Diagnostik

F¨ur die Diagnose einer Staupeerkrankung k¨onnen der direkte Virusnachweis oder der Nachweis virusspezifischer Antik¨orper verwendet werden (indirekter Erregernachweis).

2.1.7.1. Methoden des Antik¨orpernachweises

F¨ur die Diagnose einer akuten Staupeerkrankung wird eine gepaarte Serumprobe im Abstand von 3-4 Wochen ben¨otigt. Dabei spricht ein Anstieg von 4 Titerstufen des Antik¨orpertiters f¨ur eine akute Erkrankung. Eine andere M¨oglichkeit, eine akute Er-krankung mit Hilfe von Antik¨orpern zu bestimmen, ist die Bestimmung der Antik¨orper der IgM-Klasse. Diese lassen sich nach einer Infektion nur f¨ur ca. 2 Monate nach-weisen und erlauben so die Diagnose einer k¨urzlich erfolgten Infektion oder Impfung (Blixenkrone-Møller et al., 1991). Auch zur ¨Uberpr¨ufung eines Impferfolges eignet sich der Antik¨orpernachweis. Es k¨onnen verschiedene Techniken verwendet werden.

Virusneutralisationstest (VNT) Mit dem Virusneutralisationstest (VNT) lassen sich die das Virus neutralisierenden Antik¨orper bestimmen. Die neutralisierenden An-tik¨orper bewirken eine Inaktivierung des Virus und haben so eine protektive Wirkung bei einer Infektion. Dabei werden Neutralisationstiter von gr¨oßer als 100 als protektiv angesehen. Titer zwischen 20 und 100 gelten als Grenzbereich (Appel, 1987). Nach an-deren Angaben (Olson et al., 1988; Gillespie et al., 1958) werden Titer von gr¨oßer 16 bzw. gr¨oßer 30 als sch¨utzend angesehen.

Die Durchf¨uhrung des VNT erfolgte urspr¨unglich als Chorioallantois-Membran-Test im embryonierten H¨uhnerei, wobei die Reduktion der Plaques auf der

Chorioallantois-Membran bewertet wurde. Diese Methode ist allerdings sehr zeit- und arbeitsaufwendig.

Daher wurde der Neutralisationstest auch in verschiedenen Zellkulturen durchgef¨uhrt (Rockborn, 1958a). Appel und Robson (1973) entwickelten die Durchf¨uhrung des VNT im Mikrotitersystem. Die Auswertung erfolgt ¨uber die mikroskopische Untersu-chung auf morbillivirusspezifische zytopathische Effekte (CPE) in Verozellen. Zur Ver-einfachung der Auswertung k¨onnen die virusinfizierten Zellen auch mittels markierter Antik¨orper dargestellt werden. Hierzu eignen sich Fluoreszenz-markierte Antik¨orper so-wie Peroxidase-gekoppelte Antik¨orper.

Zaghawa (1990) verwendetete f¨ur die Anf¨arbung von virushaltigen Zellen Per-oxidase-gekoppeltes anti-CDV-Hyperimmunserum. Dieser als

” Neutralizing-peroxidase-linked-assay“ (NPLA) bezeichnete Test verk¨urzt außerdem die Zeit bis zur Auswertung gegen¨uber der Auswertung ¨uber CPE von einer Woche auf drei Tage.

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Mit dem ELISA werden im Ge-gensatz zum VNT nicht nur die virusneutralisierenden Antik¨orper bestimmt, sondern alle virusspezifischen Antik¨orper. Es k¨onnen unterschiedliche ELISA-Arten zur Bestim-mung von Antik¨orpertitern genutzt werden. Die einfachste M¨oglichkeit ist der direkte ELISA, bei dem das Antigen an die verwendete Mikrotiterplatte gekoppelt wird (Noon et al., 1980; Potgieter und Ajidagba, 1989). Auch verschiedene Sandwich-ELISA k¨onnen zur Bestimmung verwendet werden. Beim einfachen Sandwich-ELISA wird ein Anti-CDV-Antik¨orper an die Mikrotiterplatte gekoppelt, an den dann das Antigen ge-bunden wird (Gemma et al., 1996). Beim Protein A-Sandwich-ELISA wird Protein A an die Mikrotiterplatte gekoppelt. An das Protein A wird der Anti-CDV-Antik¨orper gebunden und weiter wie beim einfachen Sandwich ELISA verfahren. Die Sensitivit¨at ist beim Protein A-Sandwich-ELISA etwa 100-mal besser als beim direkten ELISA (Potgieter und Ajidagba, 1989). Bei einem weiteren Sandwich-ELISA wird rekom-binant exprimiertes CDV N-Protein ¨uber einen CDV N-Protein spezifischen mAk an die Mikrotiterplatte gebunden. Dieser ELISA zeigte eine hohe Sensitivit¨at und Spezi-fit¨at (von Messling et al., 1999). Durch die Wahl des sekund¨aren Antik¨orpers ist es beim ELISA m¨oglich, zwischen Antik¨orpern verschiedener Immunglobulinklassen (IgG, IgM) zu unterscheiden (Kinget al., 1993). Da bei der Unterscheidung von IgG und IgM-Antik¨orpern die Bestimmung von IgM z.T. falsch negativ sein kann, weil IgM-Antik¨orper durch IgG Antik¨orper verdr¨angt werden, entwickelten Blixenkrone-Møller et al.

