- thetischer Peptide . . . 39
3.5.1. Auswahl der Aminos¨auresequenzen . . . 40
3.5.2. Enzymimmunoassay (EIA) . . . 41
3.5.2.1. Inkubation mit prim¨aren und sekund¨aren Antik¨orpern . 41 3.5.2.2. Substratreaktion . . . 42
3.5.2.3. Dokumentation und Darstellung der Ergebnisse . . . 43
3.5.2.4. Regeneration der Peptidtr¨ager . . . 44
4. Ergebnisse 45
4.1. Isolierung von CDV-Feldisolaten . . . 45
4.2. Gewinnung und Charakterisierung der monoklonalen Antik¨orper . . . 46
4.2.1. Proteinspezifit¨at der mAk . . . 46
4.2.1.1. Western-Blot . . . 46
4.3. Charakterisierung der verschiedenen CDV-Isolate mittels polyklonaler und monoklonaler Antik¨orper . . . 47
4.3.1. Charakterisierung der CDV-Isolate mit polyklonalen Seren . . . . 47
4.3.1.1. Kreuzneutralisationstest . . . 47
4.3.2. Charakterisierung der CDV-Isolate mit monoklonalen Antik¨orpern 48 4.3.2.1. Reaktion der mAk mit verschiedenen CDV-Virusisolaten im Immunfluoreszenztest . . . 48
4.3.2.2. Darstellung der Virusproteine der verschiedenen CDV- Isolate im Western-Blot . . . 49
4.4. Charakterisierung der CDV-Isolate mit Hilfe sequenz¨uberlappender syn- thetischer Peptide . . . 51
4.4.1. Immunoassays mit Cellulosepeptidtr¨agern . . . 51
4.4.1.1. Monoklonale Antik¨orper . . . 51
4.4.1.2. Seren . . . 53
4.4.1.3. Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit der Ergebnisse . 70 4.4.1.4. Uberpr¨¨ ufung der Wiederverwendbarkeit der Peptidtr¨ager 72 5. Diskussion 73 5.1. Virusisolierung . . . 73
5.2. Charakterisierung der CDV-Isolate mit polyklonalen Seren . . . 74
5.2.1. Kreuzneutralisationstest . . . 74
5.3. Charakterisierung der CDV-Isolate mit monoklonalen Antik¨orpern . . . . 75
5.4. Bestimmung der Reaktivit¨at von monoklonalen Antik¨orpern und polyklo- nalen Seren mit sequenz¨uberlappenden Peptiden aus den CDV-Proteinen H, F, N und P . . . 78
5.4.1. Monoklonale Antik¨orper . . . 79
5.4.2. Seren (Polyklonale Antik¨orper) . . . 81
5.5. Schlußfolgerungen . . . 87
6. Zusammenfassung 90 7. Summary 92 A. Anhang 94 A.1. Peptidtr¨ager . . . 94
A.1.1. Alignments der f¨ur die Peptidauswahl verwendeten CDV-Sequenzen
und die daraus ausgew¨ahlten 200 Peptide . . . 94
A.1.2. Reaktionen der Serumpaare mit den Peptidtr¨agern . . . 123
A.2. Verzeichnis der verwendeten Medien und Reagenzien . . . 124
A.2.1. Reagenzien . . . 124
A.2.2. Puffer und Medien . . . 124
A.3. Rezepturen der Polyacrylamidgele . . . 137
Literaturverzeichnis 138
3.1. Charakteristika der verwendeten monoklonalen Antik¨orper (nach v. Mes- sling, 1998, modifiziert) . . . 30 3.2. Virusisolate, aus denen Sequenzen f¨ur die Peptidsynthese ausgew¨ahlt wur-
den . . . 41 4.1. Virusisolierungen und die dazugeh¨origen VNT-Titer . . . 45 4.2. Kreuzneutralisationstest: Neutralisationstiter von Hundeseren gegen¨uber
verschiedenen CDV-Virusisolaten . . . 48 4.3. Reaktion der mAk mit verschiedenen Virusisolaten im IFT . . . 49 4.4. Die VNT- und IFT-Titer der f¨ur die Enzymimmunoassays verwendeten
Hundeseren . . . 53
4.1. Western-Blot mit mAk CDRCT-4 . . . 50 4.2. Western-Blot mit mAk CD/Px4 . . . 50 4.3. Reaktion des monoklonalen Antik¨orpers CD/Px4 mit den Peptiden aus
dem CDV P-Protein . . . 52 4.4. Reaktion des monoklonalen Antik¨orpers CDRCT 8 mit den Peptiden aus
dem CDV N-Protein . . . 52 4.5. Cellulosepeptidtr¨ager mit Peptiden aus der Sequenz des P-Proteins . . . 54 4.6. Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Positivserum
f¨ur das Serumpaar C20/C26 und das Serumpaar C17m1/C19m1 . . . 55 4.7. Darstellung der Reaktivit¨at von 11 Hundeseren mit den Peptiden aus dem
F-Protein des CDV-Stamms Onderstepoort (Seite1 ) . . . 57 4.7. Darstellung der Reaktivit¨at von 11 Hundeseren mit den Peptiden aus dem
F-Protein des CDV-Stamms Onderstepoort (Seite 2) . . . 58 4.8. Darstellung der Reaktivit¨at von 11 Hundeseren mit den Peptiden aus dem
H-Protein des CDV-Isolats 2544/Han95 (Seite 1) . . . 61 4.8. Darstellung der Reaktivit¨at von 11 Hundeseren mit den Peptiden aus dem
H-Protein des CDV-Isolats 2544/Han95 (Seite 2) . . . 62 4.9. Darstellung der Reaktivit¨at von 11 Hundeseren mit den Peptiden aus dem
N-Protein des CDV-Isolats A75/17 (Seite 1) . . . 64 4.9. Darstellung der Reaktivit¨at von 11 Hundeseren mit den Peptiden aus dem
N-Protein des CDV-Isolats A75/17 (Seite 2) . . . 65 4.10. Darstellung der Reaktivit¨at von 11 Hundeseren mit den Peptiden aus dem
P-Protein des CDV-Stamms Onderstepoort (Seite 1) . . . 67 4.10. Darstellung der Reaktivit¨at von 11 Hundeseren mit den Peptiden aus dem
P-Protein des CDV-Stamms Onderstepoort (Seite 2) . . . 68 4.11. Vergleich der Reaktionen eines Hundeserums (C19m1) in vier verschiede-
nen Versuchen (A-D) mit dem F-Protein Peptidtr¨ager. Die Inkubations- zeiten f¨ur die Substratreaktion lagen zwischen 0,5h (A) und 2h (D) . . . 71 A.1. Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Nachimmuni-
sierungsserum f¨ur das Serumpaar C17m1C19m1 . . . 123 A.2. Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Nachimmuni-
sierungsserum f¨ur das Serumpaar C21C26 . . . 125
A.4. Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Nachimmuni- sierungsserum f¨ur das Serumpaar B1.1/B1.2 . . . 127 A.5. Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Nachimmuni-
sierungsserum f¨ur das Serumpaar AA59.1/AA59.2 . . . 128 A.6. Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Nachimmuni-
sierungsserum f¨ur das Serumpaar C11/C14 . . . 129 A.7. Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Nachimmuni-
sierungsserum f¨ur das Serumpaar C17w3/C19w3 . . . 130 A.8. Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Nachimmuni-
sierungsserum f¨ur das Serumpaar C17w3/C41 . . . 131 A.9. Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Nachimmuni-
sierungsserum f¨ur das Serumpaar C20/C26 . . . 132 A.10.Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Nachimmuni-
sierungsserum f¨ur das Serumpaar C29/C111 . . . 133 A.11.Darstellung der Reaktionsunterschiede zwischen Null- und Nachimmuni-
sierungsserum f¨ur das Serumpaar C31/C43 . . . 134
AEC 3-amino-9-ethylcarbazol Ak Antik¨orper
AP alkalische Phosphatase AS Aminos¨aure(n)
BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphatid-Toluidinsalz BSA bovines Serumalbumin
CBS ”citrate buffered saline“
CDR ”complementarity determining regions“
CDV ”canine distemper virus“, Virus der Hundestaupe CPE zytopathogener Effekt
DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s Medium DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraessigs¨aure EIA ”enzyme immuno assay“
ELISA
”enzyme-linked immunosorbent assay“
FITC Fluorescein-Iso-Thiozyanat FKS F¨otales K¨alberserum
FPLC ”Fast performance fluid chromatography“
GAM ”goat-anti-mouse“
HAT Hypoxanthin-Aminopterin-Tymidin HAT Hypoxanthin-Tymidin
IFT Immunfluoreszenztest IgG Immunglobulin G
IgM Immunglobulin M
iPLA indirekter
”peroxidase-linked antibody assay“
kB Kilobasen
kDa Kilodalton
KID50 Kulturinfekti¨ose Dosis 50%
mAk monoklonaler Antik¨orper Mr relatives Molekulargewicht mRNA ”messenger ribonucleic acid“
MTT Thiazolylblau
OD ”optische Dichte ORF ”open reading frame“
OvaM Ovalbumin-Maleins¨aure PBS ”phosphate buffered saline“
PCR ”polymerase chain reaction“
PDV ”phoscine distemper virus“, Virus der Seehundstaupe
PO Peroxidase
PPRV ”peste des petits ruminant virus“, Virus der Pest der kleinen Wiederk¨auer RNA ”ribonucleic acid“
RPV Rinderpest Virus
RT-PCR reverse-transcriptase polymerase chain reaction“
SDS ”sodium-dodecyl-sulfate“
T-TBS
”tween (containing) tris buffered saline“
v/v Volumenprozent
VNT Virusneutralisationstest w/v Gewichtsprozent
ZK ¨U Zellkultur¨uberstand
Internationale Buchstabensymbole f¨ur die 20 in Proteinen am h¨aufigsten vorkommenden L-Aminos¨auren
L-Alanin A L-Methionin M
L-Cystein C L-Asparagin N
L-Asparagins¨aure D L-Prolin P
L-Glutamins¨aure E L-Glutamin Q
L-Phenylalanin F L-Arginin R
L-Glycin G L-Serin S
L-Histidin H L-Threonin T
L-Isoleucin I L-Valin V
L-Lysin K L-Tryptophan W
L-Leucin L L-Tyrosin Y
Die Hundestaupe ist eine akute bis subakute oder chronisch verlaufende ansteckende Erkrankung mit hohen Mortalit¨atsraten, die Hunde und viele andere Karnivoren in der ganzen Welt betrifft (Appel, 1987). Seit der Einf¨uhrung von attenuierten Lebendimpf- stoffen vor etwa 40 Jahren ist die Erkrankungsh¨aufigkeit zwar deutlich zur¨uckgegan- gen, aber es kommmt immer wieder zu Staupeepidemien, die sowohl bei geimpften als auch bei ungeimpften Tieren auftreten (Harder et al., 1991;Blixenkrone-Møller et al., 1993;Ek-Kommonen et al., 1997).
