Determinantensuche und -charakterisierung mit

Zur Determinantensuche mit sequenz¨uberlappenden Peptiden werden AK gegen das na-tive Antigen auf ihre Bindungsf¨ahigkeit an Peptide ¨uberpr¨uft. Dies kann mit mAk oder mit polyklonalen Antik¨orpern gegen das Antigen durchgef¨uhrt werden. Als erster stellten Geysen et al. (1984) einen gr¨oßeren Bereich eines Proteinantigens in Form von ¨ uber-lappenden synthetischen Peptiden dar. Sie konnten damit lineare Determinanten auf dem V1-Protein des Maul-und-Klauenseuche-Virus (MKS) identifizieren. Zur Darstel-lung der Peptide wurde die multiple Festphasensynthese nach dem Pepscan-Verfahren verwendet. Heute stehen weitere Methoden zur multiplen Festphasensynthese von Pep-tiden zur Verf¨ugung (Frank, 1992;Houghton, 1985; Fodoret al., 1991).

Diese Art der Determinantensuche wurde z. B. auch f¨ur die Masernvirusproteine H und F durchgef¨uhrt. Die Sequenz des H-Proteins wurde in Form von 15er-Peptiden, die um 10 AS ¨uberlappten dargestellt. Die Reaktionen wurden mit Seren, die Neutralisati-onstiter gegen das MV von 800 bis 1280 aufwiesen, durchgef¨uhrt. Ca. 20% der Peptide zeigten Reaktionen mit den Seren. Die st¨arkste Reaktion wurde in der N-terminalen Transmembranregion (AS 35-58) gefunden. Mehrere andere Bereiche, vor allem im Be-reich der AS 200-325, zeigten schwache Reaktionen mit den AK. Die BindungsbeBe-reiche wiesen ¨Ubereinstimmungen mit ca. 50% der mit Computer-gest¨utzten Modellen vorher-gesagten B-Zellepitope und zu ca. 75% der T-Zellepitopen auf (Muller et al., 1993a).

Wiesm¨uller et al. (1992) stellten die gesamte Sequenz des F-Proteins in Form von 15er-Peptiden mit einer ¨Uberlappung von 10 AS dar. Die Reaktionen wurden mit nicht-selektierten Seren von gesunden Spendern mit Antik¨orpertitern gegen das Masernvirus zwischen 4 und 128 durchgef¨uhrt. Die meisten dieser Seren reagierten mit weniger als 30% der Peptide. Es konnten keine klar begrenzten Regionen von Bindungsstellen aus-gemacht werden. Es ließen sich aber 8-10 Peptidgruppen ermitteln, die verst¨arkte Bin-dungsaffinit¨at zu Antik¨orpern zeigten. Bei der Verwendung von gereinigtem IgG, von gesunden Spendern mit Masernantik¨orpertitern, zeigte sich ebenfalls eine Reaktion mit ca. 20% der Peptide. Durch die Verwendung von gereinigtem IgG konnten die Bindungs-stellen schmaler gehalten werden als bei der Verwendung von Serum und die Variationen zwischen einzelnen Individuen fiel geringer aus. Die Reaktionsstellen verteilten sich auf 6-7 Regionen, die potentielle lineare Determinanten darstellen. Diese Regionen ¨ uberlapp-ten zu 66-85% mit durch computer-gest¨utzte Modelle vorhergesagten T-Zell-Epitopen (Muller et al., 1993b). Abatani et al. (1997) konnten dagegen bei der Verwendung von Seren akut an Masern erkrankter afrikanischer Kinder Reaktionen nur mit zwei der 41 synthetisierten 15er Peptide feststellen. Diese reagierten stark mit den Postinfekti-onsseren, aber nicht mit Praevakzinationsseren. Auch diese beiden Peptide lagen in der N¨ahe von vorhergesagten T-Zellepitopen, aber sie ¨uberlappten nicht mit den von Mul-ler et al. (1993b) gefundenen Bindungsstellen. Martens (1994) ließ drei Hundeseren mit Peptiden der Sequenz des P-Proteins reagieren, die als 13-Peptide mit einer ¨ Uber-lappung von 10 AS dargestellt waren. Die Seren reagierten mit ca. 15% der Peptide. Bei der Verwendung von mAk (4 gegen PDV, 10 gegen CDV) reagierten 8 der verwendeten mAk nicht mit den Peptiden aus der P-Proteinsequenz von PDV. F¨unf mAk reagierten mit je vier Peptiden im C-terminalen Drittel des Proteins und ein mAk reagierte mit drei Peptiden im Aminoterminus des Proteins.

