Viren

Es standen verschiedene CDV-Isolate zur Verf¨ugung. Dies waren zum einen die beiden Impfst¨amme Rockborn¹⁷ und Onderstepoort¹⁸. Die St¨amme 2544/Han95 404/Han94, 4513/Han95, 1493/Han89 und 5804/Han89 waren aus an Staupe erkrankten Hunden

17Behringwerke Marburg

18Vemie, Veterin¨archemie GmbH

isoliert worden (Haas et al., 1997;Harder et al., 1991). Weitere Virusisolate wurden im Verlauf dieser Arbeit aus an Staupe erkrankten Hunden gewonnen.

3.2.1. Vermehrung in Zellkultur

Die zur Vermehrung verwendeten Verozellen wuchsen in Zellkulturflaschen zu einem zu 80% konfluenten Zellrasen aus. Das Zellkulturmedium wurde abgenommen und der Zell-rasen mit 1 ml einer Virussuspension infiziert, die zuvor im Wasserbad aufgetaut worden war. Anschließend erfolgte eine Inkubation von einer Stunde bei 37C zur Adsorption des Virus an den Zellrasen. Nach der Inkubation wurde die Virussupension abgesogen und frisches Zellkulturmedium mit 3% FKS zugegeben. Die weitere Bebr¨utung erfolgte bei 37C mit einem kompletten Mediumwechsel am zweiten Tag. Nach Ausbreitung einer virusbedingten Zellzerst¨orung von 60-70% am 3. oder 4. Tag nach der Infizierung erfolgte ein Gefrier-Tau-Zyklus der gesamten Zellkultur bei -80C/20C. Dabei wurde die Flasche beim Auftauen kr¨aftig gesch¨uttelt, um die Zellen weitestgehend von der Flaschenwand zu l¨osen. Die Zelltr¨ummer wurden anschließend bei 700 xg f¨ur 10 min abzentrifugiert.

Die Virussuspension wurde dann in 1 ml Portionen aliquotiert und bei -80C gelagert.

3.2.2. Quantitiative Bestimmung der Infektiosit¨at Material

• Materialien f¨ur die Zellkultur siehe 3.1

• Mikrotiterplatten f¨ur Zellkultur (96 Kavit¨aten)¹⁹

• PBS (phosphate buffered saline): 136 mM NaCl (8 g), 2,68 mM KCl (0,2 g), 7,0 mM Na₂HPO₄ x 2 H₂O²⁰ (1,43 g), 150M KH₂PO₄ (0,2 g) ad 1000 ml H₂0 demin., pH 7,0 mit HCl einstellen

• Ziege-anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugat (GAM-PO)²¹

• Natriumacetat-Puffer: 0,05 M (4,1 g) Natriumacetat x 3 H₂O²² ad 1000 ml H₂O demin., pH 5,0 mit 1 N Essigs¨aure²³ einstellen

• AEC-F¨arbel¨osung: 4 mg 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC)²⁴, 0,6 ml Dimethylforma-mid (DMF)²⁵ ad 10 ml Natriumacetat-Puffer

• 30% H₂O₂²⁶

19Nunc, Roskilde D¨anemark, Art.-Nr.: 13982

20Merck, Darmstadt, Art.-Nr.: 931 K12717780

21Dianova-Immunotech Hamburg, Art.-Nr.: 304-055-003

22Roth GmbH Karlsruhe, Art.-Nr.: 6773

23Roth GmbH Karlsruhe, Art.-Nr.: 3738.2

24Sigma-Aldrich Deisenhofen, Art.-Nr.: A5754

25Roth GmbH Karlsruhe, Art.-Nr.: 6251.2

26Merck Darmstadt, Art.-Nr.: 1.08597

• PBS-Tween (0,05% v/v Tween 20²⁷)

Als Verfahren zur Bestimmung der mittleren kulturinfekti¨osen Dosis (KID₅₀) einer Virussuspension wurde die Endpunktverd¨unnungsmethode im Mikrotitersystem mit Hil-fe von Zellkulturen verwendet.

Die Virussuspension wurde in log₁₀-Stufen in Zellkulturmedium (DMEM) verd¨unnt und 100l jeder Verd¨unnungsstufe in je vier Kavit¨aten einer Mikrotiterplatte gegeben.

