Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit der Ergebnisse . 70

Bei der Betrachtung der einzelnen Versuchsans¨atze ließ sich feststellen, daß die Farb-reaktionen bei der Verwendung verschiedener Seren z. T. sehr unterschiedlich ausfielen.

Bei einem Teil der Seren kam es auch nach langer Inkubationszeit von z. T. ¨uber zwei Stunden nicht zu einer merklichen Hintergrundreaktion, so daß die Farbreaktion erst abgebrochen wurde, wenn es zu keiner sichtbaren Zunahme der Reaktionsst¨arke an den Peptidpunkten mehr kam. Bei anderen Seren kam es dagegen bereits nach einer halben bis dreiviertel Stunde zu einer so starken Hintergrundreaktion, daß es zu einer ¨ Uberla-gerung mit den positiven Reaktionen zu kommen drohte, so daß die Reaktion trotz noch nicht abgeschlossener Farbzunahme an den Peptidpunkten abgebrochen werden mußte.

Auch bei den Nullseren ließen sich deutliche Unterschiede ausmachen. Obwohl keines dieser Seren einen Neutralisationstiter von gr¨oßer als 20 aufwies, zeigten sich auch hier deutliche Unterschiede vor allem in der St¨arke der Hintergrundreaktion.

Da diese Beobachtungen sowohl auf Unterschiede in den Versuchsbedingungen als auch auf besondere Eigenschaften der Seren zur¨uckzuf¨uhren sein konnten, wurden Ver-suche zur Reproduzierbarkeit von Versuchsergebnissen mit einem Serumpaar in verschie-denen Versuchsans¨atzen durchgef¨uhrt. Dabei wurde auf die Reproduzierbarkeit sowohl der spezifischen F¨arbungen als auch der Hintergrundreaktion geachtet. Das Serumpaar C17C19m1 wurde mit dem F-Protein-Peptidtr¨ager in vier verschiedenen Versuchen ver-wendet. Dabei wurden unterschiedlich lange Inkubationszeiten f¨ur die Substratreaktion gew¨ahlt. Die Inkubationszeiten lagen bei 0,5h (Ansatz A), 1h (Ansatz B), 1,5h (An-satz C) und 2h (An(An-satz D) Dabei zeigte sich, daß die Hintergrundreaktionen bei den vier verschiedenen Ans¨atzen jeweils sehr ¨ahnlich ausfielen. Die Reaktionen der Peptide mit den Seren zeigte dagegen einige kleinere Unterschiede (siehe Abb. 4.11). Vor allem bei Peptiden, die Reaktionsst¨arken zwischen ein- und zweimal dem Hintergrundwert mit den Peptiden zeigten, gab es zwischen den verschiedenen Ans¨atzen Unterschiede. So rea-gierte das Serum C19m1 in Ansatz D mit deutlich mehr Peptiden als in den Ans¨atzen A-C. Peptide, die mit dem Serum eine Reaktionsst¨arke von ¨uber zwei zeigten, reagierten dagegen bis auf zwei Ausnahmen (Peptide AS633 und AS641 in Ansatz A) in allen vier

0

1

2

3

4

5

C19m1A C19m1B C19m1C C19m1D 11115913172125293337414549535761656973778185899397101105109113117121125129133137141145149153157161165169173177181185189 193197201205209213217221225229233237241245249253257261265269273277281285289293297301305309313317321325329333337341345349353357361365369373377381385389393397 401405409413417421425429433437441445449453457461465469473477481485489493497501505509513517521525529533537541545549553557561565569573577581585589593597601605 609613617621625629633637641645649650114172125173745543745667078931019397101108?142146167174189212129164650653653 Abbildung4.11.:VergleichderReaktioneneinesHundeserums(C19m1)invierverschiedenenVersuchen(A-D)mitdem F-ProteinPeptidtr¨ager.DieInkubationszeiten f¨ur

dieSubstratreaktionlagenzwischen0,5h(A)und2h(D)

Ans¨atzen. Es zeigte sich auch, daß das Verh¨altnis des Positivserums zum Nullserum sehr stabil blieb.

4.4.1.4. Uberpr¨¨ ufung der Wiederverwendbarkeit der Peptidtr¨ager

Die Peptidtr¨ager wurden nach jedem Versuchsansatz regeneriert, indem die an die Pepti-de gebunPepti-denen Antik¨orper durch Waschschritte mit verschiedenen Regenerationspuffern wieder von diesen gel¨ost wurden. Um dies so vollst¨andig wie m¨oglich zu erreichen, wurden entweder je zwei vollst¨andige Regenerationszyklen zwischen zwei Versuchen durchgef¨uhrt oder es wurde zwischen zwei Versuchen mit Hundeserum ein Versuch mit monoklona-len Antik¨orpern durchgef¨uhrt. Da hier als sekund¨arer Antik¨orper Anti-Maus-IgG-AP verwendet wurde, konnte es nicht zu Kreuzreaktionen zwischen noch gebundenen Hun-deantik¨orpern und dem sekund¨aren Antik¨orper kommen. Auch so lagen zwischen zwei Versuchen mit Antik¨orpern von der gleichen Spezies zwei vollst¨andige Regenerationen.