3.1. Zellkulturen

Material:

• Verozellen: Zellinie aus Nierenzellen der Gr¨unen Meerkatze (Ceropithecus aethiops) (ATCC-Nr.: CCL-81)

• P3X63-Ag.8.653: Murine Myelomzellen ohne Immunglobulinproduktion

• Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM)¹

• RPMI 1640-Medium²

• Versen-Trypsin (0,125%): 1,25 g Trypsin³, 3,3 mM Tritriplex⁴ (1,25 g), M NaCl⁵ ( 8g), 2,7 mM KCl⁶ (0,2 g) ?M KH₂PO₄⁷ (2 g), 0,55 mM Na₂HPO₄ x 12 H₂O⁸ (0,2 g), 0,4 mM MgSO₄ x 7 H₂O⁹ (0,1 g), 0,9 mM CaCl₂ x 2 H₂O¹⁰, (0,132 g), 0,5 g Strep-tomycin¹¹, 10⁶U Penicillin G¹² ad 1000 ml Aqua bidest, pH mit 1 N NaOH auf pH 7,0 einstellen

• f¨otales K¨alberserum (FKS)¹³

• l-Glutamin¹⁴

• Dimethylsulfoxid (DMSO)¹⁵

• Zellkulturflaschen (25 cm², 80 cm², 175 cm²)¹⁶

1Seromed, Biochrom KG Berlin, Art.-Nr.: T043-50

2Seromed, Biochrom KG, Berlin, Art.-Nr.: FG 1285

3Difco Laboratories, Detroit USA, Art.-Nr.: 0152-15-9

4Merck, Darmstadt, Art.-Nr.: 1.08418.0100

5Merck, Darmstadt, Art.-Nr.:1.06404.5000

6Merck, Darmstadt, Art.-Nr.: 4936.0500

7Merck, Darmstadt, Art.-Nr.: 4873.0250

8Merck, Darmstadt, Art.-Nr.: 915 A 366979

9Merck, Darmstadt, Art.-Nr.: 5886.0500

10Merck, Darmstadt, Art.-Nr. 2382

11Seromed, Biochrom KG Berlin, Art.-Nr.: A331-27

12Seromed, Biochrom KG Berlin, Art.-Nr.: A321-42

13Seromed, Biochrom KG Berlin, Art.-Nr.: S0115

14Seromed, Biochrom KG, Berlin, Art.-Nr.: K0283

15Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Art.-Nr.:

16Nunc, Roskilde D¨anemark, Art.-Nr.: 13371, 153732, 156502

3.1.1. Verozellen

Verozellen wurden zur Isolierung und Vermehrung von Hundestaupevirus verwendet.

R¨ucklagen dieser Zellinie lagerten bei -80C.

Zur Anzucht wurde eine Portion der kryokonservierten Zellen im Wasserbad bei 37C aufgetaut, in 30ml DMEM ¨uberf¨uhrt und bei 130xg pelletiert. Der DMSO-haltige Uberstand wurde verworfen und das Pellet in 5ml DMEM mit 5% FKS resuspendiert¨ und in eine 25 cm² Zellkulturflasche ¨uberf¨uhrt. Diese wurde im Brutschrank bei 37C und 5% CO₂ bebr¨utet.

Nach dem Enstehen eines konfluenten einschichtigen Zellrasens erfolgte die Passa-gierung der Zellen. Der Zellrasen wurde mit Versen-Trypsin gesp¨ult. Das ¨ubersch¨ussige Trypsin wurde zusammen mit eventuell vorhandenen Zelltr¨ummern entfernt. Anschlie-ßend wurden die Zellen f¨ur 10-15 min bei 37C inkubiert bis sich die Zellen von ihrer Unterlage gel¨ost hatten. Mit 3-4 ml DMEM wurden die Zellen nun resuspendiert, im Verh¨altnis 1:4 bis 1:6 passagiert und in entsprechende Kulturgef¨aße einges¨at.