Eine immer wieder diskutierte Ursache f¨ur das Auftreten von Staupeerkrankungen auch bei geimpften Tieren ist das Auftauchen von
”neuen“ Virusst¨ammen, die sich in ihrer Antigenit¨at von den
”fr¨uheren“ unterscheiden. Die dabei auftauchende Frage ist, ob die traditionell verwendeten Impfvirusst¨amme, die aus vor 40-50 Jahren isolierten Feldvirusisolaten entwickelt wurden und w¨ahrend der Entwicklung viele Male in Zellkul- tur oder H¨uhnereiern passagiert wurden, noch eine ausreichende Immunantwort gegen die aktuellen Feldvirusst¨amme induzieren (Gemma et al., 1996;Mori et al., 1994).
In den letzen Jahren wurden vorwiegend Untersuchungen zu den genetischen Un- terschieden der verschiedenen Virusst¨amme durchgef¨uhrt (Haas et al., 1997; Iwat- suki et al., 1997; Yoshida et al., 1998). Die antigenen Unterschiede der einzelnen Vi- russt¨amme wurden vor allem mit Hilfe monoklonaler Antik¨orper untersucht (Hamburger et al., 1991;Orvell¨ et al., 1990;Blixenkrone-Mølleret al., 1992b;Blixenkrone- Møller, 1993).
Bei den Morbilliviren wurden vor allem beim Masernvirus (aber z. T. auch beim Staupe- und Rinderpestvirus) in den letzten Jahren zur systematischen Suche nach an- tigenen Strukturen, die wichtig f¨ur die Erkennung und Abwehr durch das Immunsystem sind, synthetische Peptide eingesetzt. Besonders die Darstellung ganzer Proteinsequen- zen durch kurze sequenz¨uberlappende Peptide eignet sich zur Suche nach solchen im- munogenen Bereichen (Epitopen). Des weiteren lassen sich mit synthetischen Peptiden Proteinabschnitte finden, die eine wichtige Funktion w¨ahrend der Infektion aus¨uben (z.B. Fusionspeptide oder Rezeptorbindungsstellen)(Wild und Buckland, 1997).
Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von monoklonalen und polyklonalen Antik¨orpern eine Charakterisierung von aktuellen Feldvirusisolaten der Hundestaupe vorzunehmen.
Dabei wurde besonders auf Unterschiede in der Reaktion der Antik¨orper zwischen aktu- ellen Feldisolaten und den traditionellen Impfvirusst¨ammen geachtet. Als Methoden zur Charakterisierung kamen der Kreuzneutralisationstest, Reaktionen monoklonaler An-
tik¨orper mit den Virusisolaten, Western-blot Untersuchungen und die Epitopsuche mit sequenz¨uberlappenden Peptiden zum Einsatz.
2.1. Das Staupevirus
2.1.1. Taxonomie
Das Virus der Hundestaupe (
”canine distemper virus“, CDV) ist dem Genus der Morbil- liviren zuzuordnen. Dieses Genus umfaßt neben dem Virus der Hundestaupe das Virus der Seehundestaupe (PDV), das Masernvirus (MV), das Rinderpestvirus (RPV)und das Virus der Pest der kleinen Wiederk¨auer (
”Peste des petits ruminants“, PPRV). Aus ma- rinen S¨augetieren wurden zwei weitere Viren isoliert, die den Morbilliviren zuzurechnen sind, das Delphin-Staupe-Virus (
”dolphin distemper virus“) und das Staupevirus des europ¨aischen Schweinswals (
”porpoise distemper virus“).
Das Genus der Morbilliviren bildet zusammen mit den Genera Respirovirus und Rubulavirus die Subfamilie der Paramyxovirinae. Diese Subfamilie geh¨ort zusammen mit der Subfamilie der Pneumovirinae (Genera Pneumovirus und Metapneumovirus) zur Familie der Paramyxoviridae. Diese Familie wird eingeordnet in die Ordnung der Mononegavirales in der Gruppe der negativ-str¨angigen RNA-Viren.
2.1.2. Aufbau des Virions
Morbillivirionen besitzen eine Lipidh¨ulle, welche zwei der Strukturproteine die Glykopro- teine H und F tr¨agt. Ihr Durchmesser reicht von 100 nm bis 700 nm und ihre Gestalt ist sph¨arisch bis pleomorph (Appel, 1987). Die Lipidh¨ulle umschließt ein helikales Nukleo- kapsid mit einem Durchmesser von 15-21nm (Oglesbeeet al., 1989). Das Nukleokapsid beinhaltet drei der sechs Strukturproteine (siehe 2.1.4). Die RNA ist negativ polari- siert, einstr¨angig und unsegmentiert. Die Gr¨oße des Genomes betr¨agt 15,6 kB (Sidhu et al., 1993b).
2.1.3. Genomorganisation
Sowohl vom Virus der Hundestaupe und als auch dem Masernvirus und dem Rinder- pestvirus ist die gesamte Sequenz der genomischen RNA bekannt (Barrett et al., 1985; Rozenblatt et al., 1985; Bellini et al., 1986; Barrett et al., 1987; Sidhu et al., 1993a;Curranet al., 1991;Sidhuet al., 1993b). Auch von den anderen Morbil- liviren sind weite Teile der genomischen RNA sequenziert.
Das Genom kodiert hintereinander f¨ur sechs Strukturproteine, deren Gene durch intergenische Sequenzabschnitte getrennt sind. Vorangeschaltet ist eine nichtkodierende Startsequenz. Vom 3’-Ende aus kodiert das Genom nacheinander die Strukturproteine N, P, M, F, H und L. Außerdem sind noch zwei Nichtstrukturproteine, C und V, bekannt, die von der Sequenz f¨ur das P-Protein mitkodiert werden. Diese Genabfolge ist bei allen bisher untersuchten Morbilliviren konserviert (Barrettet al., 1991).
Nach erfolgter Infektion wird in der betroffenen Zelle die negativ polarisierte RNA in mRNA umgeschrieben. Jedes Gen außer dem P Gen, das f¨ur zwei weitere Nichtstruk- turproteine kodiert, wird in monocistronische mRNA transkribiert. Die Menge, die von jeder mRNA gebildet wird, ist abh¨angig von der Entfernung ihres Gens vom 3’-Ende der RNA. Je weiter das Gen von diesem entfernt ist, desto weniger mRNA wird gebildet.
Dementsprechend liegt die das N-Protein kodierende mRNA in der h¨ochsten und die das L-Protein kodierende in der geringsten Konzentration vor. In der Sp¨atphase der Infekti- on wird dagegen die gesamte RNA kontinuierlich abgelesen als Vorlage f¨ur die Bildung von viraler genomischer RNA f¨ur die Virusreplikation (Barrettet al., 1991).
2.1.4. Proteine des CDV
N-Protein: Das N-Protein ist der Hauptbestandteil des Nukleokapsids. Es ist phos- phoryliert und wird in der infizierten Zelle von allen Proteinen in der h¨ochsten Kon- zentration gebildet. Das N-Protein ist zusammen mit dem P- und L-Protein an der Transkription der RNA beteiligt. Es hat zwar selbst keine enzymatische Funktion, ist aber f¨ur die Funktion von P- und L-Protein n¨otig. Es umh¨ullt die RNA in ihrer gesamten L¨ange. Die N-terminalen zwei Drittel des Proteins sind f¨ur die Bindung an die RNA ver- antwortlich, w¨ahrend das C-terminale Drittel an der Oberfl¨ache des Nukleokapsids liegt und vermutlich mit dem M-Protein interagiert (Liston et al., 1997). Es wird vermu- tet, daß das N-Protein auch f¨ur die Umschaltung von der Transkription zur Replikation der RNA verantwortlich ist. Das N-Protein bindet an die RNA und beginnt diese vom 5’-Ende aus zu umh¨ullen. Mit steigender Konzentration des Proteins wird dieser H¨ull- komplex zum 3’-Ende verl¨angert. Wahrscheinlich wird durch diesen Prozeß der Abbruch der Polymeraseaktivit¨at an den intergenischen Basen blockiert und so die kontinuierli- che Replizierung der Erbinformation m¨oglich (Kolakofsky et al., 1991; Blumberg et al., 1981). Die Folge ist die Bildung einer positiv polarisierten RNA voller L¨ange, die als Vorlage f¨ur die Synthese einer negativ polarisierten genomischen RNA dient.
Das Gen des CDV-N-Proteins besteht aus 1,683 kB und kodiert f¨ur 523 Aminos¨auren (AS) (Rozenblatt et al., 1985; Sidhuet al., 1993b). Das daraus abgeleitete Moleku- largewicht betr¨agt Mr = 58.000. Seine Sequenz weist eine Homologie von ca. 70% mit MV und von ca. 84% mit PDV auf (Blixenkrone-Møller et al., 1993). Vor allem der Mittelteil der Sequenz ist hoch konserviert. Dies l¨aßt vermuten, daß diese Region unerl¨aßlich f¨ur die Funktion des Proteins ist.
P-Protein: Das P-Protein ist zusammen mit dem L-Protein verantwortlich f¨ur die RNA-Synthese und bildet mit diesem den RNA-Polymerasekomplex. Es ist ebenso wie das N-Protein Bestandteil des Nukleokapsids. F¨ur das Masernvirus wird angenommen, daß etwa 100 AS am Carboxy-Terminus an der Bindung an das Nukleokapsid beteiligt sind (HartyundPalese, 1995). Dieser Teil bleibt beim Sendai-Virus (ein Respirovirus) auch nach proteolytischem Verdau des Nukleokapsids an dieses gebunden (Chinchar und Portner, 1981). Das P-Protein sitzt zusammen mit dem L-Protein in mehreren Haufen (Clustern) auf dem Nukleokapsid.