(1991) einen Sandwich-ELISA zur Bestimmung von IgM-Antik¨orpern. Es werden dazu Anti-IgM-Antik¨orper an die Mikrotiterplatte gekoppelt, die die in der Probe enthaltenen IgM-Antik¨orper herausfangen.

Immunfluoreszenz-Test Die Bestimmung von Antik¨orpern erfolgt mit dem indirek-ten Immunfluoreszenz-Test. Als Antigen finden virusinfizierte Zellen Verwendung. Als sekund¨are Antik¨orper werden Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-markierte Anti-Hund-Ig

AK verwendet, die an die prim¨aren virusspezifischen Antik¨orper aus dem Serum binden.

Durch die Wahl des sekund¨aren Antik¨orpers ist auch die Unterscheidung der verschie-denen Immunglobulinklassen m¨oglich (K¨olbl und Schuller, 1988). Mit dem Immun-fluoreszenztest werden alle virusspezifischen Antik¨orper nachgewiesen.

2.1.7.2. Methoden des Antigennachweises

Nachweis von Virusantigen in Geweben Der postmortale Nachweis von CDV-Antigen ist relativ leicht zu erreichen. Ausgangsmaterial sind Abklatschpr¨aparate von Lymphknoten, Blasenepithel oder Kleinhirn, die mit CDV-spezifischen FITC-markierten Antik¨orpern angef¨arbt werden. Auch formalin-fixierte Gewebeschnitte k¨onnen auf diese Weise angef¨arbt werden. Eine weitere M¨oglichkeit zur Darstellung von CDV-Antigen in Geweben ist die Anf¨arbung mittels der Immunperoxidase-Technik, bei der mit Peroxida-se gekoppelte CDV-spezifische Antik¨orper verwendet werden (Ducatelleet al., 1980).

Weiterhin ist der histopathologische Nachweis von Einschlußk¨orperchen in Gehirnzellen, Lunge und Blasenepithel als Methode geeignet (Appel, 1987).

Bei lebenden Tieren ist der Nachweis schwieriger. Hier kann Virusantigen in Ab-klatschpr¨aparaten von der Konjuntiva und der Vaginalschleimhaut oder in Zellen der Cerebro-Spinal-Fl¨ussigkeit und Buffy coat-Zellen mittels Immunfluoreszenz nachgewie-sen werden (Appel, 1969). Allerdings fallen diese Nachweise im Falle einer subakuten Erkrankung oder einer sp¨aten Enzephalitis, wenn die Serumantik¨orpertiter hoch sind, h¨aufig negativ aus (Appel und Baker, 1991).

Isolierung von Virus in Zellkultur Der Nachweis von Virus kann auch durch die Isolierung des Virus in der Zellkultur erfolgen. Die Isolierung kann in prim¨aren oder in permanenten Zellinien erfolgen. Als prim¨are Zellinie werden prim¨are Hundehirnzellen (DBCC=Dog brain cell cultures) verwendet (Hamburgeret al., 1991). Das Virus l¨aßt sich in dieser Zellinie vermehren und beh¨alt seine Virulenz f¨ur den Hund.

Als permanente Zellinie kommen verschiedene Linien in Betracht. Die am h¨ aufig-sten verwendete Zellart sind Verozellen (African Green Monkey Kidney Cells). An diese Zellinie adaptiert sich virulentes Virus allerdings nur langsam, so daß h¨aufig die Isolie-rung mißlingt. Eine M¨oglichkeit, die Ergebnisse zu verbessern, ist die Kokultivierung von Hundelymphozyten und Verozellen. Dazu werden die Lymphozyten des erkrankten Hundes aus seinem Blut isoliert und zusammen mit Lymphozyten eines gesunden Tieres mit den Verozellen kokultiviert (Appelet al., 1992). Eine weitere zur Anwendung kom-mende Zellinie ist die Linie B95a (Kai et al., 1993). Die Adaptierung des CDV an diese Zellinie gelingt h¨aufig schneller als an Verozellen. Der Nachweis des isolierten Virus in der Zellkultur kann ¨uber den virusspezifischen zytopathischen Effekt (Synzytienbildung) erfolgen. F¨ur einen immunologischen Nachweis des isolierten Virus in der Zellkultur kann der indirekte Immunfluoreszenztest oder der Peroxidase-linked-assay (Zaghawa, 1990)

verwendet werden.

2.1.7.3. Methoden des Nukleins¨aurenachweises

Eine sensitive und spezifische Methode zum Nachweis von CDV-Nukleins¨auren ist die RT-PCR. Mit ihr l¨aßt sich virale RNA sowohl in infizierten Geweben als auch in Blut und Liquor nachweisen (Haas et al., 1990;Moritz et al., 1998).

Auch am lebenden Tier ist der Nukleins¨aurenachweis mittels RT-PCR aus Blut und Liquor ist m¨oglich.