3. Material und Methoden 23
5.3. Charakterisierung der CDV-Isolate mit monoklonalen Antik¨ orpern
Es wurde im Verlauf dieser Arbeit eine Hybridzellinie (8F2) neu etabliert. Zus¨atzlich wur-den zehn weitere mAk zur Charakterisierung der Virusisolate verwendet. Die Charakte-risierung der Virusisolate mit den mAk erfolgte im Immunfluoreszenztest, im Western-blot und im Enzymimmunoassay mit sequenz¨uberlappenden synthetischen Peptiden.
Die verwendeten mAk waren zuvor in Bezug auf ihre Proteinspezifit¨at charakterisiert worden. Dies geschah sowohl durch ihrer Reaktion mit rekombinanten Virusproteinen als auch im Enzymimmunoassay mit sequenz¨uberlappenden Peptiden. Dabei wurden die mAk CDCT-1, CDCT-2, CDRCT-2, CDRCT-4, CDRCT-5, CDRCT-8, CDRCT-10, CDRCT-11, CDCT-14, CDCT-16 durch ihre Bindung an rekombinantes N-Protein als N-Protein spezifisch charakterisiert (von Messling, 1998). Der mAk CDRCT-1 wurde auf diese Weise als H-Protein spezifisch charakterisiert. Der mAk CD/Px4 war sowohl im Western-Blot als auch im Enzymimmunoassay mit sequenz¨uberlappenden Peptiden als P-Protein spezifisch charakterisiert worden (Martens et al., 1995).
In den f¨ur diese Arbeit durchgef¨uhrten Western-Blots reagierten alle der als N-Protein-spezifisch und der als P-N-Protein-spezifisch charakterisierte mAk mit einem ¨ ahn-lichen Bandenmuster. Die Ursache daf¨ur k¨onnte sein, daß alle diese mAk an einen Kom-plex aus N- und P-Protein binden. Sowohl beim Masern- und als auch beim Sendaivirus wurde gezeigt, daß das P-Protein mit seinen 100 carboxyterminal gelegenen Aminos¨ aur-en an das N-Protein bindet. Zus¨atzlich ist ein Bereich am N-terminalen Ende des P-Proteins notwendig f¨ur die Bindung an das N-Protein (Curran et al., 1995; Harty und Palese, 1995). Im N-Protein des Masernvirus sind zwei Proteinabschnitte f¨ur die Bindung an das P-Protein n¨otig. Dies sind die AS 267-367 und die 120 C-terminalen AS des Proteins (Liston et al., 1997). Diese Bindung zwischen P- und N-Protein l¨ost sich beim Sendai-Virus auch nach proteolytischem Verdau nicht vollst¨andig (Chinchar und Portner, 1981). So ist anzunehmen, daß unter den Bedingungen der Antigen-pr¨aparation f¨ur die Westernblots diese Verbindung zumindest z. T. erhalten blieben.
Der Antik¨orper CD/Px4 bindet dabei unter anderem an eine AS-Sequenz am ¨ außer-sten N-terminalen Ende des Proteins (AS16-28). F¨ur eine Bindung dieses mAk w¨are es daher ausreichend, wenn nur ein sehr kleiner N-terminaler Teil des P-Proteins an das N-Protein gebunden bliebe. In diesem Fall w¨urde der mAk ein Bandenmuster anf¨arben, das dem von N-sepzifischen mAk gleicht. Die dargestellten Banden mit unterschiedlichen Molekulargewichten k¨onnen dabei verschiedene Komplexe aus N- und P-Protein sowie
m¨oglicherweise auch reine N- bzw. P-Proteinbanden oder Abbauprodukte davon darstel-len. Es ist bekannt, daß ein Problem beim Westernblot die geringe Stabilit¨at der Proteine in der Antigenpr¨aparation ist. Vor allem das N- und das P-Protein sind daf¨ur bekannt, daß sie leicht proteolytisch abgebaut werden (Shapshaket al., 1982;Rima, 1983). Es ist daher fast unm¨oglich, in einer Antigenpr¨aparation diese beiden Proteine in unzerst¨orter Form darzustellen. Bei den f¨ur diese Arbeit durchgef¨uhrten Western-Blots ließen sich bei allen Antigenpr¨aparationen immer mehrere Proteinbanden darstellen, wenn die Sub-stratreaktion nicht vorher abgebrochen wurde. Durch die Verwendung von je zwei Anti-genpr¨aparationen pro Virusisolat pro Western-Blot konnte aber gezeigt werden, daß es zwar zu einem proteolytischen Abbau der Proteine kam, dieser aber gut reproduzierbar war. Bei jeder Antigenpr¨aparation aus dem gleichen Isolat waren nach der Auftrennung in der Elektrophorese im Western-Blot die gleichen Bandenmuster zu erkennen.