F¨ur die Tiefgefrierkonservierung der Zellen wurden eine Zellkonzentration von 10⁶ Zel-len/ml eingestellt. Der Suspension in DMEM wurden 20% FKS und 10% DMSO zuge-setzt. Die anschließende Lagerung erfolgte in 1,8 ml Portionen bei -80C.

3.1.2. Myelom- und Hybridomzellen

F¨ur die Kultivierung der Suspensionszelllinien (P3X63-Ag.8.653 und daraus gewonne-ne Hybridomzellen) wurde als Kulturmedium RPMI 1640 mit 10 %FKS und 2 mM Glutamin-Zusatz verwendet. Die kryokonservierten Zellen wurden, wie in 3.1.1 beschrie-ben, aufgetaut. Die Vermehrung erfolgte in Zellkulturflaschen mit einer Fl¨ache von 25 cm², 50 cm² und 100 cm². Bei einer Zelldichte von ca. 10⁵ Zellen/ml Zellkulturme-dium wurden die Zellen bei 130 xg f¨ur 8 min zentrifugiert, das Zellpellet resuspendiert und im Verh¨altnis 1:5 passagiert.

F¨ur die Tiefgefrierkonservierung der Zellen wurde eine Zellkonzentration von 10⁶ Zel-len/ml eingestellt. Der Suspension in RPMI wurden 20% FKS und 10% DMSO zugesetzt.

Die anschließende Lagerung erfolgte in 1,8 ml Portionen bei -80C.

3.2. Viren

Es standen verschiedene CDV-Isolate zur Verf¨ugung. Dies waren zum einen die beiden Impfst¨amme Rockborn¹⁷ und Onderstepoort¹⁸. Die St¨amme 2544/Han95 404/Han94, 4513/Han95, 1493/Han89 und 5804/Han89 waren aus an Staupe erkrankten Hunden

17Behringwerke Marburg

18Vemie, Veterin¨archemie GmbH

isoliert worden (Haas et al., 1997;Harder et al., 1991). Weitere Virusisolate wurden im Verlauf dieser Arbeit aus an Staupe erkrankten Hunden gewonnen.

3.2.1. Vermehrung in Zellkultur

Die zur Vermehrung verwendeten Verozellen wuchsen in Zellkulturflaschen zu einem zu 80% konfluenten Zellrasen aus. Das Zellkulturmedium wurde abgenommen und der Zell-rasen mit 1 ml einer Virussuspension infiziert, die zuvor im Wasserbad aufgetaut worden war. Anschließend erfolgte eine Inkubation von einer Stunde bei 37C zur Adsorption des Virus an den Zellrasen. Nach der Inkubation wurde die Virussupension abgesogen und frisches Zellkulturmedium mit 3% FKS zugegeben. Die weitere Bebr¨utung erfolgte bei 37C mit einem kompletten Mediumwechsel am zweiten Tag. Nach Ausbreitung einer virusbedingten Zellzerst¨orung von 60-70% am 3. oder 4. Tag nach der Infizierung erfolgte ein Gefrier-Tau-Zyklus der gesamten Zellkultur bei -80C/20C. Dabei wurde die Flasche beim Auftauen kr¨aftig gesch¨uttelt, um die Zellen weitestgehend von der Flaschenwand zu l¨osen. Die Zelltr¨ummer wurden anschließend bei 700 xg f¨ur 10 min abzentrifugiert.

Die Virussuspension wurde dann in 1 ml Portionen aliquotiert und bei -80C gelagert.

