3. Material und Methoden 23
4.2. Gewinnung und Charakterisierung der monoklonalen Antik¨ orper
Es wurden von einer Maus die Splenozyten zur Fusion gewonnen. Beim ersten Screening der gewachsenen Zellkolonien aus der Fusion zeigten ca. 10% der Kolonien eine spezifische Reaktion mit Antigenen des Virusisolats 2544/Han95. Alle dieser positiv reagierenden Klone wurden vermehrt und im Laufe der Vermehrung und Reklonierung wiederholt auf die Produktion von Antik¨orpern untersucht. Nach drei Reklonierungen blieb schließlich ein stabiler antik¨orperproduzierender Zellklon ¨ubrig.
Des weiteren wurden der mAk CD/Px4 und die neun von Frau V. v. Messling (siehe Tab. 3.1) etablierten mAk weiter charakterisiert.
4.2.1. Proteinspezifit¨at der mAk
Die Proteinspezifit¨at der mAk CDCT-1, CDCT-2, CDRCT-1, CDRCT-2, CDRCT-4, CDRCT-5, CDRCT-8, CDRCT-10, CDRCT-11 war durch die Reaktion mit Insekten-zellen, die mit rekombinanten Baculoviren infiziert waren, bestimmt worden (von Mes-sling, 1998). Dabei erwiesen sich acht der mAk als N-Protein spezifisch und ein mAk (CDRCT-1) als H-Protein spezifisch. Der mAk CD/Px4 war als P-Protein spezifisch charakterisiert worden (Harder et al., 1991;Martens et al., 1995).
4.2.1.1. Western-Blot
Zur Bestimmung der Proteinspezifit¨at im Western-Blot wurden die Proteinbestandteile einer Virusantigenpr¨aparation des CDV-Isolats 2544/Han95 in der SDS-Gelelektropho-rese untersucht (siehe 3.3.2.1.2). Alle mAk zeigten eine Reaktion mit Proteinbanden.
Dabei zeigten alle verwendeten mAk bis auf den mAk CDRCT 1 eine Reaktion mit einer oder mehreren Banden. Die mAk CD/Px4, CDRCT 2, CDRCT 4, CDRCT 5, CDRCT 8, CDRCT 11, CDCT 1, CDCT 2 und 8F2 zeigten dabei ein ¨ahnliches Banden-muster (siehe Abb. 4.1 und 4.2). Sie alle f¨arbten eine kr¨aftige Doppelbande bei einem Molekulargewicht von ca. Mr = 60.000, wobei die beiden Banden einen Abstand von etwa Mr = 5.000 aufwiesen. Eine zweite Doppelbande wurde von diesen mAk bei ei-nem Molekulargewicht von etwa Mr = 30.000 angef¨arbt. Desweiteren war eine dritte Doppelbande im Bereich eines Molekulargewichts von Mr = 20.000 zu erkennen. Au-ßerdem zeigten sich einige schwache Banden bei einem h¨oheren Molekulargewicht. Der mAk CDRCT 1 zeigte eine verwaschene F¨arbung der gesamten Laufstrecke der Anti-genpr¨aparation. Bei der Verwendung des mAk CDRCT 10 ließ sich keine Reaktion mit einer Bande im Western-Blot erkennen.
4.3. Charakterisierung der verschiedenen CDV-Isolate mittels polyklonaler und monoklonaler Antik¨ orper
4.3.1. Charakterisierung der CDV-Isolate mit polyklonalen Seren
Zur Charakterisierung der vorliegenden CDV-Isolate wurden verschiedene Versuche zum Reaktionsverhalten polyklonaler Hundeseren mit diesen Virusisolaten durchgef¨uhrt. Da-zu wurde ihre Reaktion mit den Virusisolaten im Kreuzneutralisationstest untersucht.
4.3.1.1. Kreuzneutralisationstest
Es wurden die neutralisierenden Eigenschaften verschiedener Seren gegen¨uber verschie-denen Virusisolaten ¨uberpr¨uft. Die Seren stammten aus der Routinediagnostik der Tier-klinik der Universit¨at Hohenheim. Der Neutralisationstest wurde wie in Abschnitt 3.4.1.3 beschrieben durchgef¨uhrt, wobei je ein Serum mit verschiedenen Virusisolaten zur Re-aktion kam. Als Virusisolate kamen die beiden Impfst¨amme Rockborn und Onder-stepoort, sowie die Feldisolate 2544/Han95, 4513/Han95, 5804/Han89, 404/Han94, AA7/96, AA52/96, 1493/Han89 zum Einsatz. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.2 darge-stellt.