Das Gen des CDV-P-Proteins kodiert f¨ur 662 AS. Das P-Protein ist stark phosphory- liert, diese Phosphorylierung tritt vor allem am N-Terminus des Proteins auf. Es weist in- nerhalb der Morbillivirus-Proteine den geringsten Homologiegrad auf. Allerdings gibt es kurze Bereiche, in denen die Sequenz bei allen Morbillivirus-Proteinen hoch konserviert ist (Sheshberadaranet al., 1986). Diese erm¨oglichen die Konstruktion einer Genson- de, die mit der RNA aller bekannten Morbilliviren hybridisiert (Barrettet al., 1991).
Das Gen f¨ur das P-Protein kodiert auch f¨ur zwei weitere Nichtstrukturproteine, das C- Protein und das V-Protein. Das C-Protein wird in einem alternativen Ableseraster ko- diert. F¨ur das C-Protein des Sendai-Virus wurde gezeigt, daß es die antivirale Funktion von Interferonαundβ(IFNα/β) unterdr¨uckt (Garcinet al., 1999;Gotohet al., 2000).
Zudem scheint es eine wichtige Rolle beim Zusammenbau der Virionen (z. B.bei RPV und Sendai-Virus) zu spielen, indem es den Einbau der Virusproteine in die Virionen unterst¨utzt (Sweetman et al., 2001;Hasanet al., 2000). Es ist bei allen Morbilliviren hoch konserviert, stark basisch und cysteinreich.
Das V-Protein entsteht dadurch, daß bei der Transkription nach Ablesen von 3/4 des Leserasters f¨ur das P-Protein ein
”editing“-Prozeß stattfindet, bei dem ein zus¨atz- licher Guanosin-Rest eingef¨ugt wird. Dadurch entsteht ein Protein mit einem neuen C-Terminus, der sehr cysteinreich ist. Dieser Bereich des V-Proteins weist eine hohe Homologie zu den Sequenzen anderer Morbilliviren auf. Das V-Protein ist kein Struk- turprotein des Virus, d. h. es tritt in infekti¨osen Virionen nur in geringen Mengen auf. Es spielt aber eine Rolle bei der Pathogenit¨at des Virus. Beim MV und beim Sendai-Virus mit fehlendem oder mutiertem V-Protein zeigt sich eine deutlich geringere Pathogenit¨at (Patterson et al., 2000; Tober et al., 1998; Huang et al., 2000). Beim Simian Vi- rus 5 (einem Rubulavirus) konnte nachgewiesen werden, daß durch das V-Protein die Interferon-Signalkette der infizierten Zelle blockiert wird (Didcock et al., 1999).
M-Protein: Das M-Protein ist das kleinste Strukturprotein. Es hat vermutlich eine Funktion bei der Zusammensetzung aller Viruskomponenten nach ihrer Produktion in der Zelle. Dabei sorgt es daf¨ur, daß die viralen H¨ullproteine und das Nukleokapsid an der Plasmamembran der Zelle versammelt werden, zur Vorbereitung der Freisetzung des Virus im
”budding“-Prozess. Wahrscheinlich tr¨agt es auch zur Stabilisierung des Virions
bei (Barrett et al., 1991).
Das Gen des M-Proteins kodiert f¨ur 335 AS. Es ist eines der am st¨arksten kon- servierten Proteine der Morbilliviren. Vor allem der hydrophobe C-Terminus ist stark konserviert. Es wird vermutet, daß dieser Teil mit der Zell-Membran interagiert.
F-Protein: Das F-Protein ist eines der beiden Glykoproteine der Lipidh¨ulle des Virus.
Es ist ein Glykoprotein des Typs I mit einer Signalsequenz am N-terminalen Ende des Proteins, die den Transport zur Membran bewirkt und einer hydrophoben Region (AS 606-629) am C-terminalen Ende des Proteins, die als Verankerung in der Membran dient.
Es wird als inaktives Vorl¨auferprotein F0 synthetisiert. Die aktiven Untereinheiten F1 (AS 225-620) und F2 (AS 1-224) enstehen durch Spaltung, bleiben jedoch ¨uber eine Di- sulfidbr¨ucke (zwischen AS 180 und AS 307) miteinander verbunden (ScheidundChop- pin, 1977;HardwickundBussell, 1978;Varsanyiet al., 1987). Durch die Spaltung wird am N-Terminus des F1-Proteins ein stark hydrophober Bereich (AS 225-255) freige- legt, der die Fusion der Virush¨ulle mit der Zellmembran und die Fusion infizierter Zellen miteinander vermittelt (Richardson et al., 1980; Richardson und Choppin, 1983).
Von der F2-Untereinheit wird noch das Signalpeptid abgespalten, dessen L¨ange nicht genau bekannt ist. Das F-Protein ist das am st¨arksten konservierte Protein der Morbilli- viren. Antik¨orper gegen das F-Protein haben z.T. neutralisierende Wirkung und k¨onnen vor einer Erkrankung sch¨utzen.
Die Spaltung des F-Proteins in die Untereinheiten F1 und F2 ist wichtig f¨ur die biologische Aktivit¨at des Proteins. Diese Spaltung k¨onnte auch f¨ur die Unterscheidung in virulente und avirulente Virusisolate verantwortlich sein. Beim Newcastle Disease Virus (NDV), einem Respirovirus, wird das F-Protein von virulenten Isolaten in allen Zelltypen gespalten, w¨ahrend dies bei avirulenten Isolaten nur in Zellen bestimmter Organe passiert (Nagai et al., 1976; Kingsbury, 1991). Dies scheint aber bei den Morbilliviren (CDV, MV, RPV) nicht der der Fall zu sein (Liermannet al., 1998;Rota et al., 1992).
H-Protein: Das H-Protein ist das zweite Glykoprotein der Lipidh¨ulle. Es ist ein Mem- branprotein des Typs II, d. h. es besitzt kein Signalpeptid an seinem N-terminalen Ende.
Die an dieser Stelle sitzende hydrophobe Region (AS 35-55) dient als Verankerung in der H¨ullmembran und wird auch als Transmembranbereich bezeichnet. Das H-Protein ist verantwortlich f¨ur das Anheften des Virus an seinen Rezeptor und beeinflußt daher den Zelltropismus des Virus (Barrett et al., 1991; Stern et al., 1995). So ist das H-Protein entscheidend f¨ur die Wirtsspezifit¨at der Morbilliviren. Es scheint auch ent- scheidende Bedeutung f¨ur die Pathogenit¨at der verschiedenen Virusisolate zu haben. So wird die Fusionsaktivit¨at eines Virusisolates haupts¨achlich vom H-Protein bestimmt und weniger vom F-Protein (von Messling et al., 2001). Die meisten gegen das H-Protein gerichteten Antik¨orper haben neutralisierende und protektive Wirkung. Es wird ver-
mutet, daß das H-Protein eine Propeller-¨ahnliche Struktur mit 6 Bl¨attern einnimmt, die
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uber einen Stamm miteinander verbunden sind. Jedes Blatt soll aus einer Faltblattstruk- tur aus je vier AS-Ketten bestehen, die durch Schleifen (
”loops“) miteinander verbunden sind (Langedijk et al., 1997). Beim Masernvirus wurde eine dieser Schleifen als neu- tralisierendes Epitop erkannt (Fournier et al., 1997).
Das Gen des H-Proteins von CDV kodiert f¨ur 607 AS bzw. 604 AS beim CDV- Impfvirusstamm Onderstepoort. Innerhalb der Morbilliviren besitzt es zusammen mit dem P-Protein die am geringsten konservierte Sequenz.
L-Protein: Das L-Protein ist ein Bestandteil des Nukleokapsids. Es hat vermutlich multiple Funktionen. Unter anderem fungiert es zusammen mit dem P-Protein als ei- ne virale RNA-Polymerase. Es ist vermutlich als Proteinkinase auch an der Phospho- rylierung der N- und P-Proteine beteiligt. Es ist das gr¨oßte Protein der Morbilliviren (Mr ≈240.000) und wird in der infizierten Zelle in der geringsten Konzentration gebildet (Kingsbury, 1991).
2.1.5. Klinik der Staupeerkrankung
Die Aufnahme des Virus erfolgt oral oder ¨uber Aerosole. Die Virusvermehrung findet zun¨achst in den lymphatischen Geweben des Rachenrings und den Bronchiallymphkno- ten statt. Die Inkubationszeit nach einer Infektion mit CDV betr¨agt durchschnittlich eine Woche. In der vir¨amischen Phase kommt es zu einem ersten Fieberschub (Appel, 1987).
Dieser bleibt h¨aufig unbemerkt, kann aber auch mit leichten Allgemeinst¨orungen, Anor- exie, Durchfall und Konjunktivitis einhergehen. Zu Beginn der Organbesiedlung wenige Tage sp¨ater kommt es zu einem zweiten Fieberanstieg. Je nach besiedeltem Hauptorgan ergeben sich verschiedene Formen der Staupe, die gastrointestinale mit Durchfall und Erbrechen oder die respiratorische mit Bronchopneumonie und Rhinitis. Diese k¨onnen auch gemeinsam auftreten. In manchen F¨allen kann es auch zu einer Hyperkeratose an Nasenspiegel und Ballen kommen (
”hard pad disease“). Bei einer Infektion w¨ahrend der Zahnbildung kommt es zu Schmelzdefekten an den Z¨ahnen (Staupegebiß).
Nach dieser akuten Symptomatik, z. T. aber auch ohne akut-systemische Symptome, kann es zu nerv¨osen Ausfallerscheinungen kommen. Diese ¨außern sich u. a. in epilepti- schen Anf¨allen, Myoklonien, Ataxien, Paresen und Paralysen.
H¨aufig werden die Symptome durch bakterielle Sekund¨arinfektionen verschlimmert.
Diese werden durch die von der Staupeinfektion hervorgerufene Immunsuppression be- g¨unstigt. Es kommt zu schweren Bronchopneumonien, mukopurulenter Konjunktivitis und Pyodermien. Auch virale Sekund¨arinfektionen treten auf. Besonders das canine Par- vovirus spielt hier eine Rolle und kann die Letalit¨at bis auf 100% ansteigen lassen.
Eine Sonderform der Staupeerkrankung ist die
”old dog encephalitis“. Dies ist eine Sp¨atform, bei der das Virus im ZNS der Tiere persistieren kann. Zum Auftreten von
Krankheitserscheinungen kommt es z. T. erst Jahre nach der Infektion. Die Erkrankung zeigt sich in motorischen und psychischen Ausfallerscheinungen.