3.2.2. Quantitiative Bestimmung der Infektiosit¨at Material

• Materialien f¨ur die Zellkultur siehe 3.1

• Mikrotiterplatten f¨ur Zellkultur (96 Kavit¨aten)¹⁹

• PBS (phosphate buffered saline): 136 mM NaCl (8 g), 2,68 mM KCl (0,2 g), 7,0 mM Na₂HPO₄ x 2 H₂O²⁰ (1,43 g), 150M KH₂PO₄ (0,2 g) ad 1000 ml H₂0 demin., pH 7,0 mit HCl einstellen

• Ziege-anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugat (GAM-PO)²¹

• Natriumacetat-Puffer: 0,05 M (4,1 g) Natriumacetat x 3 H₂O²² ad 1000 ml H₂O demin., pH 5,0 mit 1 N Essigs¨aure²³ einstellen

• AEC-F¨arbel¨osung: 4 mg 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC)²⁴, 0,6 ml Dimethylforma-mid (DMF)²⁵ ad 10 ml Natriumacetat-Puffer

• 30% H₂O₂²⁶

19Nunc, Roskilde D¨anemark, Art.-Nr.: 13982

20Merck, Darmstadt, Art.-Nr.: 931 K12717780

21Dianova-Immunotech Hamburg, Art.-Nr.: 304-055-003

22Roth GmbH Karlsruhe, Art.-Nr.: 6773

23Roth GmbH Karlsruhe, Art.-Nr.: 3738.2

24Sigma-Aldrich Deisenhofen, Art.-Nr.: A5754

25Roth GmbH Karlsruhe, Art.-Nr.: 6251.2

26Merck Darmstadt, Art.-Nr.: 1.08597

• PBS-Tween (0,05% v/v Tween 20²⁷)

Als Verfahren zur Bestimmung der mittleren kulturinfekti¨osen Dosis (KID₅₀) einer Virussuspension wurde die Endpunktverd¨unnungsmethode im Mikrotitersystem mit Hil-fe von Zellkulturen verwendet.

Die Virussuspension wurde in log₁₀-Stufen in Zellkulturmedium (DMEM) verd¨unnt und 100l jeder Verd¨unnungsstufe in je vier Kavit¨aten einer Mikrotiterplatte gegeben.

50l einer Zellsuspension mit 300.000 Verozellen/ml (d.h. 15.000 Zellen pro Vertiefung) wurden hinzugef¨ugt. Es folgte nun eine Inkubation im Brutschrank (37C, 5% CO₂) f¨ur drei Tage. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Zellen fixiert. Dazu wurde das Medium dekantiert und der Zellrasen mit 30%igem PBS gewaschen. Anschließend folgte die Hitzefixierung f¨ur 4 Stunden bei 80C.

Zur Darstellung von virusinfizierten Zellen wurde der indirekte Peroxidase-linked-Assay (iPLA) verwendet. Hierf¨ur wurden in jede Kavit¨at der Platte 100l des CDV-spezifischen monoklonalen Antik¨orpers CD/Px4 als Zellkultur¨uberstand (ZK ¨U) in einer Verd¨unnung von 1:50 in PBS-Tween zugegeben und f¨ur zwei Stunden bei Raumtempe-ratur inkubiert. Danach wurde die mAk-L¨osung dekantiert und die Kavit¨aten dreimal mit je 200l PBS-Tween gewaschen. Anschließend wurden 100l des Enzymkonjugats GAM-PO in einer Verd¨unnung von 1:2000 in PBS-Tween in jede Kavit¨at pipettiert und f¨ur eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Dekantieren des Enzymkon-jugates und dreimaligem Waschen mit PBS-Tween erfolgte die Zugabe von je 100l der AEC-F¨arbel¨osung unter Zusatz von 60l H₂O₂/10ml als Substrat der Peroxidase. Die F¨arbel¨osung wurde nach einer Inkubationszeit von 30 min dekantiert und die Platten mit Leitungswasser gewaschen.

Die Auswertung erfolgte unter dem Lichtmikroskop bei einer 50- bis 100-fachen Ver-gr¨oßerung. Spezifisch positive Reaktionen waren als Herde braun-rot gef¨arbter Zellen zu erkennen. Als infiziert galten die Vertiefungen, in denen mindestens eine Zelle spezifisch angef¨arbt war. Die mittlere kulturinfekti¨ose Dosis wurde nach der Formel von Spaer-mann und Kaerber (Kaerber, 1931) berechnet. Der ermittelte Virustiter wurde auf das Volumen von 1,0 ml umgerechnet.