Die Proteinspezifit¨at des Antik¨orpers 8F2, die nicht im Bakulovirusexpressionssy-stem auf seine Proteinspezifit¨at ¨uberpr¨uft worden war, ließ sich nicht genau bestimmen, da er nur im Western-Blot untersucht wurde. Im Western-Blot reagierte er mit den glei-chen Banden, mit denen die anderen N-Protein-spezifisglei-chen, aber auch der P-Protein-spezifische mAk reagierten. Er ist daher entweder gegen das P-Protein oder gegen das N-Protein gerichtet.
Zur Charakterisierung der zur Verf¨ugung stehenden CDV-Isolate wurde die Reak-tion dieser 12 mAk mit diesen Virusisolaten sowohl im Western-Blot als auch im Im-munfluoreszenztest untersucht. Des weiteren wurden die mAk zur Charakterisierung der Virusisolate im Enzymimmunoassay mit sequenz¨uberlappenden Peptiden verwendet.
Durch diese Versuche ließen sich mit den verwendeten mAks sowohl antigene Un-terschiede als auch UnUn-terschiede im Molekulargewicht einzelner Virusproteine zwischen den Virusisolaten nachweisen.
Nur zwei der mAks (CD/Px4 und CDRCT 4) waren in Western-Blots mit Antigen-pr¨aparationen aus verschiedenen CDV-Isolaten verwendet worden. Es wurden hierbei von jedem Virusisolat je zwei Antigenpr¨aparationen von verschiedenen Virusvermeh-rungen verwendet, um Unterschiede auszuschließen, die durch unterschiedliche Anti-genpr¨aparationen hervorgerufen wurden. Es zeigten sich bei diesen Western-Blots keine Unterschiede in der Bindung der zwei mAk an die verwendeten Virusisolate. Es ließen sich aber Unterschiede in der Wanderungsgeschwindigkeit der von diesen beiden mAks dargestellten Proteinbanden erkennen. Bei beiden CDV-Impfvirusst¨ammen (Rockborn, Onderstepoort) war eine Bande bei einem Molekulargewicht Mr = 75.000 zu erken-nen, die bei den Feldvirusisolaten nicht auftrat. Nur einer der Feldvirusisolate, das Isolat B1/97, zeigte ebenfalls diese Bande (siehe Abbildung 4.2). Die Feldvirusisolate wiesen dagegen eine Bande bei Mr = 60.000 auf, die bei den Impfvirusst¨ammen nur sehr schwach ausgepr¨agt war. Alle Virusisolate wiesen dazu noch Proteinbanden im Be-reich von Mr = 110.000 bis Mr = 120.000 auf. Diese Proteinbanden mit dem hohen Molekulargewicht k¨onnten einen Komplex aus N- und P-Protein darstellen, w¨ahrend
die Banden mit den geringeren Molekulargewichten Abbauprodukte dieses Komplexes darstellen. In der Gelelektrophorese liegen die ¨ublicherweise gefundenen Molekularge-wichte f¨ur das N-Protein bei Mr = 60.000 und f¨ur das P-Protein bei Mr = 66.000 (Hall et al., 1980; Rima, 1983). Eine m¨ogliche Erkl¨arung f¨ur die Unterschiede in der Wanderungsgeschwindigkeit der Banden bei den Impf- und Feldvirusisolaten k¨onnte darin liegen, daß dieser Komplex w¨ahrend der Antigenpr¨aparation bei den verschie-denen Virusisolaten in unterschiedlich große Bruchst¨ucke gespalten wird. Desweiteren kommt bei den beiden stark phosphorylierten Proteinen N und P (Lamb und Chop-pin, 1977; Hall et al., 1980; Hsu et al., 1982) auch eine unterschiedliche Auspr¨agung dieser Phosphorylierung zwischen Impfvirusst¨ammen und Feldvirusisolaten in Frage. Un-terschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten zwischen den Banden des N-Proteins von Impfvirusst¨ammen und Feldvirusisolaten waren auch schon bei anderen Feldisolaten ge-funden worden (Yoshida et al., 1998;Hirayama et al., 1986;Shapshaket al., 1982).
Auch bei diesen Versuchen wies das N-Protein von Feldisolaten ein geringeres Moleku-largewicht auf als das des Impfvirusstammes Onderstepoort.