Alle Seren zeigten entweder neutralisierende Eigenschaften gegen¨uber allen verwen-deten Virusisolaten oder gegen¨uber keinem der Isolate. Dabei unterschieden sich die Neutralisationstiter eines Serums gegen¨uber verschiedenen Isolate um bis zu 3 Titerstu-fen. So zeigte das Serum S1 einen Titer von 340 gegen¨uber dem Isolat 1493/Han89 und einen Titer von 3600 gegen¨uber dem Stamm Rockborn. Die Mittelwerte der Neutralisa-tionstiter aller Seren gegen¨uber einem Virusisolat unterschieden sich dagegen um nicht mehr als eine halbe Titerstufe. Die ¨Uberpr¨ufung der statistischen Relevanz der Unter-schiede wurde mit dem Wilcoxon-Test f¨ur Paardifferenzen durchgef¨uhrt. Als Referenz-stamm wurde der ImpfReferenz-stamm Rockborn verwendet, mit dem alle anderen Virusisolate verglichen wurden. Von den acht weiteren Virusisolaten zeigten zwei (Onderstepoort und CDV 404/Han94) einen statistisch signifikanten Unterschied in den Neutralisati-onstitern gegen¨uber Rockborn (p≤0,05). Die Neutralisationstiter der Seren gegen¨uber diesen beiden Virusisolaten lagen im Mittel etwa eine halbe Titerstufe niedriger als die Neutralisationstiter gegen¨uber dem Stamm Rockborn. Es ließ sich dagegen kein gene-reller Unterschied zwischen den Neutralisationstitern gegen¨uber Impfst¨ammen und den Neutralisationstitern gegen¨uber Feldisolaten feststellen.
Tabelle 4.2.: Kreuzneutralisationstest: Neutralisationstiter von Hundeseren gegen¨uber verschiedenen CDV-Virusisolaten
Serum CDV-Stamm
Rockb. 404 2544 4513 4805 AA 52 Onderste. 1493 AA 7
S1 3600 3040 3040 3040 2560 1800 760 340 2560
S2 1280 900 900 1280 900 320 380 450 1280
S4 3600 3600 2560 3600 3040 2150 3600 2560 3040 S22 2560 1500 2560 1800 3040 1800 1500 1500 1500 S23 2560 1180 2560 1800 1800 1280 1074 1074 760 S24 1800 2560 2150 1280 2560 1280 1074 2560 1074
S6 1500 1180 1800 1800 2150 760 640 2560 1074
S27 760 450 760 450 540 380 226 450 320
S201 320 225 380 380 380 320 450 270 320
S202 47 56 56 80 33 33 80 70 40
S203 1280 1280 780 1074 900 900 1280 890 1800
S204 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10
S C 20 ¡10 ¡10 20 12 ¡10 ¡10 12 16 12
S C 21 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10 ¡10 12
S C 22 450 400 190 270 113 134 80 134 190
S102 1500 1500 1500 1800 1800 1800
S103 12 ¡10 14 14 12 16
S105 535 535 1280 1280 1500 1280
S107 135 94 70 190 270 134
S108 190 160 135 380 225 160
S112 1070 380 900 1500 1500 1074
S113 113 40 70 270 190 224
S114 20 14 14 50 47 28
4.3.2. Charakterisierung der CDV-Isolate mit monoklonalen Antik¨orpern 4.3.2.1. Reaktion der mAk mit verschiedenen CDV-Virusisolaten im
Immunfluoreszenztest
Unterschiede in der Bindungsf¨ahigkeit der mAk an verschiedene CDV-Isolate wurden im indirekten Immunfluoreszenztest untersucht. Die Reaktionen der einzelnen mAk mit den verschiedenen Virusisolaten sind in Tabelle 4.3 dargestellt. Die meisten mAk reagierten mit allen Virusisolaten. Dies waren die mAk CD/Px4, CDRCT 1, CDRCT 2, CDRCT 4, CDRCT 5, CDCT 1 und CDCT 2. Die mAk 8F2, CDRCT 8, CDRCT 10 und CDRCT 11 zeigten dagegen nur mit einem Teil der St¨amme Reaktionen. Alle mAk reagierten aber mit mindestens 6 der 9 untersuchten St¨amme eindeutig. Es ließ sich kein Unterschied in der Reaktion der mAk zwischen Impfvirusst¨ammen und Feldvirusisolaten erkennen.
Tabelle 4.3.: Reaktion der mAk mit verschiedenen Virusisolaten im IFT
Rockborn Onderstepoort 2544 4805 4513 404 AA7 AA52 B1
CD/Px4 + + + + + + + + +
3E10 + + + + + + + + +
8F2 + ? + + - + ? + +
CDRCT1 + + + + + + + + +
CDRCT2 + + + + + + + + +
CDRCT4 + + + + + + + + +
CDRCT5 + + + + + + + + +
CDRCT8 ? + + + + - + + +
CDRCT10 + + + + ? + + + +
CDRCT11 ? + + + - - + + +
CDCT1 + + + + + + + + +
CDCT2 + + + + + + + + +
4.3.2.2. Darstellung der Virusproteine der verschiedenen CDV-Isolate im Western-Blot
Mit den beiden mAk CDRCT 4 (N-Protein spezifisch) und CD/Px4 (P-Protein spezi-fisch) wurde die Charakterisierung der CDV-Virusisolate im Western-Blot durchgef¨uhrt.