27Merck, Darmstadt, Art.-Nr.: 822184

3.2.3. Virusisolierung

3.2.3.1. Isolierung aus Blutproben Material:

• EDTA-Blutprobe eines Hundes mit dem Verdacht auf eine Staupeerkrankung

• PBS

• PBS doppelt konzentriert

• Ficoll²⁸

• RPMI 1640 Zellkulturmedium

• Interleukin 6²⁹

• f¨otales K¨alberserum (FKS)

• Penicillin G

• Streptomycin

• Makrotiterplatte (24 Kavit¨aten)³⁰

Die Blutproben stammten aus verschiedenen Tierarztpraxen von Tieren mit Staupe-verdacht. Das Alter der Tiere lag zwischen 8 Wochen und 2 Jahren, wobei der gr¨oßte Teil der Tiere im Alter zwischen 3 und 6 Monaten lag. Drei der Tiere waren kurz vor der Erkrankung aus dem Ausland gekommen. Zu diesen Blutproben lag jeweils auch eine Serumprobe des betreffenden Tieres vor.

Die EDTA-Blutprobe wurde 1:2 mit PBS verd¨unnt, in ein Zentrifugenr¨ohrchen ge-geben und bei ca. 300 xg f¨ur 10-20 min abzentrifugiert. Der ¨Uberstand wurde verworfen und die Leukozyten, die sich in einer Schicht ¨uber den Erythrozyten (

”buffy coat“) be-fanden, wurden mit einer Pasteurpipette vorsichtig abgesaugt und in 2 ml demin. Wasser gegeben, um die noch darin enthaltenen Erythrozyten zu lysieren. Nach 30 sec. wurden 2 ml doppelt konzentriertes PBS zugegeben. Nun wurde in ein zweites Zentrifugenr¨ ohr-chen ca. 5 ml Ficoll gegeben und die Leukozytensuspension vorsichtig dar¨ ubergeschich-tet. Dies wurde nun bei ca. 250 xg f¨ur 15-20 min zentrifugiert. Nach dem Zentrifugie-ren wurde die weißlich gef¨arbte Grenzschicht zwischen Ficoll und PBS, in der sich die Leukozyten gesammelt hatten, mit einer Pasteurpipette abgesogen und in ein weiteres Zentrifugenr¨ohrchen gegeben. Nun wurden sowohl die abgesogenen Leukozyten als auch das restliche Ficoll mit PBS auf ein Volumen von ca. 10 ml aufgef¨ullt und bei ca. 250 xg f¨ur 10 min zentrifugiert. Es folgten zwei weitere Waschschschritte mit jeweils ca. 10 ml PBS und einer mit ca. 10 ml RPMI 1640 und jeweils einer Zentrifugation von 10 min

28Seromed, Biochrom KG Berlin, Art.-Nr.: L6113

29Boehringer Mannheim GmbH, Art.-Nr.: 1444 581

30Nunc Roskilde, D¨anemark, Art. Nr.: 146485

bei 250 xg. Die nach der letzten Zentrifugation entstandenen Pellets wurden jeweils in 1ml RPMI 1640 mit dem Zusatz von 10% FKS, 0,005g/ml Il-6, 1.000U/ml Penicillin und 2,5 mg/ml Streptomycin aufgenommen, resuspendiert und in eine Kavit¨at einer Ma-krotiterplatte einges¨at. Diese wurde nun f¨ur 1 Stunde bei 37C bebr¨utet. Anschließend wurde das Zellkulturmedium unter vorsichtigem Sp¨ulen abgenommen und in eine zweite Kavit¨at ¨uberf¨uhrt. Die erste Kavit¨at wurde wieder mit 1ml Zellkulturmedium aufgef¨ullt.