50l einer Zellsuspension mit 300.000 Verozellen/ml (d.h. 15.000 Zellen pro Vertiefung) wurden hinzugef¨ugt. Es folgte nun eine Inkubation im Brutschrank (37C, 5% CO₂) f¨ur drei Tage. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Zellen fixiert. Dazu wurde das Medium dekantiert und der Zellrasen mit 30%igem PBS gewaschen. Anschließend folgte die Hitzefixierung f¨ur 4 Stunden bei 80C.

Zur Darstellung von virusinfizierten Zellen wurde der indirekte Peroxidase-linked-Assay (iPLA) verwendet. Hierf¨ur wurden in jede Kavit¨at der Platte 100l des CDV-spezifischen monoklonalen Antik¨orpers CD/Px4 als Zellkultur¨uberstand (ZK ¨U) in einer Verd¨unnung von 1:50 in PBS-Tween zugegeben und f¨ur zwei Stunden bei Raumtempe-ratur inkubiert. Danach wurde die mAk-L¨osung dekantiert und die Kavit¨aten dreimal mit je 200l PBS-Tween gewaschen. Anschließend wurden 100l des Enzymkonjugats GAM-PO in einer Verd¨unnung von 1:2000 in PBS-Tween in jede Kavit¨at pipettiert und f¨ur eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Dekantieren des Enzymkon-jugates und dreimaligem Waschen mit PBS-Tween erfolgte die Zugabe von je 100l der AEC-F¨arbel¨osung unter Zusatz von 60l H₂O₂/10ml als Substrat der Peroxidase. Die F¨arbel¨osung wurde nach einer Inkubationszeit von 30 min dekantiert und die Platten mit Leitungswasser gewaschen.

Die Auswertung erfolgte unter dem Lichtmikroskop bei einer 50- bis 100-fachen Ver-gr¨oßerung. Spezifisch positive Reaktionen waren als Herde braun-rot gef¨arbter Zellen zu erkennen. Als infiziert galten die Vertiefungen, in denen mindestens eine Zelle spezifisch angef¨arbt war. Die mittlere kulturinfekti¨ose Dosis wurde nach der Formel von Spaer-mann und Kaerber (Kaerber, 1931) berechnet. Der ermittelte Virustiter wurde auf das Volumen von 1,0 ml umgerechnet.

27Merck, Darmstadt, Art.-Nr.: 822184

3.2.3. Virusisolierung

3.2.3.1. Isolierung aus Blutproben Material:

• EDTA-Blutprobe eines Hundes mit dem Verdacht auf eine Staupeerkrankung

• PBS

• PBS doppelt konzentriert

• Ficoll²⁸

• RPMI 1640 Zellkulturmedium

• Interleukin 6²⁹

• f¨otales K¨alberserum (FKS)

• Penicillin G

• Streptomycin

• Makrotiterplatte (24 Kavit¨aten)³⁰

Die Blutproben stammten aus verschiedenen Tierarztpraxen von Tieren mit Staupe-verdacht. Das Alter der Tiere lag zwischen 8 Wochen und 2 Jahren, wobei der gr¨oßte Teil der Tiere im Alter zwischen 3 und 6 Monaten lag. Drei der Tiere waren kurz vor der Erkrankung aus dem Ausland gekommen. Zu diesen Blutproben lag jeweils auch eine Serumprobe des betreffenden Tieres vor.

Die EDTA-Blutprobe wurde 1:2 mit PBS verd¨unnt, in ein Zentrifugenr¨ohrchen ge-geben und bei ca. 300 xg f¨ur 10-20 min abzentrifugiert. Der ¨Uberstand wurde verworfen und die Leukozyten, die sich in einer Schicht ¨uber den Erythrozyten (

”buffy coat“) be-fanden, wurden mit einer Pasteurpipette vorsichtig abgesaugt und in 2 ml demin. Wasser gegeben, um die noch darin enthaltenen Erythrozyten zu lysieren. Nach 30 sec. wurden 2 ml doppelt konzentriertes PBS zugegeben. Nun wurde in ein zweites Zentrifugenr¨ ohr-chen ca. 5 ml Ficoll gegeben und die Leukozytensuspension vorsichtig dar¨ ubergeschich-tet. Dies wurde nun bei ca. 250 xg f¨ur 15-20 min zentrifugiert. Nach dem Zentrifugie-ren wurde die weißlich gef¨arbte Grenzschicht zwischen Ficoll und PBS, in der sich die Leukozyten gesammelt hatten, mit einer Pasteurpipette abgesogen und in ein weiteres Zentrifugenr¨ohrchen gegeben. Nun wurden sowohl die abgesogenen Leukozyten als auch das restliche Ficoll mit PBS auf ein Volumen von ca. 10 ml aufgef¨ullt und bei ca. 250 xg f¨ur 10 min zentrifugiert. Es folgten zwei weitere Waschschschritte mit jeweils ca. 10 ml PBS und einer mit ca. 10 ml RPMI 1640 und jeweils einer Zentrifugation von 10 min