Dadurch wurde nachMartens (1994) eine weitestgehende Abl¨osung erzielt. Zur ¨ Uber-pr¨ufung, ob diese auch tats¨achlich stattgefunden hatte, wurde die Abl¨osung der prim¨aren Antik¨orper von den Peptiden w¨ahrend der Versuchsserie einige Male ¨uberpr¨uft. Dazu wurden die Peptidtr¨ager nur mit dem sekund¨aren Antik¨orperkonjugat Anti-Hund-IgG-AP inkubiert und dann eine Substratreaktion durchgef¨uhrt. Dabei zeigte sich, daß es weder zu einer Anf¨arbung der Peptidpunkte kam noch zu einer Hintergrundreaktion.

Die Peptidtr¨ager kamen ¨uber 20 Mal zum Einsatz. Im Verlauf ihrer Benutzung zeigten sich, obwohl sich nach jeweils zwei Regenerationsdurchl¨aufen keine spezifischen F¨ arbun-gen mehr zeiarbun-gen ließen, im Bereich der in den vorheriarbun-gen Durchg¨angen am h¨aufigsten und st¨arksten angef¨arbten Peptide gelbliche Auflagerungen. Zugleich verl¨angerte sich die Zeit der Substratreaktion von ca. 0,5-1h zu Beginn der Versuche auf 1,5-2h in den letzten Versuchen bis die Reaktion abgeschlossen war und es zu keiner Zunahme der Farbtiefe mehr kam.

Zur Kontrolle ob die Reaktionen der Seren mit den Peptidtr¨agern im Laufe der Zeit nicht nur schw¨acher werden, sondern sich auch qualitativ ver¨andern, wurde mit einem Serumpaar ein Versuch zu Beginn der Verwendung der Peptidtr¨ager durchgef¨uhrt und ein Versuch gegen Ende der Verwendung (nach ca. 20maliger Verwendung). Dabei zeigte sich, daß sich das Reaktionsmuster der Seren nach Korrektur mit den Hintergrundwerten trotz der z.T. recht starken gelblichen Auflagerungen auf den Peptidtr¨agern zwischen den beiden Versuchen nur geringf¨ugig unterschied. Diese Unterschiede entsprachen in ihrer St¨arke denen, die auch zwischen zwei unmittelbar aufeinanderfolgenden Versuchen mit dem gleichen Serum auftraten.

In dieser Arbeit wurde versucht mit Hilfe monoklonaler und polyklonaler Antik¨orper sowie unter Verwendung sequenz¨uberlappender synthetischer Peptide eine Charakteri-sierung aktueller CDV-Feldisolate durchzuf¨uhren. Dabei wurde vor allem nach Unter-schieden zwischen diesen CDV-Feldvirusisolaten und CDV-Impfvirusst¨ammen gesucht.

CDV ist wie andere Morbilliviren (MV, RPV) auch ein Virus mit nur einem bekannten Serotyp. Eine einmal durchgemachte Infektion bewirkt daher in der Regel eine meist lebenslang anhaltende Immunit¨at. Trotzdem kommt es immer wieder, auch in L¨andern mit einer hohen Impfrate, zu CDV-Epidemien, bei denen auch immer wieder Tiere er-kranken, die vorberichtlich gegen CDV geimpft sind. In solchen F¨allen wird h¨aufig die Vermutung aufgestellt, daß die verwendeten Impfstoffe keinen ausreichenden Schutz ge-gen die zirkulierenden CDV-Feldvirusisolate bieten. Dies k¨onnte durch einen antigenen Drift in der Evolution des Virus von den 40-50 Jahre alten Impfst¨ammen, die zudem in Zellkultur oder in H¨uhnereiern weitervermehrt und attenuiert wurden, zu den heute zir-kulierenden Feldisolaten passiert sein. CDV ist in der Regel auch in L¨andern mit hoher Impfrate endemisch, da es sich in einem breiten Wildtierreservoir halten kann.