Nun wurden jeder Kavit¨at eine Menge von ca. 15.000-20.000 Verozellen zugesetzt. Die Zellen wurden nun f¨ur ca. 1 Woche im Brutschrank bei 37C bebr¨utet, bis sich ein kon-fluenter Zellrasen ausgebildet hatte. Dabei wurde je nach Bedarf nach ca. 3-4 Tagen ein teilweiser Mediumwechsel durchgef¨uhrt.

3.2.3.2. Nachweis des isolierten Virus Material:

• Materialien f¨ur die Zellkultur siehe 3.1

• Materialien f¨ur den PLA siehe 3.2.2

• Mikrotiterplatten (96 Kavit¨aten)

Zum Nachweis des aus den Blutproben (siehe 3.2.3.1), isolierten Virus wurden infi-zierte Zellen mit Hilfe des indirekten Peroxidase-linked Antibody Assay angef¨arbt (siehe 3.2.2). Nach Ausbildung eines geschlossenen Zellrasens wurden das Zellkulturmedium abgenommen und in ein Zentrifugenr¨ohrchen gegeben. In jede Kavit¨at wurde nun ca.

1 ml Versen-Trypsin gegeben und f¨ur 10 min bei 37C inkubiert bis sich die Zellen von ihrer Unterlage gel¨ost hatten. Anschließend wurden auch sie in das zugeh¨orige Zentrifu-genr¨ohrchen gegeben und bei 200 xg f¨ur 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 5 ml DMEM mit 10% FKS aufgenommen und vorsichtig resuspendiert. Dann wurden die Zel-len in eine 25 cm² Zellkulturflasche einges¨at. 100l der Zellsuspension wurden in eine Kavit¨at einer Mikrotiterplatte gegeben. Diese Mikrotiterplatte wurde am n¨achsten Tag bei 80C f¨ur 4 Stunden hitzefixiert, anschließend wurden virusinfizierte Zellen mit dem indirekten PLA angef¨arbt (siehe 3.2.2). Waren in der Mikrotiterplatte angef¨arbte Zellen zu erkennen, wurden die in Zellkulturflaschen einges¨aten Zellen weiter im Brutschrank bei 37C bebr¨utet und nach Bedarf passagiert. Nach dem Auftreten einer virusbeding-ten Zellzerst¨orung von 50-70% der Zellen wurde die Zellkultur einem Gefriertauzyklus (-80C/20C) unterworfen und anschließend wie in 3.2.1 beschrieben weiterbehandelt.

3.2.3.3. Nachweis von Antik¨orpern gegen das Hundestaupevirus aus Seren von Tieren mit Staupeverdacht

Von den Hunden mit Staupeverdacht, von denen Blutproben zur Virusisolierung ver-wendet wurden, lag auch jeweils eine Serumprobe vor. Diese wurden mit dem

”

Neu-tralizing-Peroxidase-linked Antibody Assay“ (NPLA) (siehe 3.4.1.2) auf neutralisierende Antik¨orper gegen CDV untersucht.

3.3. Monoklonale Antik¨ orper

Es stand zu Beginn dieser Arbeit ein monoklonaler Antik¨orper (mAk CD/Px4) gegen das Staupevirus zur Verf¨ugung. Dieser war gegen das Virusisolat CDV 5804/Han90 hergestellt worden und als P-Protein spezifisch charakterisiert worden (Harder et al., 1991; Martens et al., 1995). Zus¨atzlich wurden neue monoklonale Antik¨orper gegen das Staupevirus (Isolat 2544/Han95) hergestellt.

3.3.1. Produktion monoklonaler Antik¨orper

Die Produktion der monoklonalen Antik¨orper erfolgte am Institut f¨ur Virologie der Tier¨arztlichen Hochschule Hannover. Die Aufarbeitung der Antigene und die Immuni-sierung der Balb/c-M¨ause wurde dort von Frau V. v. Messling durchgef¨uhrt (von Mes-sling, 1998). Als Virusantigene wurden das CDV-Isolat 2544/Han95 in der 8. Passage in Verozellen und rekombinante Baculoviren, die das N-, H-, oder F-Protein des CDV-Isolats 2544/Han95 (Harder, unver¨offentlicht) exprimierten, verwendet. Im Rahmen der Arbeit von V. v. Messling wurden auch die in Tabelle 3.1 gezeigten neun monoklonalen Antik¨orper gegen CDV etabliert und charakterisiert. Diese wurden f¨ur weitere Unter-suchungen zur Verf¨ugung gestellt. Von den zehn immunisierten Balb/c-M¨ausen wurde eine zur Gewinnung und Fusion der Splenozyten f¨ur diese Arbeit zur Verf¨ugung gestellt.

