Etablierung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen ein neues
Membranmolekül als Zielprotein für immunmodulatorische Therapieansätze
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.) im Fach Pharmazie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Apothekerin Angelika Schweizer geboren am 13. Juni 1973 in Stuttgart
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin Prof. Dr. Jürgen Mlynek
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. Michael Linscheid
Gutachter: 1. Prof. Dr. Hans-Hubert Bordiert 2. Prof. Dr. Hans-Dieter Volk 3. Prof. Dr. Matthias F. Melzig
Tag der mündlichen Prüfung: 28.Oktober 2002
0 VERZEICHNISSE 6 0.1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 6
1 EINLEITUNG 8
1.1 BEDEUTUNG DER T-ZELLEN IM PROZESS DER TRANSPLANTATABSTORUNG 10 1.1.1 CD4*- und CDS*-T-Zellen 10 1.1.2 Die T-Zellaktivierung 12 1.1.2.1 Interaktion von T-Zellrezeptor und MHC-Proteinen -Signal 1 der T-Zellaktivierung 12 1.1.2.2 Wechselwirkung Costimulatorischer Moleküle - Signal 2 der T-Zellaktivierung 13 1.1.3 T-Zell-Anergie 14 1.1.4 Alloantigenerkennung durch T-Zellen 14 1.2 ANTIKÖRPER IN DER IMMUNSUPPRESSIVEN THERAPIE 15 1.2.1 Erste therapeutische Anwendungen von Antikörpern 15 1.2.2 Struktur eines IgG Antikörpermoleküls 16 1.2.3 Herstellung von monoklonalen Antikörpern (mAk) 17 1.2.4 Monoklonale Antikörper In Therapie und Diagnostik 19 1.3 T I R C 7 ALS POTENTIELLES ZLELANTIGEN FÜR NEUE IMMUNMODULATORISCHE
THERAPIEANSÄTZE 22 1.3.1 TIRC7 (Tcell immune response cDNA 7) 22 1.3.2 Polyklonale Antikörper gegen TIRC7 23 1.3.2.1 Polyklonale Antikörper gegen TIRC7 inhibieren die Proliferation allogen stimulierter
PBMC und unterdrücken selektiv die TH1-spezifische Cytokinexpression in vitro 24 1.3.2.2 Polyklonale Antikörper gegen TIRC7 verlängern siqmHfiaptBiSHjberlebensrate
nierentransplantierter Ratten in vivo V N S ^ r r l ä r ^ S ^ 2 4
1.4 AUFGABENSTELLUNG J&!Ä^SJfX& 24
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 GERÄTELISTE
2.2 REAGENZIEN, KITS UND VERBRAUCHSMATERIALIEN ^f^ffZ..^..^, 25 2.3 VERWENDETE ZELLLINIEN ':.'.). 28 2.4 ZUR IMMUNISIERUNG VERWENDETE PEPTIDE 28
t 2.5 METHODEN ZUR ETABLIERUNG MONOKLONALER ANTIKÖRPER (MAK) 29 2.5.1 Immunisierungsschema 29 2.5.2 Mycoplasmentest 30 2.5.3 Zellfusion 30 2.5.4 Screening derHybridome (Hybridoma-ELISA) 32 2.5.5 Klonierung der Hybridome 33 2.5.6 Kryokonservierung und Auftauen von Hybridomen 33 2.5.7 Produktion und Reinigung monoklonaler Antikörper 34 2.5.8 Isotypencharakterisierung 34 2.5.9 Quantitative IgG-Bestimmung 34
2
2.6 METHODEN ZUR CHARAKTERISIERUNG MONOKLONALER ANTIKÖRPER 35 2.6.1 Biochemische Charakterisierung 35 2.6.1.1 Gewinnung peripherer mononuklearer Zellen (PBMC) 35 2.6.1.2 ELISA auf peripheren mononukleären Zellen (PBMC) 36 2.6.1.3 Immunfluoreszenztest 37 2.6.2 Funktionelle Charakterisierung 38 2.6.2.1 Kultur und Stimulationsbedingungen: 38 2.6.2.1.1 Kokulturvon humanen PBMC mit monoklonalen Antikörpern 38 2.6.2.1.2 Kokultur von humanen PBMC mit peptidblockierten monoklonalen Antikörpern 38 2.6.2.1.3 Kokulturvon humanen PBMC mit monoklonalen Antikörpern in Kombination mit