2.1.6. Epidemiologie
Die Hundestaupe ist in den meisten Gebieten der Erde enzootisch. Nur in heiß-trockenen Gegenden (z. B. Teilen Afrikas) kommt sie nicht vor. CDV hat ein weites Wirtsspektrum.
Es kann fast alle Familien der Ordnung Carnivora infizieren. Empf¨anglich sind alle Mit- glieder der Familien Canidae (z.B Hund, Fuchs, Dingo), Mustelidae (z. B. Wiesel, Frett- chen, Otter) und Procyonidae (z. B. Waschb¨ar, Panda) (Appel und Gillespie, 1972).
Die Mitglieder der Familie Felidae k¨onnen wahrscheinlich alle infiziert werden, wobei aber die meisten keine Symptome entwickeln (Appel et al., 1974). Einige Großkatzen- arten sind allerdings in den letzten Jahren in der Serengeti und in US-amerikanischen Zoos mit klinischen Symptomen an Staupe erkrankt und gestorben.
Morbilliviren haben eine geringe Tenazit¨at gegen¨uber Umwelteinfl¨ussen. Sie werden schnell durch Hitze inaktiviert. Auch in Wasser und bei Antrocknung auf Oberfl¨achen erfolgt eine schnelle Inaktivierung, so daß es nur in seltenen F¨allen zu einer ¨Ubertragung
¨uber Wasser kommt. Der Haupt¨ubertragungsweg ist der durch Aerosole bei direktem Kontakt (Appel, 1969).
Morbilliviren besitzen alle ein hohes ¨Ubertragungspotential. Dadurch f¨uhren sie in einer voll empf¨anglichen Population zu explosionsartigen Ausbr¨uchen, bei denen schnell ein Großteil der Population erkrankt. Da sie aber eine belastbare, meist lebenslange Immunit¨at hinterlassen, enden diese Ausbr¨uche schnell wieder. Ein solcher
”virgin-soil“- Ausbruch wurde 1988 in Nordgr¨onland beobachtet (Bohm et al., 1989). Dabei starben 1000 der 3000 dort gehaltenen Hunde an Staupe.
Ist die Population klein, sind innerhalb kurzer Zeit keine empf¨anglichen Tiere mehr vorhanden und das Virus wird in dieser Population eliminiert, falls kein Reservoirwirt vorhanden ist. Die nachfolgenden Generationen sind erneut voll empf¨anglich f¨ur das Virus und es kann wieder zu einem Ausbruch kommen, wenn das Virus von außen in die Population eingetragen wird. F¨ur CDV ist der Hund als Reservoir f¨ur das Virus bekannt. In großen Populationen findet das Virus immer genug empf¨angliche Tiere (v.a.
Jungtiere), die infiziert werden k¨onnen, so daß die Erkrankung endemisch wird. Die Gr¨oße der Population, ab der es zu einem endemischen Auftreten kommt, ist abh¨angig von mehreren Faktoren. Die H¨aufigkeit der Individualkontakte innerhalb der Population, die Menge des ausgeschiedenen Virus und die Kontagiosit¨at und Virulenz des CDV- Isolates z¨ahlen dazu.
Durch die Einf¨uhrung der Vakzinierung nahm die H¨aufigkeit der Erkrankungen vor allem in den Industriel¨andern stark ab. Allerdings kommt es doch immer wieder zu Aus- br¨uchen der Krankheit. Dies liegt z. T. an der zu geringen Zahl immunisierter Tiere. Der Anteil immunisierter Tiere in einer Population schwankt nach verschiedenen Angaben
zwischen 50% und 80%. Dies ist nicht ausreichend, um das Virus aus der Population zu eliminieren. F¨ur MV wurde vermutet, daß eine Immunisierungsrate von 99% ben¨otigt wird, um die ¨Ubertragung des Virus zu stoppen (Black, 1991). Zu dem Anteil nicht- vakzinierter Tiere kommen die Tiere, bei denen die Vakzinierung nicht den gew¨unschten Effekt hatte (Impfversagen). Dadurch erh¨oht sich die Zahl der empf¨anglichen Tiere. Da- zu kommt, daß das Virus auch einen Großteil der Wildcarnivoren infiziert und hier ein großes Reservoir an empf¨anglichen Wirtstieren vorliegt, so daß auch bei einer zu 100%
geimpften Hundepopulation das Virus erhalten bliebe.
Die molekulare Epidemiologie hat in den letzten Jahren gezeigt, daß sich zwischen Virussisolaten von verschiedenen Kontinenten unterscheiden l¨aßt (Chamberlainet al., 1993). Diese unterscheiden sich durch Aminos¨aureaustausche, die nur bei bestimmten Linien zu finden sind. So lassen sich Stammb¨aume der Virusisolate aufbauen, die ihre Entwicklung von den heute verwendeten Impfst¨ammen (isoliert in den 50iger Jahren) zu den heute vorkommenden Feldisolaten und die Aufspaltung in verschiedene Linien zeigen.
2.1.7. Diagnostik
F¨ur die Diagnose einer Staupeerkrankung k¨onnen der direkte Virusnachweis oder der Nachweis virusspezifischer Antik¨orper verwendet werden (indirekter Erregernachweis).
2.1.7.1. Methoden des Antik¨orpernachweises
F¨ur die Diagnose einer akuten Staupeerkrankung wird eine gepaarte Serumprobe im Abstand von 3-4 Wochen ben¨otigt. Dabei spricht ein Anstieg von 4 Titerstufen des Antik¨orpertiters f¨ur eine akute Erkrankung. Eine andere M¨oglichkeit, eine akute Er- krankung mit Hilfe von Antik¨orpern zu bestimmen, ist die Bestimmung der Antik¨orper der IgM-Klasse. Diese lassen sich nach einer Infektion nur f¨ur ca. 2 Monate nach- weisen und erlauben so die Diagnose einer k¨urzlich erfolgten Infektion oder Impfung (Blixenkrone-Møller et al., 1991). Auch zur ¨Uberpr¨ufung eines Impferfolges eignet sich der Antik¨orpernachweis. Es k¨onnen verschiedene Techniken verwendet werden.
Virusneutralisationstest (VNT) Mit dem Virusneutralisationstest (VNT) lassen sich die das Virus neutralisierenden Antik¨orper bestimmen. Die neutralisierenden An- tik¨orper bewirken eine Inaktivierung des Virus und haben so eine protektive Wirkung bei einer Infektion. Dabei werden Neutralisationstiter von gr¨oßer als 100 als protektiv angesehen. Titer zwischen 20 und 100 gelten als Grenzbereich (Appel, 1987). Nach an- deren Angaben (Olson et al., 1988; Gillespie et al., 1958) werden Titer von gr¨oßer 16 bzw. gr¨oßer 30 als sch¨utzend angesehen.
Die Durchf¨uhrung des VNT erfolgte urspr¨unglich als Chorioallantois-Membran-Test im embryonierten H¨uhnerei, wobei die Reduktion der Plaques auf der Chorioallantois-
Membran bewertet wurde. Diese Methode ist allerdings sehr zeit- und arbeitsaufwendig.
Daher wurde der Neutralisationstest auch in verschiedenen Zellkulturen durchgef¨uhrt (Rockborn, 1958a). Appel und Robson (1973) entwickelten die Durchf¨uhrung des VNT im Mikrotitersystem. Die Auswertung erfolgt ¨uber die mikroskopische Untersu- chung auf morbillivirusspezifische zytopathische Effekte (CPE) in Verozellen. Zur Ver- einfachung der Auswertung k¨onnen die virusinfizierten Zellen auch mittels markierter Antik¨orper dargestellt werden. Hierzu eignen sich Fluoreszenz-markierte Antik¨orper so- wie Peroxidase-gekoppelte Antik¨orper.
Zaghawa (1990) verwendetete f¨ur die Anf¨arbung von virushaltigen Zellen Per- oxidase-gekoppeltes anti-CDV-Hyperimmunserum. Dieser als
”Neutralizing-peroxidase- linked-assay“ (NPLA) bezeichnete Test verk¨urzt außerdem die Zeit bis zur Auswertung gegen¨uber der Auswertung ¨uber CPE von einer Woche auf drei Tage.
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Mit dem ELISA werden im Ge- gensatz zum VNT nicht nur die virusneutralisierenden Antik¨orper bestimmt, sondern alle virusspezifischen Antik¨orper. Es k¨onnen unterschiedliche ELISA-Arten zur Bestim- mung von Antik¨orpertitern genutzt werden. Die einfachste M¨oglichkeit ist der direkte ELISA, bei dem das Antigen an die verwendete Mikrotiterplatte gekoppelt wird (Noon et al., 1980; Potgieter und Ajidagba, 1989). Auch verschiedene Sandwich-ELISA k¨onnen zur Bestimmung verwendet werden. Beim einfachen Sandwich-ELISA wird ein Anti-CDV-Antik¨orper an die Mikrotiterplatte gekoppelt, an den dann das Antigen ge- bunden wird (Gemma et al., 1996). Beim Protein A-Sandwich-ELISA wird Protein A an die Mikrotiterplatte gekoppelt. An das Protein A wird der Anti-CDV-Antik¨orper gebunden und weiter wie beim einfachen Sandwich ELISA verfahren. Die Sensitivit¨at ist beim Protein A-Sandwich-ELISA etwa 100-mal besser als beim direkten ELISA (Potgieter und Ajidagba, 1989). Bei einem weiteren Sandwich-ELISA wird rekom- binant exprimiertes CDV N-Protein ¨uber einen CDV N-Protein spezifischen mAk an die Mikrotiterplatte gebunden. Dieser ELISA zeigte eine hohe Sensitivit¨at und Spezi- fit¨at (von Messling et al., 1999). Durch die Wahl des sekund¨aren Antik¨orpers ist es beim ELISA m¨oglich, zwischen Antik¨orpern verschiedener Immunglobulinklassen (IgG, IgM) zu unterscheiden (Kinget al., 1993). Da bei der Unterscheidung von IgG und IgM- Antik¨orpern die Bestimmung von IgM z.T. falsch negativ sein kann, weil IgM-Antik¨orper durch IgG Antik¨orper verdr¨angt werden, entwickelten Blixenkrone-Møller et al.