Diese Maus war mit CDV-Virusantigen und dem das H-Protein exprimierenden Bacu-lovirus nach folgendem Schema immunisiert worden.

32Antigenaufbereitung aus mit rekombinantem N-, F-, oder H-Baculovirus infizierten Sf 9-Zellen

Tabelle 3.1.: Charakteristika der verwendeten monoklonalen Antik¨orper (nach v.

CDCT-1 1 - N CDV 2544/Han95

CDCT-2 1 - N CDV 2544/Han95

CDRCT-1 1 400 H rH-Protein^d

CDRCT-2 1 - N rN-Protein

CDRCT-4 2b - N rF-Protein + CDV 2544/Han95

CDRCT-5 2b - N CDV 2544/Han95 + rN-Protein

CDRCT-8 1 - N CDV 2544/Han95 + rN-Protein

CDRCT-10 2b - N rF-Protein + CDV 2544/Han95

CDRCT-11 2b - N rF-Protein + CDV 2544/Han95

aBestimmung im ELISA

bBestimmung im NPLA

cErmittlung ¨uber Reaktion mit rekombinantem H- oder N-Protein

dIm Baculovirusexpressionssystem erzeugtes rekombinantes H-, F- oder N-Protein

3.3.1.1. Gewinnung und Fusion der Splenozyten Material

• PBS

• Polyethylenglycol (PEG) 1500³³

• Selektionsmedium: RPMI 1640 mit HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin)³⁴, 10% FKS, 2 mM L-Glutamin, 200 I.U. Interleukin 6 und 0,1 mM Natrium-Selenit³⁵ Die T¨otung der M¨ause erfolgte in einer CO₂-Atmosph¨are 72 Stunden nach der letzten Immunisierung. Zur Entnahme der Milz wurden die M¨ause auf dem R¨ucken fixiert. Nach Desinfektion des Haarkleides mit Brennspiritus, wurde die Haut vom Xyphoid bis zur Inguinalregion durchtrennt. Mit einer Spritze wurde nun Herzblut entnommen und f¨ur 30 min bei 500 xg abzentrifugiert. Das so gewonnene Serum wurde bei -80C bis zur Untersuchung auf Antik¨orper gegen das Staupevirus gelagert.

Nach Er¨offnung der Bauchh¨ohle wurde die Milz steril entnommen und in eine Petri-schale mit 10 ml PBS gegeben. Hier wurde das noch anhaftende Bindegewebe entfernt und anschließend die Milzkapsel an einem Pol er¨offnet. Die Milzpulpa wurde nun vorsich-tig durch diese ¨Offnung mit Hilfe zweier Pinzetten herausgestrichen. Die Zellsuspension

33Boehringer Mannheim GmbH, Art.-Nr.: 783641

34Sigma-Aldrich Deisenhofen, Art.-Nr.: H0262

35Sigma-Aldrich Deisenhofen, Art.-Nr.: S9133

wurde in ein Zentrifugenglas ¨uberf¨uhrt. Nach kurzer Zeit waren die gr¨oßeren Gewe-best¨ucke sedimentiert und der ¨Uberstand wurde in ein zweites Zentrifugenglas ¨uberf¨uhrt.

Das Sediment im ersten Glas wurde mit Hilfe von 10 ml PBS mehrfach resuspendiert, um aus den Gewebest¨ucken weitere Splenozyten zu l¨osen. Die gel¨osten Zellen wurden dem zweiten Zentrifugenglas hinzugef¨ugt. Die Zellen wurden nun in einer Zellz¨ ahlkam-mer gez¨ahlt. Die dabei ermittelte Zellzahl wurde halbiert, da angenommen wurde, daß die H¨alfte der Zellen Erythrozyten waren.

