Produktion monoklonaler Antik¨ orper

Die Produktion der monoklonalen Antik¨orper erfolgte am Institut f¨ur Virologie der Tier¨arztlichen Hochschule Hannover. Die Aufarbeitung der Antigene und die Immuni-sierung der Balb/c-M¨ause wurde dort von Frau V. v. Messling durchgef¨uhrt (von Mes-sling, 1998). Als Virusantigene wurden das CDV-Isolat 2544/Han95 in der 8. Passage in Verozellen und rekombinante Baculoviren, die das N-, H-, oder F-Protein des CDV-Isolats 2544/Han95 (Harder, unver¨offentlicht) exprimierten, verwendet. Im Rahmen der Arbeit von V. v. Messling wurden auch die in Tabelle 3.1 gezeigten neun monoklonalen Antik¨orper gegen CDV etabliert und charakterisiert. Diese wurden f¨ur weitere Unter-suchungen zur Verf¨ugung gestellt. Von den zehn immunisierten Balb/c-M¨ausen wurde eine zur Gewinnung und Fusion der Splenozyten f¨ur diese Arbeit zur Verf¨ugung gestellt.

Diese Maus war mit CDV-Virusantigen und dem das H-Protein exprimierenden Bacu-lovirus nach folgendem Schema immunisiert worden.

32Antigenaufbereitung aus mit rekombinantem N-, F-, oder H-Baculovirus infizierten Sf 9-Zellen

Tabelle 3.1.: Charakteristika der verwendeten monoklonalen Antik¨orper (nach v.

CDCT-1 1 - N CDV 2544/Han95

CDCT-2 1 - N CDV 2544/Han95

CDRCT-1 1 400 H rH-Protein^d

CDRCT-2 1 - N rN-Protein

CDRCT-4 2b - N rF-Protein + CDV 2544/Han95

CDRCT-5 2b - N CDV 2544/Han95 + rN-Protein

CDRCT-8 1 - N CDV 2544/Han95 + rN-Protein

CDRCT-10 2b - N rF-Protein + CDV 2544/Han95

CDRCT-11 2b - N rF-Protein + CDV 2544/Han95

aBestimmung im ELISA

bBestimmung im NPLA

cErmittlung ¨uber Reaktion mit rekombinantem H- oder N-Protein

dIm Baculovirusexpressionssystem erzeugtes rekombinantes H-, F- oder N-Protein

3.3.1.1. Gewinnung und Fusion der Splenozyten Material

• PBS

• Polyethylenglycol (PEG) 1500³³

• Selektionsmedium: RPMI 1640 mit HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin)³⁴, 10% FKS, 2 mM L-Glutamin, 200 I.U. Interleukin 6 und 0,1 mM Natrium-Selenit³⁵ Die T¨otung der M¨ause erfolgte in einer CO₂-Atmosph¨are 72 Stunden nach der letzten Immunisierung. Zur Entnahme der Milz wurden die M¨ause auf dem R¨ucken fixiert. Nach Desinfektion des Haarkleides mit Brennspiritus, wurde die Haut vom Xyphoid bis zur Inguinalregion durchtrennt. Mit einer Spritze wurde nun Herzblut entnommen und f¨ur 30 min bei 500 xg abzentrifugiert. Das so gewonnene Serum wurde bei -80C bis zur Untersuchung auf Antik¨orper gegen das Staupevirus gelagert.

Nach Er¨offnung der Bauchh¨ohle wurde die Milz steril entnommen und in eine Petri-schale mit 10 ml PBS gegeben. Hier wurde das noch anhaftende Bindegewebe entfernt und anschließend die Milzkapsel an einem Pol er¨offnet. Die Milzpulpa wurde nun vorsich-tig durch diese ¨Offnung mit Hilfe zweier Pinzetten herausgestrichen. Die Zellsuspension

33Boehringer Mannheim GmbH, Art.-Nr.: 783641

34Sigma-Aldrich Deisenhofen, Art.-Nr.: H0262

35Sigma-Aldrich Deisenhofen, Art.-Nr.: S9133

wurde in ein Zentrifugenglas ¨uberf¨uhrt. Nach kurzer Zeit waren die gr¨oßeren Gewe-best¨ucke sedimentiert und der ¨Uberstand wurde in ein zweites Zentrifugenglas ¨uberf¨uhrt.

Das Sediment im ersten Glas wurde mit Hilfe von 10 ml PBS mehrfach resuspendiert, um aus den Gewebest¨ucken weitere Splenozyten zu l¨osen. Die gel¨osten Zellen wurden dem zweiten Zentrifugenglas hinzugef¨ugt. Die Zellen wurden nun in einer Zellz¨ ahlkam-mer gez¨ahlt. Die dabei ermittelte Zellzahl wurde halbiert, da angenommen wurde, daß die H¨alfte der Zellen Erythrozyten waren.

Zur Fusion wurde die murine Myelomzelllinie P3X63-Ag8.653 verwendet. Diese wur-den im Verh¨altnis 1:5 (Myelomzellen:Splenozyten) zu den Splenozyten gegeben. Die Zellen wurden dann bei 200 xg f¨ur 10 min pelletiert und der ¨Uberstand wurde m¨oglichst vollst¨andig entfernt. Anschließend wurde dem Pellet ¨uber den Zeitraum von einer Mi-nute, unter leichtem Schwenken, 1ml einer auf 37C vorgew¨armten PEG 1500-L¨osung zugegeben. Das Gemisch verweilte f¨ur eine Minute in einem auf 37C temperierten Was-serbad. Danach erfolgte zur Ausverd¨unnung des PEG die tropfenweise Zugabe von RPMI 1640 ¨uber mehrere Minuten. Nach der Pelletierung der fusionierten Zellen bei 100 xg f¨ur 10 min erfolgte ihre vorsichtige Resuspendierung in 400 ml Selektionsmedium und die Verteilung auf 20 Mikrotiterplatten mit jeweils 200l pro Kavit¨at.