(1991) einen Sandwich-ELISA zur Bestimmung von IgM-Antik¨orpern. Es werden dazu Anti-IgM-Antik¨orper an die Mikrotiterplatte gekoppelt, die die in der Probe enthaltenen IgM-Antik¨orper herausfangen.
Immunfluoreszenz-Test Die Bestimmung von Antik¨orpern erfolgt mit dem indirek- ten Immunfluoreszenz-Test. Als Antigen finden virusinfizierte Zellen Verwendung. Als sekund¨are Antik¨orper werden Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-markierte Anti-Hund-Ig
AK verwendet, die an die prim¨aren virusspezifischen Antik¨orper aus dem Serum binden.
Durch die Wahl des sekund¨aren Antik¨orpers ist auch die Unterscheidung der verschie- denen Immunglobulinklassen m¨oglich (K¨olbl und Schuller, 1988). Mit dem Immun- fluoreszenztest werden alle virusspezifischen Antik¨orper nachgewiesen.
2.1.7.2. Methoden des Antigennachweises
Nachweis von Virusantigen in Geweben Der postmortale Nachweis von CDV- Antigen ist relativ leicht zu erreichen. Ausgangsmaterial sind Abklatschpr¨aparate von Lymphknoten, Blasenepithel oder Kleinhirn, die mit CDV-spezifischen FITC-markierten Antik¨orpern angef¨arbt werden. Auch formalin-fixierte Gewebeschnitte k¨onnen auf diese Weise angef¨arbt werden. Eine weitere M¨oglichkeit zur Darstellung von CDV-Antigen in Geweben ist die Anf¨arbung mittels der Immunperoxidase-Technik, bei der mit Peroxida- se gekoppelte CDV-spezifische Antik¨orper verwendet werden (Ducatelleet al., 1980).
Weiterhin ist der histopathologische Nachweis von Einschlußk¨orperchen in Gehirnzellen, Lunge und Blasenepithel als Methode geeignet (Appel, 1987).
Bei lebenden Tieren ist der Nachweis schwieriger. Hier kann Virusantigen in Ab- klatschpr¨aparaten von der Konjuntiva und der Vaginalschleimhaut oder in Zellen der Cerebro-Spinal-Fl¨ussigkeit und Buffy coat-Zellen mittels Immunfluoreszenz nachgewie- sen werden (Appel, 1969). Allerdings fallen diese Nachweise im Falle einer subakuten Erkrankung oder einer sp¨aten Enzephalitis, wenn die Serumantik¨orpertiter hoch sind, h¨aufig negativ aus (Appel und Baker, 1991).
Isolierung von Virus in Zellkultur Der Nachweis von Virus kann auch durch die Isolierung des Virus in der Zellkultur erfolgen. Die Isolierung kann in prim¨aren oder in permanenten Zellinien erfolgen. Als prim¨are Zellinie werden prim¨are Hundehirnzellen (DBCC=Dog brain cell cultures) verwendet (Hamburgeret al., 1991). Das Virus l¨aßt sich in dieser Zellinie vermehren und beh¨alt seine Virulenz f¨ur den Hund.
Als permanente Zellinie kommen verschiedene Linien in Betracht. Die am h¨aufig- sten verwendete Zellart sind Verozellen (African Green Monkey Kidney Cells). An diese Zellinie adaptiert sich virulentes Virus allerdings nur langsam, so daß h¨aufig die Isolie- rung mißlingt. Eine M¨oglichkeit, die Ergebnisse zu verbessern, ist die Kokultivierung von Hundelymphozyten und Verozellen. Dazu werden die Lymphozyten des erkrankten Hundes aus seinem Blut isoliert und zusammen mit Lymphozyten eines gesunden Tieres mit den Verozellen kokultiviert (Appelet al., 1992). Eine weitere zur Anwendung kom- mende Zellinie ist die Linie B95a (Kai et al., 1993). Die Adaptierung des CDV an diese Zellinie gelingt h¨aufig schneller als an Verozellen. Der Nachweis des isolierten Virus in der Zellkultur kann ¨uber den virusspezifischen zytopathischen Effekt (Synzytienbildung) erfolgen. F¨ur einen immunologischen Nachweis des isolierten Virus in der Zellkultur kann der indirekte Immunfluoreszenztest oder der Peroxidase-linked-assay (Zaghawa, 1990)
verwendet werden.
2.1.7.3. Methoden des Nukleins¨aurenachweises
Eine sensitive und spezifische Methode zum Nachweis von CDV-Nukleins¨auren ist die RT-PCR. Mit ihr l¨aßt sich virale RNA sowohl in infizierten Geweben als auch in Blut und Liquor nachweisen (Haas et al., 1990;Moritz et al., 1998).
Auch am lebenden Tier ist der Nukleins¨aurenachweis mittels RT-PCR aus Blut und Liquor ist m¨oglich.
2.1.8. Prophylaxe
F¨ur die aktive Immunisierung gegen CDV stehen seit den f¨unfziger Jahren attenuierte Lebendimpfstoffe zur Verf¨ugung. Der erste Stamm wurde vonHaig (1948) beschrieben.
Es handelt sich hier um den H¨uhnerei-adaptierten CDV-Stamm Onderstepoort. Den an Hundenierenzellen adaptierten Stamm Rockborn beschrieb Rockborn (1958). Diese beiden sind die in heutigen Vakzinen meistverwendeten St¨amme.
Welpen, deren Mutter ausreichend Antik¨orper gegen CDV besitzt, sind in den er- sten Lebenswochen durch maternale Antik¨orper vor einer Staupeerkrankung gesch¨utzt.
Dieser passive Schutz reicht etwa bis zum Alter von 6-10 Wochen, abh¨angig vom An- tik¨orpertiter der Mutter und von der Menge der diaplazentar und laktogen vom Welpen aufgenommenen Antik¨orper. Die Halbwertszeit der maternalen Antik¨orper betr¨agt etwa 9 Tage.
F¨ur einen m¨oglichst l¨uckenlosen Schutz sollte die Immunisierung von Welpen erst- malig im Alter von ca. 8 Wochen erfolgen. Zu diesem Zeitpunkt sind die maternalen Antik¨orpertiter meist so weit abgesunken, daß sie den Impferfolg nicht mehr verhindern.
Eine Wiederholungsimpfung sollte im Alter von 12 Wochen erfolgen. Dies sichert eine Immunisierung auch f¨ur den Fall, daß im Alter von 8 Wochen ein hoher maternaler Antik¨orpertiter eine Neutralisierung des Impfvirus zur Folge hatte. Die Zeitangaben f¨ur Auffrischimpfungen variieren zwischen j¨ahrlicher Revakzinierung (Prydie, 1966) und einem Intervall von 3-5 Jahren zwischen den einzelnen Impfungen (Olson et al., 1997).
Es wurden verschiedene M¨oglichkeiten untersucht, einen Schutz gegen CDV bei sehr jungen Welpen trotz maternaler Antik¨orper zu erreichen. Hierzu werden Impfstoffe mit dem Masernvirus verwendet, die eine Kreuzimmunit¨at gegen das CDV bewirken. Dies funktioniert jedoch nur solange, wie das Muttertier nicht als Welpe auch schon mit MV immunisiert worden war und so auch MV-Antik¨orper an die Welpen weitergibt (Torney, 1967), da auch der MV-Antik¨orpertiter bei einer Impfung mit CDV geboo- stert werden kann. Ein weiterer Weg zur Immunisierung von Welpen mit hohen materna- len Antik¨orpertitern ist die Verwendung von Impfstoffen mit einem sehr hohen Virustiter (¿105 KID50). Hier wird von der Annahme ausgegangen, daß nicht alle Viren durch die noch vorhandenen Antik¨orper neutralisiert werden (ChalmersundBaxendale, 1994).
Neue Impfstoffe befinden sich in der Erprobung. Hier werden rekombinante Pockenvi- ren, die das H- und/oder F-Gen des CDV enthalten verwendet. Auch Immunisierung mit reinem F-Protein bewirkt die Ausbildung virusneutralisierender Antik¨orper und sch¨utzt vor einer Erkrankung (Norrby et al., 1986). Weitere Forschung wird auf dem Gebiet der Peptidvakzinen gegen das Masernvirus betrieben. Es wurden mehrere Peptide aus der Sequenz des H- und F-Proteins beschrieben, die virusneutralisierende Eigenschaf- ten aufweisen und M¨ause vor einer Erkrankung mit Masern sch¨utzen k¨onnen (Obeid et al., 1995; Obeid et al., 1996; Steward et al., 1995; Fournier et al., 1997). Eini- ge dieser Peptide bewirken auch in der Anwesenheit von maternalen Antik¨orpern die Ausbildung einer protektiven Immunantit¨at bei M¨ausen (Obeid und Steward, 1994).
2.2. Methoden zur Charakterisierung von Virusisolaten
Die klassische Methode zur Differenzierung von Virusisolaten beruht auf serologisch meß- baren Unterschieden zwischen den Isolaten. Da bisher nur ein Serotyp des Staupevirus identifiziert wurde, gilt es als serologisch einheitliches Virus. Diese Annahme wird auch dadurch unterst¨utzt, daß eine Infektion eine haltbare und wahrscheinlich lebenslange Immunit¨at zur Folge hat. Alle Arten des Genus Morbillivirus sind eng miteinander ver- wandt, so daß es zur Ausbildung kreuzreaktiver Antik¨orper kommt. Die meisten Arten der Morbilliviren sind aber klar durch ihr unterschiedliches Wirtsspektrum gegeneinan- der abgegrenzt. Probleme bereiten hier allerdings sowohl RPV und PPRV, die ein sich
¨uberschneidendes Wirtsspektrum besitzen, als auch CDV und PDV, deren Wirtsspek- trum sich ebenfalls ¨uberschneidet. Allerdings lassen sich mit verschiedenen Methoden doch Unterschiede zwischen einzelnen Virusisolaten feststellen.