Es wurden Antigenpr¨aparationen der Virusisolate 2544/Han95, 4513/Han95, 5804/Han89, 404/Han94, Rockborn, Onderstepoort, AA7/96, AA52/96 und B1/97 untersucht (siehe 3.3.2.1.1). Es wurden jeweils zwei Antigenpr¨aparationen eines Virusisolats verwendet.
Die weitere Bearbeitung wurde wie in Abschnitt 3.4.2.2 beschrieben durchgef¨uhrt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4.1 und 4.2 dargestellt. Wie sich dort erkennen l¨aßt, zeigten sich zwischen den jeweils zwei Antigenpr¨aparationen eines Virusisolats keine Unterschie-de im angef¨arbten Bandenmuster. Alle dargestellten Banden wiesen jeweils bei beiden Pr¨aparationen das gleiche Molekulargewicht auf. Bei einigen Pr¨aparationen unterschied sich allerdings die Proteinmenge der Pr¨aparationen, so daß es zu einer unterschiedlich starken Auspr¨agung einzelner Banden kam. Dies f¨uhrte dazu, daß einzelne Banden z. T.
nur noch andeutungsweise zu erkennen waren (siehe Abb. 4.2, weißer Pfeil). Es gab also zwischen zwei Antigenpr¨aparationen zwar quantitative Unterschiede, aber keine quali-tativen. Bei Pr¨aparationen, die von Virusvermehrungen eines Tages hergestellt worden waren (Abb. 4.1, CDV 4513), zeigten sich geringere Unterschiede in der Proteinmen-ge zwischen zwei Pr¨aparationen, als bei Pr¨aparationen, die von Virusvermehrungen an unterschiedlichen Tagen stammten (Abb. 4.2, CDV Rockborn).
Bei der Betrachtung der Proteinbanden im Vergleich der Virusisolate ließen sich Un-terschiede zwischen den CDV-Impfvirust¨ammen und den Feldvirusisolaten erkennen.
Eines der Feldisolate zeigte allerdings das gleiche Verhalten wie die beiden Impfvi-russt¨amme Rockborn und Onderstepoort. Bei der Verwendung des gegen das N-Protein gerichteten Antik¨orpers CDRCT 4 wurde bei den Impfst¨ammen Onderstepoort und Rockborn eine Virusbande im Bereich eines Molekulargewichts von etwa Mr = 75.000
Abbildung 4.1.: Western-Blot mit den Virusisolaten CDV 2544/Han95, Onderstepoort, Rockborn, CDV 4513/Han95, CDV 5804/Han89, CDV AA7/96: verwendeter mAk CDRCT4, verwendete Polyacrylamidkonzentration: 10%
Abbildung 4.2.: Western-Blot mit den Virusisolaten CDV 2544/Han95, Onderstepoort, Rockborn, CDV 4513/Han95, CDV 5804/Han89, CDV AA7/96, CDV B1/97: verwen-deter mAk CD/Px4, verwendete Polyacrylamidkonzentration: 10%
angef¨arbt (Abb 4.1, schwarzer Pfeil), die bei den Feldisolaten CDV 2544/Han95, CDV 5804/Han89, CDV 404/Han94, CDV AA7/96 und CDV AA52/96 nicht auftrat. Nur bei dem Feldisolat B1/97 ließ sich die gleiche Bande nachweisen (nicht abgebildet). Eine Bande bei etwa Mr = 60.000, die bei allen Feldisolaten bis auf B1/97 sehr ausgepr¨agt vorhanden war, war dagegen bei den beiden Impfst¨ammen nur schwach vorhanden. Eine Doppel-Bande bei ca.Mr = 30.000 war dagegen bei allen CDV-Isolaten etwa gleich stark ausgepr¨agt. Bei den Impfst¨ammen fehlte daf¨ur wiederum eine Doppelbande bei einem Molekulargewicht von etwaMr = 20.000, die bei allen Feldisolaten außer B1/97 vorhan-den war. Bei allen Virusisolaten zeigten sich zus¨atzlich schwache Banden bei h¨oheren Molekulargewichten. Diese lagen im Bereich vonMr = 110.000 bis Mr= 120.000.
Bei der Verwendung des gegen das P-Protein gerichteten Antik¨orpers CD/Px4 zeigte sich ein sehr ¨ahnliches Bild (siehe Abbildung 4.2). Auch hier zeigte sich eine Bande bei einem Molekulargewicht vonMr = 75.000 bei den Impfst¨ammen, die bei den Feldisolaten , außer bei B1/97, nicht auftrat. Auch die Bande beiMr= 60.000 zeigte ein schw¨acheres Auftreten bei den Impfst¨ammen als bei den Feldisolaten. Auch hier trat die Bande bei etwa Mr = 30.000 wiederum bei allen Isolaten etwa gleich stark auf. Zus¨atzlich trat allerdings noch eine Bande bei Mr = 25.000 auf, die bei den Impfst¨ammen wesentlich st¨arker ausgepr¨agt war als bei den Feldisolaten.