CyclosporinA, Rapamycin und FK506 39 2.6.2.1.4 Kokulturvon humanen PBMC mit Fragmenten monoklonaler Antikörper 39 2.6.2.2 Proliferationstest 41 2.6.2.2.1 3H-Thymidin-Einbau 4 1 2.6.2.2.2 BrdU-Einbau 4 1 2.6.2.3 Proliferationstests mit T-Zellsubsets 42 2.6.2.4 Cytokinbestimmung mittels ELISA 43 2.7 QUANTITATIVE UND STATISTISCHE AUSWERTUNG 45 2.7.1 Quantitative Auswertung durch einfache lineare Regression 45 2.7.2 Berechnung und Darstellung von Mittelwerten und Standardabweichungen 45 2.7.3 Berechnung der IDm (Hemmdosis auf 50% im Vergleich zur entsprechend eingesetzten
Kontrolle) •..:.: 46 2.7.4 Statistische Prüfung von Mittelwerten unter Einsatz des t-Test 46
3 ERGEBNISSE 48
3.1 ETABLIERUNG UND SELEKTION SPEZIFISCHER MONOKLONALER ANTIKÖRPER 48 3.1.1 Immunisierungen und Fusionen 48 3.1.2 Etablierung der Hybridome 48 3.1.3 Selektion der Hybridome 49 3.1.3.1 Isotypenbestimmung 49 3.13.2 Wachstums- und Produktionseigenschaften der IgG-produzierenden Hybridome 50 3.1.3.3 Reinigung der monoklonalen Antikörper 50 3.1.3.4 Biochemische und funktionelle Analyse der mAk 50 3.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER SELEKTIERTEN MONOKLONALEN
ANTIKÖRPER (MAK) 52 3.2.1 Peptid-EUSA 52 3.2.2 PBMC-ELISA 55 3.2.3 Immunfluoreszenztest 57
3.3 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER ETABLIERTEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPER 59 3.3.1 Proliferationstest 59 3.3.1.1 Optimierung des Protokolls für den Einsatz monoklonaler Antikörper
im Proliferationstest 60 3.3.1.2 Ergebnisse der Proliferationstests mit 3H-Thymidineinbau 61 3.3.1.3 Ergebnisse der Proliferationstests mit BrdU-Einbau 62 3.3.1.4 Proliferationstest nach Blockade der antigenbindenden Antikörperregionen 64 3.3.1.5 Proliferationstest mit Antikörperfragmenten 66 3.3.1.6 Proliferationstests mit Fragmenten monoklonaler TIRC7-Antikörper 67 3.3.1.7 Proliferationstest in Kombination mit Immunsuppressiva 69 3.3.1.7.1 Cyclosporin A (CyA) 70 3.3.1.7.2 Tacrolimus (FK506) 73 3.3.1.7.3 Sirolimus (Rapamycin) 76 3.3.1.8 T-Zell-Subsets im Proliferationstest 79 3.3.2 Cytokinbestimmung 82 3.3.2.1 Interferon-? (IFNy) 82 3.3.2.2 lnterleukin-2 (IL-2) 84 3.3.2.3 Tumor-Nekrose-Faktor a (TNFa) 86 3.3.2.4 lnterleukin-1ß(IL-1ß) 88 3.3.2.5 lnterleukin-12 (IL-12) 89 3.3.2.6 lnterleukin-4 (IL-4) 90 3.3.2.7 lnterleukin-6 (IL-6) 92 3.3.2.8 lnterleukin-10(IL-10) 93 3.3.2.9 Zusammenfassung der Ergebnisse der Cytokinbestimmungen 96
4 DISKUSSION 97 4.1 PROTEINERKENNUNG MONOKLONALER TIRC7-ANTIKÖRPER 97 4.2 INHIBIERUNG DER PROLIFERATIONSRATE MITOGEN STIMULIERTER PBMC DURCH T I R C 7 M A K 98 4.3 ANGRIFFSPUNKTE EINER SPEZIFISCHEN, IMMUNMODULATORISCHEN THERAPIE 99 4.3.1 T-Zellsubsets 99 4.3.2 Costimulatorische Moleküle 102 4G.3 Cytokine 104 4.4 T I R C 7 M A K IN KOMBINATION MIT XENOBIOTISCHEN IMMUNSUPPRESSIVA 109 4.5 AUSBLICK 111
5 ZUSAMMENFASSUNG 112
6 SUMMARY 114
7 LITERATURVERZEICHNIS 116
8 ERKLÄRUNG 132
9 DANKSAGUNG 133
10 LEBENSLAUF 134
11 ANHANG 135