Zur Fusion wurde die murine Myelomzelllinie P3X63-Ag8.653 verwendet. Diese wur-den im Verh¨altnis 1:5 (Myelomzellen:Splenozyten) zu den Splenozyten gegeben. Die Zellen wurden dann bei 200 xg f¨ur 10 min pelletiert und der ¨Uberstand wurde m¨oglichst vollst¨andig entfernt. Anschließend wurde dem Pellet ¨uber den Zeitraum von einer Mi-nute, unter leichtem Schwenken, 1ml einer auf 37C vorgew¨armten PEG 1500-L¨osung zugegeben. Das Gemisch verweilte f¨ur eine Minute in einem auf 37C temperierten Was-serbad. Danach erfolgte zur Ausverd¨unnung des PEG die tropfenweise Zugabe von RPMI 1640 ¨uber mehrere Minuten. Nach der Pelletierung der fusionierten Zellen bei 100 xg f¨ur 10 min erfolgte ihre vorsichtige Resuspendierung in 400 ml Selektionsmedium und die Verteilung auf 20 Mikrotiterplatten mit jeweils 200l pro Kavit¨at.

Die Platten wurden im Brutschrank bei 37C und 5% CO₂inkubiert. Im Abstand von 2-3 Tagen wurden sie sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch auf das Wachstum von Zellkolonien kontrolliert. Dies diente zur Feststellung des g¨unstigsten Zeitpunktes f¨ur die Untersuchung der gewachsenen Hybridzellkolonien auf die Produktion von An-tik¨orpern. Dieses

”screening“ fand statt, wenn die Kolonien etwa 30% des Bodens der Kavit¨at bedeckten, was nach etwa 10-14 Tagen der Fall war. Dazu wurden 50l Medium aus jeder Kavit¨at abgenommen und durch 80l frisches Medium ersetzt. Das abgenom-mene Medium wurde auf das Vorhandensein virusspezifischer Antik¨orper untersucht.

3.3.1.2.

”Screening“ der Hybridzellkultur¨uberst¨ande auf die Produktion CDV-spezifischer Antik¨orper und Etablierung von

Hybridomaklonen Material

• Material f¨ur den PLA siehe 3.2.2

• Makrotiterplatten (24 Kavit¨aten)

• Reklonierungsmedium RPMI 1640 mit (HT) Hypoxanthin-Thymidin³⁶, 10% FKS und 2 mM L-Glutamin

Die Pr¨ufung des Zellkultur¨uberstandes der Hybridomakolonien auf CDV-spezifische Antik¨orper wurde mit Hilfe des indirekten

”Peroxidase-linked Assay“ (iPLA)

durch-36Sigma-Aldrich Deisenhofen, Art.-Nr.: H0137

gef¨uhrt. Daf¨ur wurden Mikrotiterplatten vorbereitet, bei denen je 100l einer Verozell-suspension mit 300000 Zellen/ml mit 50l einer 10-20 KID₅₀/ml enthaltenden Virus-suspension in jede Kavit¨at gegeben wurden. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen wurden die Zellen fixiert. Dazu wurde das Medium dekantiert und der Zellrasen mit 30%igem PBS gewaschen. Anschließend folgte die Hitzefixierung f¨ur 4 Stunden bei 80C.

Die Platten konnten nun entweder direkt verwendet werden oder bei -20C bis zu ihrer Verwendung gelagert werden.

F¨ur die ¨Uberpr¨ufung der Zellkultur¨uberst¨ande der Hybridzellkolonien auf CDV-spezifische Antik¨orper wurden 50l des Zellkultur¨uberstandes in eine schon mit 50l

F¨ur die ¨Uberpr¨ufung der Zellkultur¨uberst¨ande der Hybridzellkolonien auf CDV-spezifische Antik¨orper wurden 50l des Zellkultur¨uberstandes in eine schon mit 50l

Im Dokument Charakterisierung aktueller Wildtyp-Hundestaupevirus-Isolate mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern (Seite 33-0)