Die Platten wurden im Brutschrank bei 37C und 5% CO₂inkubiert. Im Abstand von 2-3 Tagen wurden sie sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch auf das Wachstum von Zellkolonien kontrolliert. Dies diente zur Feststellung des g¨unstigsten Zeitpunktes f¨ur die Untersuchung der gewachsenen Hybridzellkolonien auf die Produktion von An-tik¨orpern. Dieses

”screening“ fand statt, wenn die Kolonien etwa 30% des Bodens der Kavit¨at bedeckten, was nach etwa 10-14 Tagen der Fall war. Dazu wurden 50l Medium aus jeder Kavit¨at abgenommen und durch 80l frisches Medium ersetzt. Das abgenom-mene Medium wurde auf das Vorhandensein virusspezifischer Antik¨orper untersucht.

3.3.1.2.

”Screening“ der Hybridzellkultur¨uberst¨ande auf die Produktion CDV-spezifischer Antik¨orper und Etablierung von

Hybridomaklonen Material

• Material f¨ur den PLA siehe 3.2.2

• Makrotiterplatten (24 Kavit¨aten)

• Reklonierungsmedium RPMI 1640 mit (HT) Hypoxanthin-Thymidin³⁶, 10% FKS und 2 mM L-Glutamin

Die Pr¨ufung des Zellkultur¨uberstandes der Hybridomakolonien auf CDV-spezifische Antik¨orper wurde mit Hilfe des indirekten

”Peroxidase-linked Assay“ (iPLA)

durch-36Sigma-Aldrich Deisenhofen, Art.-Nr.: H0137

gef¨uhrt. Daf¨ur wurden Mikrotiterplatten vorbereitet, bei denen je 100l einer Verozell-suspension mit 300000 Zellen/ml mit 50l einer 10-20 KID₅₀/ml enthaltenden Virus-suspension in jede Kavit¨at gegeben wurden. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen wurden die Zellen fixiert. Dazu wurde das Medium dekantiert und der Zellrasen mit 30%igem PBS gewaschen. Anschließend folgte die Hitzefixierung f¨ur 4 Stunden bei 80C.

Die Platten konnten nun entweder direkt verwendet werden oder bei -20C bis zu ihrer Verwendung gelagert werden.

F¨ur die ¨Uberpr¨ufung der Zellkultur¨uberst¨ande der Hybridzellkolonien auf CDV-spezifische Antik¨orper wurden 50l des Zellkultur¨uberstandes in eine schon mit 50l PBS gef¨ullte Kavit¨at einer vorbereiteten PLA-Platte gegeben und ¨uber Nacht bei 4C inkubiert. Danach wurden die Zellkultur¨uberst¨ande dekantiert und die Kavit¨aten dreimal mit je 200l PBS-Tween gewaschen. Die weitere Behandlung erfolgte wie in Abschnitt 3.2.2 beschrieben. Als spezifisch-positive Reaktion waren rot-braun gef¨arbte Herde von Zellen anzusehen.

Kolonien, die im iPLA eine spezifisch-positive Reaktion zeigten, wurden auf Makro-titerplatten umgesetzt. Hierbei wurde auch von Selektionsmedium- auf Reklonierungs-medium umgestellt. Wiederholtes Testen der Kolonien mittels iPLA sicherte, daß nur spezifisch-positive Kolonien weitervermehrt und rekloniert wurden.

Um die Monoklonalit¨at der Zellkolonien zu sichern, wurden sie rekloniert, sobald sie sich in der logarithmischen Wachstumsphase befanden. Zuvor wurde zur Sicherung der Zellen mindestens eine Portion bei -80C eingefroren. Zur Reklonierung wurde die

”limited-dilution“-Methode angewandt. Die Zellen wurden vorsichtig resuspendiert und ihre Zahl in einer Z¨ahlkammer nach Thoma bestimmt. Sie wurden nun auf 120 Zellen pro 20 ml verd¨unnt und in eine Mikrotiterplatte ausges¨at, so daß jede Kavit¨at 200l Medium mit im Mittel 1-2 Hybridomazellen enthielt. Die Inkubation erfolgte f¨ur 10-14 Tage im Brutschrank bei 37C und 5% CO₂.

Vertiefungen mit einzelnen Kolonien wurden im iPLA auf die Produktion CDV-spezifischer Antik¨orper getestet. Antik¨orper-positiv reagierende Kolonien wurden wie-derum auf Makrotiterplatten umgesetzt. Sobald sich die Zellen erneut in der logarithmi-schen Wachstumsphase befanden, wurden sie erneut rekloniert. Dieses Verfahren wurde insgesamt 3-4mal wiederholt. Anschließend wurden die stabil produzierenden Klone zur weiteren Vermehrung zun¨achst in 25 cm² Zellkulturflaschen und dann in 75 cm² Zellkul-turflaschen ¨uberf¨uhrt. Nun wurden von jedem Hybridzellklon zehn Portionen `a 1,8 ml mit 1 x 10⁶Zellen/ml bei -80C eingefroren.

3.3.2. Charakterisierung monoklonaler Antik¨orper