28Seromed, Biochrom KG Berlin, Art.-Nr.: L6113

29Boehringer Mannheim GmbH, Art.-Nr.: 1444 581

30Nunc Roskilde, D¨anemark, Art. Nr.: 146485

bei 250 xg. Die nach der letzten Zentrifugation entstandenen Pellets wurden jeweils in 1ml RPMI 1640 mit dem Zusatz von 10% FKS, 0,005g/ml Il-6, 1.000U/ml Penicillin und 2,5 mg/ml Streptomycin aufgenommen, resuspendiert und in eine Kavit¨at einer Ma-krotiterplatte einges¨at. Diese wurde nun f¨ur 1 Stunde bei 37C bebr¨utet. Anschließend wurde das Zellkulturmedium unter vorsichtigem Sp¨ulen abgenommen und in eine zweite Kavit¨at ¨uberf¨uhrt. Die erste Kavit¨at wurde wieder mit 1ml Zellkulturmedium aufgef¨ullt.

Nun wurden jeder Kavit¨at eine Menge von ca. 15.000-20.000 Verozellen zugesetzt. Die Zellen wurden nun f¨ur ca. 1 Woche im Brutschrank bei 37C bebr¨utet, bis sich ein kon-fluenter Zellrasen ausgebildet hatte. Dabei wurde je nach Bedarf nach ca. 3-4 Tagen ein teilweiser Mediumwechsel durchgef¨uhrt.

3.2.3.2. Nachweis des isolierten Virus Material:

• Materialien f¨ur die Zellkultur siehe 3.1

• Materialien f¨ur den PLA siehe 3.2.2

• Mikrotiterplatten (96 Kavit¨aten)

Zum Nachweis des aus den Blutproben (siehe 3.2.3.1), isolierten Virus wurden infi-zierte Zellen mit Hilfe des indirekten Peroxidase-linked Antibody Assay angef¨arbt (siehe 3.2.2). Nach Ausbildung eines geschlossenen Zellrasens wurden das Zellkulturmedium abgenommen und in ein Zentrifugenr¨ohrchen gegeben. In jede Kavit¨at wurde nun ca.

1 ml Versen-Trypsin gegeben und f¨ur 10 min bei 37C inkubiert bis sich die Zellen von ihrer Unterlage gel¨ost hatten. Anschließend wurden auch sie in das zugeh¨orige Zentrifu-genr¨ohrchen gegeben und bei 200 xg f¨ur 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 5 ml DMEM mit 10% FKS aufgenommen und vorsichtig resuspendiert. Dann wurden die Zel-len in eine 25 cm² Zellkulturflasche einges¨at. 100l der Zellsuspension wurden in eine Kavit¨at einer Mikrotiterplatte gegeben. Diese Mikrotiterplatte wurde am n¨achsten Tag bei 80C f¨ur 4 Stunden hitzefixiert, anschließend wurden virusinfizierte Zellen mit dem indirekten PLA angef¨arbt (siehe 3.2.2). Waren in der Mikrotiterplatte angef¨arbte Zellen zu erkennen, wurden die in Zellkulturflaschen einges¨aten Zellen weiter im Brutschrank bei 37C bebr¨utet und nach Bedarf passagiert. Nach dem Auftreten einer virusbeding-ten Zellzerst¨orung von 50-70% der Zellen wurde die Zellkultur einem Gefriertauzyklus (-80C/20C) unterworfen und anschließend wie in 3.2.1 beschrieben weiterbehandelt.

3.2.3.3. Nachweis von Antik¨orpern gegen das Hundestaupevirus aus Seren von Tieren mit Staupeverdacht

Von den Hunden mit Staupeverdacht, von denen Blutproben zur Virusisolierung ver-wendet wurden, lag auch jeweils eine Serumprobe vor. Diese wurden mit dem

”

Neu-tralizing-Peroxidase-linked Antibody Assay“ (NPLA) (siehe 3.4.1.2) auf neutralisierende Antik¨orper gegen CDV untersucht.