2.2.1. Molekularbiologische Methoden (Charakterisierung auf Nukleins¨aureebene)
Zur Charakterisierung von verschiedenen Virusisolaten und zur Feststellung ihrer Ver- wandtschaft insbesondere mit anderen Morbilliviren eignet sich die Sequenzierung der viralen RNA und die daraus abgeleitete Proteinssequenz. F¨ur CDV ist die gesamte Nucleotidsequenzequenz des Impfstammes Onderstepoort bekannt (Barrett et al., 1985; Rozenblatt et al., 1985; Bellini et al., 1986; Barrett et al., 1987; Sidhu et al., 1993a; Curran et al., 1991; Sidhu et al., 1993b). Auch von verschiedenen an- deren Virusisolaten wurden mehrere Gene sequenziert. Mit der Sequenzierung der Gene werden verschiedene Ziele verfolgt. Sie kann dazu dienen, die Verwandtschaft eines neu aufgetretenen Virusisolates mit schon bekannten Isolaten abzuleiten. Sie kann aber eben- so zur Suche nach Ver¨anderungen zwischen Virusisolaten dienen, die verantwortlich sind f¨ur die Auspr¨agung unterschiedlicher Virulenz.
Das N-Gen wurde von mindestens 6 Virusisolaten in seiner vollen L¨ange sequenziert.
Von weiteren Isolaten wurden Teilst¨ucke des Gens bestimmt (Stettler et al., 1997).
Die Nucleotidsequenzen unterscheiden sich in bis zu 7% der Nucleotide. Die abgelei- tete Aminos¨aurensequenz weist Unterschiede bis zu 5% auf (Yoshida et al., 1998).
Die gr¨oßten Unterschiede liegen zwischen dem Stamm Onderstepoort und aktuell zir- kulierenden Feldisolaten vor. Dabei l¨aßt sich in der Aminos¨aurensequenz zwischen dem variablen N-Terminus, dem variablen C-Terminus und dem hochkonservierten Mittelteil unterscheiden (Yoshida et al., 1998; Stettler und Zurbriggen, 1995). Stettler undZurbriggen(1995) vermuten, daß der C-Terminus des N-Proteins, der vermutlich mit dem M-Protein interagiert, mitverantwortlich ist f¨ur Unterschiede zwischen virulen- ten und avirulenten Isolaten.
F¨ur das P-Gen sind bisher mindestens vier vollst¨andige Sequenzen bekannt. Dies sind der Impstamm Onderstepoort (Barrett et al., 1995) und drei japanische Feldi- solate (Wakasa et al., 2000). Es wurden von weiteren Virusisolaten, die aus unter- schiedlichen Erdteilen und von verschiedenen Tierarten (Hund, Fuchs, L¨owe, Leopard, Seehund) isoliert worden sind, Teilst¨ucke der Sequenz ver¨offentlicht. Zwischen diesen Sequenzen lassen sich Unterschiede von bis zu 6% der Nucleotide feststellen (Wakasa et al., 2000;Haaset al., 1996). Die Isolate lassen sich auf Grund einer phylogenetischen Verwandtschaftsanalyse in geographische Gruppen einteilen, w¨ahrend sich keine tierart- spezifischen Gruppen feststellen lassen (Harderet al., 1995;Harderet al., 1996;Car- penteret al., 1998).
Vom M-Gen sind nur wenige Sequenzen bekannt. Vor allem fehlen Sequenzen von aktuellen CDV-Isolaten der letzen Jahre. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Vi- rusisolaten sind hier im Vergleich zu den anderen Virusproteinen gering. Sie liegen bei bis zu 8% auf der Nucleotidebene und bei bis zu 4% auf der AS-Ebene (Stettler et al., 1997). Es wurde auch ein m¨oglicher zweiter Leserahmen (
”open reading frame“, ORF) in 4 Isolaten gefunden, der sich auch in anderen Morbilliviren wiederfinden l¨aßt.
Der Impfstamm Onderstepoort besitzt keinen solchen zweiten Leserahmen, w¨ahrend der Impfstamm Rockborn ebenfalls diesen Ableserahmen enth¨alt. Ob das korrelierende Pro- tein in vivo exprimiert wird, ist nicht bekannt.
F¨ur das F-Gen liegen bisher nur einige vollst¨andige Sequenzen vor. Es sind aber von weiteren Virusisolaten Teilsequenzen des Gens ver¨offentlicht worden. Diese zeigen, daß die Unterschiede auf der Nucleotidebene bei ca 10% zwischen dem Impfstamm Onder- stepoort und aktuellen Feldisolaten liegen, innerhalb der Feldisolaten liegen diese Un- terschiede bei ca. 6%. Die Aminos¨aurensequenz ist st¨arker konserviert als die Nucleo- tidsequenz. Hier liegen die Unterschiede bei 4% bzw. 3% (Iwatsuki et al., 1998). Dies stimmt mit den Untersuchungen ¨uberein, die das F-Protein als das am st¨arksten konser- vierte Protein unter den Morbilliviren bezeichnen. Allerdings zeigte sich bei Feldisolaten aus den letzten Jahren eine deutliche Abweichung des N-Terminus des Proteins von der des Onderstepoort-Stamms. Die gleichen Abweichungen zeigt aber auch der Impfstamm Rockborn gegen¨uber Onderstepoort (Liermannet al., 1998). Noch st¨arkere Unterschie-
de zwischen den einzelnen Virusisolaten lassen sich in dem zwischen dem Leserahmen f¨ur das M- und F-Protein liegenden nicht translatierten Abschnitt finden. Hier liegen die Unterschiede zwischen den einzelnen Isolaten bei ¨uber 20% (Liermannet al., 1998)
Vom H-Gen sind die meisten kompletten Sequenzen bekannt. Von allen gr¨oßeren Staupeausbr¨uchen der letzten Jahre weltweit wurden von den dort isolierten Viren die Sequenzen f¨ur das H-Gen bestimmt. Das H-Protein weist unter allen Morbilliviruspro- teinen die h¨ochste Variabilit¨at auf und eignet sich dadurch am Besten zur Suche nach genetischen Ver¨anderungen. So wurden auch zwischen den verschiedenen Sequenzen Un- terschiede von bis zu 10% sowohl auf der Nucleotidebene als auch in den daraus ab- geleiteten Proteinsequenzen gefunden. Diese Unterschiede sind wiederum am gr¨oßten zwischen dem Impfstamm Onderstepoort auf der einen Seite und den aktuellen Feldi- solaten auf der anderen Seite. Der Unterschied zwischen einzelnen Feldisolaten der letz- ten 10 Jahre betr¨agt bis zu 7% (Iwatsuki et al., 1997). Die f¨ur die Sekund¨arstruktur verantwortlichen Aminos¨auren des H-Proteins sind allerdings hoch konserviert (Haas et al., 1997; Bolt et al., 1997). Dagegen unterscheiden sich die Virusisolate in der Zahl der m¨oglichen Glykosylierungsstellen. Der Stamm Onderstepoort besitzt 4 m¨ogli- che Glykosylierungsstellen, w¨ahrend die aktuellen Feldisolate bis zu 9 besitzen. Diese werden auch, zumindest zum Teil, genutzt, was sich in einem h¨oheren Molekulargewicht des H-Proteins der Feldisolate zeigt (Iwatsuki et al., 1997). Auch beim Vergleich der verschiedenen H-Protein-Sequenzen lassen sich die Virusisolate in geographische Grup- pen aufteilen, die denen ¨ahneln, die durch Vergleich der P-Gen-Sequenzen untereinander gebildet wurden.
F¨ur das L-Gen liegen bisher keine Untersuchungen ¨uber Unterschiede in der Nucleo- tidsequenz und der Proteinsequenz zwischen verschiedenen Virusisolaten vor.
Die Unterschiede zwischen den einzelnen Virusgenen und ihren abgeleiteten Pro- teinen sind bei allen untersuchten Genen/Proteinen am gr¨oßten zwischen den Impfvi- russt¨ammen auf der einen Seite und den j¨ungsten Feldisolaten auf der anderen Seite. Es wurde vermutet, daß dies unter anderem darauf zur¨uckzuf¨uhren ist, daß die Impfst¨amme zahlreiche Passagen in der Zellkultur durchgemacht haben. Es ist jedoch unwahrschein- lich, daß die zum Teil sehr großen Unterschiede darauf zur¨uckzuf¨uhren sind. Sowohl beim MV als auch beim RPV wurden zwischen dem Impfstamm und seinem virulenten Vorl¨aufer nur geringe Unterschiede (ca. 1%) ausfindig gemacht (Rotaet al., 1994b;Ba- ronundBarrett, 1995), w¨ahrend beim RPV die Sequenz des H-Proteins von aktuellen Feldisolaten 10-12% und beim MV ca. 3% von dieser abweicht. Dies weist darauf hin, daß die Unterschiede sich darauf zur¨uckf¨uhren lassen, daß eine genetische Ver¨anderung der Virusisolate im Laufe der Zeit stattgefunden hat.
2.2.2. Molekulargewicht der Virusproteine
Unterschiede zwischen Virusproteinen von verschiedenen Virusisolaten k¨onnen sich in einer unterschiedlichen Molekulargewicht der Proteine ausdr¨ucken. Dies l¨aßt sich als un- terschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit in der SDS-Gelelektrophorese darstellen. Bei der SDS-Gelelektrophorese werden die durch Sodium-Dodecyl-Sulfat (SDS) mit einer negativen Ladung behafteten Proteine durch Anlegen einer Spannung zur Wanderung durch ein Polyacrylamidgel gebracht. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist dabei abh¨angig von ihrer Molekulargewicht. Zur Sichtbarmachung der Virusproteine eignen sich ver- schiedene Methoden. Beim Immuno- oder Westernblot werden die Proteine, nach ihrer Auftrennung, auf eine Membran ¨ubertragen (
”blotting“) und k¨onnen dort mit monoklo- nalen oder polyklonalen enzymmarkierten Antik¨orpern angef¨arbt werden. Eine weitere M¨oglichkeit zur Sichtbarmachung ist die Markierung der Proteine mit radioaktiven Sub- stanzen. Zur Darstellung einzelner Proteine werden diese vor der Gelelektrophorese mit Hilfe monoklonaler AK ausgef¨allt und das Pr¨azipitat f¨ur die Elektrophorese verwendet.