5.1. Virusisolierung

Um aktuelle CDV-Isolate zu gewinnen, wurde die Isolierung von CDV aus Blutproben von Hunden mit Verdacht auf eine Staupeerkrankung versucht. Dabei gelang die Isolie-rung von Virus aus drei Proben. Bei vier weiteren Proben wurde zwar Virus nachgewie-sen, es konnte aber nicht in Zellkultur vermehrt werden. Dies kann mehrere Ursachen haben. Zum einen ist CDV aus Blut- oder Gewebeproben nur schwer auf Zellkultur (Verozellen) zu adaptieren. Durch die Kokultivierung von Lymphozyten des erkrank-ten Tieres mit den permanenerkrank-ten Zellen, kann die Erfolgsrate erh¨oht werden (Appel et al., 1992), allerdings gelingt es dennoch h¨aufig nicht, CDV auf Verozellen zu adaptie-ren. Des weiteren k¨onnten die Tiere sich schon am Ende der vir¨amischen Phase befunden haben, so daß nur noch sehr wenig Virus im Blut vorhanden war. Daf¨ur spricht, daß die Antik¨orpertiter bei den Tieren, bei denen zwar der Nachweis von CDV gelang, aber dieses nicht vermehrt werden konnte, im Durchschnitt h¨oher lag als bei den Tieren, bei denen die Vermehrung gelang.Durch den vermutlich bei diesen Tieren geringeren Vi-rusgehalt im Blut gelang hier wahrscheinlich nicht die Adaptierung des Virus an die Zellkultur. Es kam hier zwar zu einer Prim¨arinfektion der Zellen, aber nicht zu einer

weiteren Virusvermehrung. Bei den Tieren, bei denen kein Virusnachweis gelang, lag vermutlich auch keine Infektion vor.

5.2. Charakterisierung der CDV-Isolate mit polyklonalen Seren

5.2.1. Kreuzneutralisationstest

Zur Charakterisierung der CDV-Isolate mit polyklonalen Seren wurde der Kreuneutra-lisationstest verwendet. Im KreuzneutraKreuneutra-lisationstest k¨onnen Unterschiede in der F¨ ahig-keit von polyklonalen Seren zur Neutralisation von verschiedenen Virusisolaten erkannt werden. Diese Unterschiede k¨onnen auf Ver¨anderungen in den f¨ur die Neutralisation wichtigen Epitopen auf dem H- und F-Protein des Virus zur¨uckzuf¨uhren sein.

Es wurden verschiedene Seren (siehe 3.4.1.1) auf ihre neutralisierenden Eigenschaf-ten gegen¨uber den CDV-Isolaten untersucht. Als Vergleichsisolat wurde der Impfvirus-stamm Rockborn gew¨ahlt, da dieser den Feldisolaten genetisch ¨ahnlicher ist als der Impfvirusstamm Onderstepoort. Es zeigten sich nur geringe Unterschiede im Neutrali-sationsverhalten der Seren gegen¨uber dem Impfstamm Rockborn und den anderen Viru-sisolaten. Nur bei zwei der verwendeten Virusisolate (Onderstepoort, CDV 404/Han94) zeigte sich ein statistisch signifikanter Unterschied in der H¨ohe der Neutralisationstiter im Vergleich zum Impfstamm Rockborn (p ≤ 0,05). Die Neutralisationstiter der Seren gegen¨uber diesen beiden Virusisolaten lagen im Mittel etwa eine halbe Titerstufe nied-riger als die Neutralisationstiter gegen¨uber dem Stamm Rockborn. Es m¨ussen hier also Unterschiede in den neutralisierenden Epitopen zwischen diesen Virusisolaten vorgele-gen haben. Bei dem CDV-Isolat 404/Han89 hatte sich auch schon bei der Reaktion mit N-Protein-spezifischen mAks Unterschiede zu anderen Virusisolaten gezeigt. Es ließen sich bei diesem Isolat daher sowohl antigene Unterschiede auf dem N-Protein als auch auf dem H- oder F-Protein (neutralisierende Epitope) ausmachen. Da die Unterschiede in den Neutralisationstitern aber nur gering ausfielen (0,5 log₂), l¨aßt dies darauf schlie-ßen, daß noch alle vorkommenden Virusisolate durch Antik¨orper gegen die verwendeten Impfst¨amme ausreichend gut neutralisiert werden. In anderen Untersuchungen wurden dagegen deutliche Unterschiede zwischen den Neutralisationstitern von Seren, die ge-gen ein Feldisolat gerichtet waren, und Seren, die gege-gen den Onderstepoort-Impfstamm hergestellt worden waren, festgestellt. Das jeweils homologe Virus wurde von den Se-ren deutlich besser (bis zum Faktor 8) neutralisiert als das heterologe Virus (Gemma et al., 1996;Iwatsuki et al., 1997).Haas et al. (1997) fanden mit Seren von nat¨urlich Infizierten und geimpften Tieren dagegen keine statistisch signifikanten Unterschiede in der H¨ohe der Neutralisationstiter dieser Seren gegen¨uber den Isolaten 2544/Han95, Rockborn und Onderstepoort. Diese Unterschiede sind vermutlich vor allem in der Ver-wendung von Seren unterschiedlicher Herkunft begr¨undet. Mit stammspezifischen Seren

lassen sich vermutlich eher Unterschiede feststellen als mit Seren von nat¨urlich infizier-ten oder immunisierinfizier-ten Tieren, die eventuell Kontakt mit verschiedenen Virusisolainfizier-ten hatten.

5.3. Charakterisierung der CDV-Isolate mit monoklonalen