Das aus einem Tier mit Staupeverdacht isolierte Virusisolat B1/97 zeigte bei diesen Versuchen ein Verhalten, welches denen der beiden verwendeten Impfst¨amme Onder-stepoort und Rockborn glich. Der Tierarzt, der diese Blutprobe einsandte, sagte auf Nachfrage aus, daß er dieses Tier intraven¨os notgeimpft h¨atte. Ob dies vor oder nach Entnahme der Blutprobe zur Virusisolierung geschehen war, ließ sich nicht mehr genau kl¨aren. Es besteht also in diesem Fall die M¨oglichkeit, daß es sich bei dem hier iso-lierten Virus um das kurz zuvor verabreichte Impfvirus handelt. Dies k¨onnte nur eine Sequenzierung des Virusisolates kl¨aren.
Im Immunfluoreszenztest waren Reaktionsunterschiede von vier der untersuchten mAks mit den CDV-Isolaten zu erkennen. Die mAks CDRCT 8, CDRCT10, CDRCT11, die gegen das N-Protein gerichtet sind, zeigten mit einigen Virusisolaten keine Reakti-on. Ebenso reagierte der mAk 8F2 nicht mit allen Virusisolaten. Vor allem die beiden CDV-Isolate 4513/Han95 und 404/Han89, deren H-Protein genetisch eng mit dem des Virusisolates 2544/Han95 verwandt ist (Haas et al., 1997), wiesen Unterschiede in der Reaktion mit den mAks auf. Beide zeigten mit zwei der verwendeten mAks keine Reakti-on. Dabei reagierten sie beide nicht mit dem mAk CDRCT 11. Das Epitop, an das dieser mAk bindet, war demnach in beiden Virusisolaten nicht vorhanden oder zumindest so ver¨andert, daß eine Bindung dieses mAks nicht mehr m¨oglich war. Zus¨atzlich zeigten beide Isolate jeweils mit einem weiteren mAk keine Reaktion. F¨ur den Verlust der Bin-dungsf¨ahigkeit eines mAks an einen Virusisolat reicht h¨aufig schon eine Punktmutation aus. Dies wurde bei der Sequenzierung von Escape-Mutanten gezeigt. Diese unterschie-den sich z. T. nur in einer Aminos¨aure von dem Ausgangsisolat, reagierten aber nicht mehr mit dem zur Erzeugung verwendeten Antik¨orper (Huet al., 1993). Proteinsequen-zen des N-Proteins liegen nur f¨ur das Virusisolat 2544/Han95 und nicht f¨ur die anderen beiden Virusisolate vor. Es k¨onnen daher keine Aussagen ¨uber die Unterschiede
zwi-schen diesen beiden Virusisolaten und 2544/Han95 auf Basis der Aminos¨aurensequenz gemacht werden. Unterschiede in der Reaktion von Anti-N-Protein mAks mit verschie-denen CDV-Isolaten konnten auchBlixenkrone-Mølleret al. (1992b) zeigen. Auch dort konnten keine antigenen Charakteristika gefunden werden, die eine Unterscheidung in Impfvirusst¨amme und Feldvirusisolate erm¨oglicht h¨atte. Allerdings verlieren CDV-Isolate in Zellkultur schnell ihre Virulenz (Appel, 1987). Diese Ver¨anderungen, die zum Verlust der Virulenz f¨uhren, k¨onnen auch die Reaktion von Anti-N-Protein monoklo-nalen Antik¨orpern mit diesen Virusisolaten ver¨andern (Hamburger et al., 1991). Alle der hier verwendeten CDV-Isolate waren an Zellkultur adaptiert (3-6 Passagen in Vero-zellen) und k¨onnen w¨ahrend dieser Passagen bestimmte Charakteristika von virulenten Feldvirusisolaten verloren haben.
Es ließ sich auf Grund der Reaktionen der mAk keine Unterscheidung der Virusisolate in Impfvirusst¨amme und Feldvirusisolate treffen. Sowohl der Impfstamm Rockborn als auch der Impfstamm Onderstepoort, der genetisch am weitesten von dem f¨ur elf der zw¨olf mAk homologen Virusisolat 2544/Han95 entfernt ist, reagierten mit neun bzw.
zehn der mAk eindeutig. Die Reaktion mit den anderen ein bzw. zwei mAk war bei den Versuchen nicht genau ablesbar und wurde daher als fraglich gekennzeichnet. Dabei zeigten die hier in ihrer Reaktion als fraglich bezeichneten mAk auch noch mit je einem oder zwei Feldvirusisolaten keine Reaktion.