Die auftretenden Unterschiede in der Wanderungsgeschwindigkeit sind in der Regel nicht auf Unterschiede in der L¨ange der Aminos¨aurensequenz zur¨uckzuf¨uhren. Diese zeigt meist keine Unterschiede zwischen den einzelnen Virusisolaten. Es wird vermutet, daß der Grund in der unterschiedlichen Glykosilierung und Posphorylierung der einzelnen Proteine besteht. So wurde beim H-Protein bei drei Feldisolaten ein gr¨oßeres Moleku- largewicht als beim Onderstepoort-Stamm festgestellt. Dieser Unterschied verschwand, wenn die Glykosilierung blockiert wurde (Iwatsuki et al., 1997). Auch beim N-Protein konnten Unterschiede im Molekulargewicht bei verschiedenen Virusisolaten festgestellt werden. Mehrere Feldisolaten wiesen ein geringeres Molekulargewicht des N-Proteins auf als das N-Protein des Onderstepoortstammes (Yoshida et al., 1998; Shapshak et al., 1982).
2.2.3. Immunologische Methoden
Die molekularbiologischen Unterschiede zwischen den Virusisolaten lassen auf die phy- logenetische Abstammung und die genetische Drift der Virusisolate schließen. Sie sind allerdings nicht geeignet antigenen Unterschiede zwischen ihnen zu entdecken. Dazu m¨ussen immunologische Methoden verwendet werden, die Unterschiede in der Erken- nung durch das Immunsystem aufzeigen.
2.2.3.1. Kreuzreaktivit¨at polyklonaler Seren mit verschiedenen Virusisolaten
Eine M¨oglichkeit zur Erkennung antigener Unterschiede zwischen verschiedenen Virusi- solaten ist das Neutralisationsverhalten polyklonaler Seren gegen¨uber den Virusisolaten.
Dabei werden vor allem Unterschiede in den Epitopen des H-Proteins festgestellt, da
die meisten neutralisierenden Antik¨orper gegen dieses Protein gebildet werden. Kreuz- neutralisationsversuche wurden mit Seren von geimpften Hunden und von Tieren, die eine CDV-Infektion durchgemacht hatten gegen verschiedene Virusisolate durchgef¨uhrt.
Haaset al. (1997) zeigten, daß sich kein signifikanter Unterschied in den Neutralisations- titern von polyklonalen Seren gegen¨uber verschiedenen Virusisolaten (Verwendete Isola- te: Han2544/90, Onderstepoort, Rockborn) ausmachen ließ. In anderen Untersuchungen wurden allerdings Unterschiede zwischen den Neutralisationstitern von Seren, die ge- gen ein Feldisolat gerichtet waren, und Seren, die gegen den Onderstepoort-Impfstamm hergestellt worden waren, festgestellt. Das jeweils homologe Virus wurde von den Se- ren deutlich besser (bis zum Faktor 8) neutralisiert als das heterologe Virus (Gemma et al., 1996;Iwatsukiet al., 1997). Diese Unterschiede waren allerdings z. T. bei der Ver- wendung des Stammes Rockborn anstelle des Stamms Onderstepoort nicht nachweisbar (Appel et al., 1994)
Tamin et al. (1994) fanden bei MV Unterschiede im Neutralisationsverhalten von polyklonalen Seren von geimpften Personen und Personen, die eine MV-Infektion in den letzten Jahren durchgemacht hatten. Dabei wurden Impfst¨amme und Feldisolate von den Seren geimpfter Personen gleich gut neutralisiert, w¨ahrend die Seren der infizierten Personen deutlich (bis zu vierfach) h¨ohere Neutralisationstiter gegen¨uber den homologen Feldisolaten zeigten. Die Neutralisationstiter waren dabei gegen ein ¨alteres Feldvirus schlechter als gegen aktuelle und am schlechtesten gegen den Impfvirusstamm. Personen, die dagegen eine Infektion vor Einf¨uhrung der Impfung durchgemacht hatten, zeigten ein Verhalten wie die sp¨ater geimpften Personen. In anderen Untersuchungen, in denen Seren von geimpften Personen untersucht wurden, konnten ebenfalls keine Unterschiede in den Neutralisationstitern dieser Seren gegen¨uber Impf- und Feldisolaten festgestellt werden (Jin et al., 1998).
2.2.3.2. Kreuzreaktivit¨at monoklonaler Antik¨orper mit verschiedenen Virusisolaten
Zur Darstellung auch kleinster antigener Unterschiede zwischen einzelnen Virusisolaten eignet sich die Verwendung von monoklonalen Antik¨orpern (mAk). Bei diesen wird die Bindungsf¨ahigkeit der mAk an die verschiedenen Virusisolate untersucht. Dabei lassen sich Ver¨anderungen in dem f¨ur einen mAk spezifischen Epitop darstellen. Zum Teil reicht die Ver¨anderung einer AS, um die r¨aumliche Struktur eines Epitops so zu ver¨andern, daß ein Antik¨orper nicht mehr binden kann.
Bei den Untersuchungen mit mAk gegen Morbilliviren kann man in der Regel drei Gruppen von mAk unterscheiden. Eine Gruppe reagiert mit allen Morbilliviren und kann deshalb als genusspezifisch bezeichnet werden, d. h. daß alle Morbilliviren das von diesem mAk gebundene Epitop ausbilden. Diese genusspezifischen mAk finden sich vor allem bei mAk gegen das F-Protein (und M-Protein). Die zweite Gruppe von mAk reagiert
nur mit den Mitgliedern einer oder zweier Virusarten und wird daher als speziespezi- fisch bezeichnet. Die letzte Gruppe reagiert nur mit einigen Vertretern einer Art. Diese wird als stammspezifisch bezeichnet und eignet sich zur antigenen Unterscheidung von verschiedenen Virusisolaten einer Art. Das Epitop, an das diese mAk binden, wird also nur von einigen Isolaten der Spezies ausgebildet. Diese Gruppe findet sich vor allem unter den mAk, die gegen das H- und das P-Protein gerichtet sind (Sheshberadaran und Norrby, 1986; Blixenkrone-Møller et al., 1992b; Harder et al., 1991). In verschiedenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß einige mAk, die gegen einen Impfstamm (v. a. gegen den Onderstepoort-Stamm) gerichtet waren, mit vielen Feldvi- rusisolaten nicht reagierten (Orvell¨ et al., 1990;Alldingeret al., 1993). Bei kleineren Ver¨anderungen in einem Epitop findet man auch mAk, die mit diesem leicht ver¨anderten Epitop noch reagieren, dies allerdings schw¨acher als mit dem unver¨anderten. Von vier neutralisierenden Anti-H mAk gegen einen japanischen Impfstamm aus dem Jahre 1977 reagierte einer mit aktuellen CDV-Isolaten aus Japan wesentlich schw¨acher als mit dem Impfstamm und einem alten Feldisolat (Iwatsuki et al., 2000).
Beim Masernvirus konnten mit Hilfe von mAk auf dem H-Protein vier antigene Bereiche identifiziert werden, die aus mindestens sieben Epitopen bestehen (Shesh- beradaranet al., 1986; M¨akala et al., 1989). Von Huet al. (1993) wurden mit eini- gen dieser virusneutralisierenden mAk Escape-Varianten eines Virusisolates hergestellt und diese sequenziert. Dabei ließ sich erkennen, daß f¨ur die Resistenz gegen diese mAk meistens Punktmutationen verantwortlich waren. Dieselben Punktmutationen wurden auch bei einigen Feldvirusisolaten gefunden, die gegen die mAk resistent waren.
Hamburger et al. (1991) zeigten, daß ein mAk mit einem Epitop reagierte, das entsteht, wenn virulentes CDV ¨uber mehrere Passagen in Zellkultur adaptiert wird. Zwei Feldviren zeigten erst nach 8-13 Passagen in der Zellkultur eine Reaktion mit diesem mAk. Nach den Passagen hatten sie auch ihre Virulenz f¨ur den Hund verloren.
2.2.3.3. Verwendung von sequenz¨uberlappenden Peptiden zur Epitopsuche und -charakterisierung
2.2.3.3.1. Peptide als Epitope
Epitope sind die Bereiche eines Antigens, an die Antik¨orper oder T-Zellrezeptoren binden k¨onnen. Dabei kann man zwischen B- und T-Zell-Epitopen unterscheiden. T-Zellepitope sind Strukturen, an die Rezeptoren der T-Zellen binden. Diese Epitope werden aus kur- zen Peptidstrukturen gebildet, da T-Zell-Rezeptoren nur von antigenpr¨asentierenden Zellen aufbereitetes Antigen binden k¨onnen. B-Zell-Epitope dagegen sind die Struk- turen eines Antigens, an die Antik¨orper binden. Im weiteren soll hier nur noch auf B-Zellepitope eingegangen werden. Die Epitope auf einem Antigen sind h¨aufig nicht gleichm¨aßig ¨uber dieses verteilt, sondern h¨aufen sich an bestimmten Stellen. Diese Be- reiche, die mit Antik¨orpern unterschiedlicher Spezifit¨at Bindungen eingehen k¨onnen,
werden auch als antigene Dom¨anen oder dominante Epitop-Cluster bezeichnet.
Antik¨orper bestehen aus vier Peptiden. Dies sind je zwei identische schwere und leichte Ketten, die ¨uber Disulfidbr¨ucken miteinander verbunden sind. Die Ketten weisen zwei Regionen auf, je eine konstante Region am C-terminalen Ende und eine variable am N-terminalen Ende. Die variablen Regionen von je einer schweren und einer leich- ten Kette bilden den Rezeptor (Paratop) f¨ur das Epitop. Die Bindung des Antik¨orpers an das Antigen erfolgt durch nicht-kovalente Bindungen. Dabei ist die r¨aumliche Kom- plementarit¨at von Epitop und Paratop zueinander wichtig, d. h. das Epitop wird an seiner r¨aumlichen Struktur und nicht an seiner chemischen Zusammensetzung erkannt.
Dabei kommt es zu einem Wechselspiel zwischen anziehenden (elektrostatische Kr¨afte, Wasserstoffbr¨uckenbindungen, hydrophobe Bindungen, Van-der Waals-Kr¨afte) und ab- stoßenden Kr¨aften ( ¨Uberlappen von Elektronenwolken) zwischen Epitop und Paratop.
Uberwiegen die anziehenden Kr¨¨ afte, bindet der Antik¨orper an das Antigen. Die Bindung ist um so st¨arker, je gr¨oßer die r¨aumliche Ann¨aherung zwischen Paratop und Epitop ist.
Das Epitop wird aus den einzelnen Molek¨ulen des Antigens gebildet, die sich durch Wechselwirkungen miteinander zu einer bestimmten Struktur zusammenlagern. Bei Pro- teinen sind dies vor allem die Aminos¨auren. Bei der Zusammensetzung von Aminos¨auren zu Proteinen unterscheidet man zwischen Prim¨ar-, Sekund¨ar-, Terti¨ar- und Quart¨arstruk- tur. Die Prim¨arstruktur bezeichnet die Sequenz der Aminos¨auren. Die Sekund¨arstruktur wird durch die Atome der Peptidbindungen gestaltet und ist direkt durch die Prim¨arstruk- tur bedingt. Hierbei sind vor allem die Bindungswinkel der Peptidbindung und die Wasserstoffbr¨uckenbindungen zwischen C=O-Gruppen und H-N-Gruppen entscheidend.
Beg¨unstigt werden zwei Strukturen, die α-Helix und das β-Faltblatt. Folgt auf mehrere AS mit ¨ahnlichem Bindungswinkel eine mit abweichendem Bindungswinkel, wird hier die regelm¨aßige Anordnung der AS-Kette durchbrochen und es kann zu einer Schleifen- bildung kommen (loop). Eine direkte Umkehr der AS-Kette, so daß zwei Abschnitte der Kette parallel nebeneinander zu liegen kommen, wird als Haarnadel (hairpin) bezeichnet.
Dadurch, daß zwei Kettenabschnitte direkt nebeneinander liegen, wird die Ausbildung einer β-Faltblattstruktur erm¨oglicht. Zus¨atzlich wird die Anordnung der Kette durch Wechselwirkungen zwischen den Aminos¨aurenseitenketten bestimmt. Die dadurch ent- stehende Struktur wird als Terti¨arstruktur bezeichnet. Die wichtigsten Seitenketten sind hier die SH-Gruppen des Cysteins, da sich zwischen zwei Cystein-SH-Gruppen durch Dehydrierung eine Disulfidbindung aufbauen kann. Ist mehr als eine AS-Kette an die- sen Wechselwirkungen beteiligt spricht man von Quart¨arstruktur. Die
”loops“ und die
”hairpins“ sind meistens an der Oberfl¨ache des Proteins lokalisiert, w¨ahrend dieα-Helix- Struktur und die β-Faltblattstruktur meist im Inneren des Proteins liegen.
Man muß unterscheiden zwischen Epitopen, die nur von der Prim¨arstruktur des Pro- teins, also der AS-Sequenz abh¨angen, und den Epitopen, die sich aus mehreren Ketten, die r¨aumlich benachbart liegen, zusammensetzen und damit von der Sekund¨ar-, Terti¨ar- oder Quart¨arstruktur bestimmt sind. Erstere werden als lineare oder kontinuierliche Epi-
tope, letztere als diskontinuierlich bezeichnet. Antik¨orper, die im Rahmen einer nat¨urli- chen Infektion gebildet wurden, erkennen Epitope auf dem nativen Antigen. Hier liegt das Antigen in seiner nat¨urlichen Struktur (Sekund¨ar-, Terti¨ar, Quart¨ar-Struktur) vor.
Befindet sich das Antigen in denaturiertem Zustand (z. B. inaktivierte Impfstoffe, Anti- genpr¨aparationen f¨ur ELISA, Gelelektrophorese) reagieren viele Antik¨orper nicht mehr mit diesem, da sich durch die Denaturierung die Sekund¨ar-, Terti¨ar- und Quart¨arstruk- tur des Molek¨uls ver¨andert. Dies kann bis zur vollst¨andigen Entfaltung der AS-Kette f¨uhren. Dadurch ver¨andert sich die r¨aumliche Struktur und oft k¨onnen Antik¨orper nicht mehr binden.
Die meisten Antik¨orper reagieren mit diskontinuierlichen Epitopen. Kurze Peptide k¨onnen aber nur kontinuierliche Epitope darstellen. Es wird vermutet, daß es vollst¨andig lineare B-Zellepitope nicht gibt. Darauf deuten r¨ontgen-kristallographische Untersuchun- gen hin, die eine Bindungsfl¨ache zwischen Epitop und Paratop von ca. 800 ˚A2 aufzeigen (15-22 AS) (Van RegenmortelundPellequer, 1994). Eine solche Fl¨ache kann nicht von den Seitenketten nur einer AS-Kette gebildet werden. Es wurde vermutet, daß alle bisher gefundenen kontinuierlichen Epitope entfaltete Bereiche eines Proteins und einen Teil eines diskontinuierlichen Epitops darstellen (Laver et al., 1990). Diese entfalteten Bereiche k¨onnen z. B. durch eine teilweise Denaturierung des Proteins bei der Herstellung eines Impfstoffes entstehen.
Allerdings k¨onnen Antik¨orper, die gegen das gesamte, native Virusantigen im Rah- men einer nat¨urlichen Infektion gebildet wurden, mit Peptiden aus der AS-Sequenz reagieren. Auch kann durch die Immunisierung mit Peptiden ein protektiver Infekti- onsschutz hervorgerufen werden. Zudem k¨onnen Antipeptid-mAk virusneutralisierende Eigenschaften besitzen. Dies zeigt, daß die Peptide zumindest einen Teil der im na- tiven Antigen vorkommenden Epitope darstellen k¨onnen. Auch f¨ur das MV wurden Antipeptidantik¨orper gefunden, die virusneutralisierende Eigenschaften besitzen und M¨ause gegen eine Masernerkrankung sch¨utzen k¨onnen (Fournier et al., 1997; Obeid et al., 1995). Diese Antipeptidantik¨orper wurden gegen Peptide aus der Sequenz des H- oder F-Proteins gebildet.
Die meisten gegen das native Virusantigen gebildeten AK reagieren nicht oder nur schwach mit sequenzspezifischen Peptiden. Dies liegt m¨oglicherweise daran, daß diese Peptide nur einen Teil eines diskontinuierlichen Epitops darstellen, an den m¨oglicherweise nur ein Teil der 6 CDR des Antik¨orpers bindet. Ein weiterer Grund f¨ur die schwache Bindung von AK an Peptide k¨onnte sein, daß diese eine andere Konformation einnehmen als dieselbe AS-Struktur im gesamten Antigen. Da die AS-Kette eines kurzen Peptids in der Regel keine Terti¨arstruktur ausbilden kann, ist sie im Prinzip an jeder Peptidbindung frei drehbar. Dadurch kann das Molek¨ul theoretisch in vielen verschiedenen sterischen Formen vorliegen, von denen nur ein kleiner Teil die zum AK passende Form einnimmt.
Eine feste Sekund¨arstruktur k¨onnen allerdings schon Peptide ab einer L¨ange von 7-8 AS ausbilden. Diese Sekund¨arstruktur ist zum einen abh¨angig von der AS-Sequenz des
Peptids. Andererseits wird sie auch davon beeinflußt, ob sich das Peptid frei in L¨osung befindet oder an eine Festphase adsorbiert ist bzw. an ein Tr¨agerprotein gekoppelt ist.
Eine weitere M¨oglichkeit f¨ur die Bindung von Antik¨orpern an Peptide besteht darin, daß durch das Peptid die von dem Antik¨orper im nativen Protein gebundene Struktur imitiert wird, ohne daß die AS-Sequenz des Peptids der AS-Sequenz des Proteins ¨ahnlich sein muß. Dazu ist es nur n¨otig, daß die AS-Seitenketten eine r¨aumliche Struktur an- nehmen, die der im Epitop ¨ahnelt. Diese Peptide werden nach Geysenet al. (1986) als Mimotope bezeichnet. Diese Mimotope k¨onnen auch die Bildung von Antik¨orpern be- wirken, die mit dem nativen Protein kreuzreagieren (Steward et al., 1995). Allerdings kann aus der Bindung von Antik¨orpern an ein Mimotop nicht unbedingt geschlossen werden, daß gegen dieses Peptid auch Antik¨orper erzeugt werden w¨urden, die mit dem nativen Protein kreuzreagieren (El Kasmiet al., 2000). Die Antigenit¨at eines Mimotops sagt also nicht unbedingt etwas ¨uber seine Immunogenit¨at aus.
Bisher ist keine lineare AS-Folge gefunden worden, die nachweisbar ein vollst¨andiges Epitop darstellt, das von allen 6 CDR eines AK gebunden wird. M¨oglicherweise stellen daher alle Peptide nur Teile eines diskontinuierlichen Epitops dar. Daher wurde von Martens(1994) vorgschlagen diese als lineare Determinanten zu bezeichnen und sie so gegen vollst¨andige Epitope abzugrenzen.
2.2.3.3.2. Determinantensuche und -charakterisierung mit sequenz¨uberlap- penden Peptiden
Zur Determinantensuche mit sequenz¨uberlappenden Peptiden werden AK gegen das na- tive Antigen auf ihre Bindungsf¨ahigkeit an Peptide ¨uberpr¨uft. Dies kann mit mAk oder mit polyklonalen Antik¨orpern gegen das Antigen durchgef¨uhrt werden. Als erster stellten Geysen et al. (1984) einen gr¨oßeren Bereich eines Proteinantigens in Form von ¨uber- lappenden synthetischen Peptiden dar. Sie konnten damit lineare Determinanten auf dem V1-Protein des Maul-und-Klauenseuche-Virus (MKS) identifizieren. Zur Darstel- lung der Peptide wurde die multiple Festphasensynthese nach dem Pepscan-Verfahren verwendet. Heute stehen weitere Methoden zur multiplen Festphasensynthese von Pep- tiden zur Verf¨ugung (Frank, 1992;Houghton, 1985; Fodoret al., 1991).
Diese Art der Determinantensuche wurde z. B. auch f¨ur die Masernvirusproteine H und F durchgef¨uhrt. Die Sequenz des H-Proteins wurde in Form von 15er-Peptiden, die um 10 AS ¨uberlappten dargestellt. Die Reaktionen wurden mit Seren, die Neutralisati- onstiter gegen das MV von 800 bis 1280 aufwiesen, durchgef¨uhrt. Ca. 20% der Peptide zeigten Reaktionen mit den Seren. Die st¨arkste Reaktion wurde in der N-terminalen Transmembranregion (AS 35-58) gefunden. Mehrere andere Bereiche, vor allem im Be- reich der AS 200-325, zeigten schwache Reaktionen mit den AK. Die Bindungsbereiche wiesen ¨Ubereinstimmungen mit ca. 50% der mit Computer-gest¨utzten Modellen vorher- gesagten B-Zellepitope und zu ca. 75% der T-Zellepitopen auf (Muller et al., 1993a).
