Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Virologie
Außenstelle für Epidemiologie
Charakterisierung aktueller PRRSV Isolate aus verschiedenen Regionen in Deutschland
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Kerstin Fiebig geb. Habekost (Bad Gandersheim)
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Irene Greiser Wilke PD Dr. Elisabeth grosse Beilage
1. Gutachterin : Apl. Prof. Dr. Irene Greiser Wilke
2. Gutachter : Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna
Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2008
Das Promotionsprojekt wurde durch Intervet International BV, Boxmeer, Niederlande unterstützt
Meiner kleinen und großen Familie in Dankbarkeit!
„Erfahrung vermehrt unsere Weisheit, verringert aber nicht unsere Torheiten“
Josh Billings
Veröffentlichungen und Tagungsbeiträge
Teile dieser Arbeit wurden vorab veröffentlicht:
FIEBIG, K., GREISER-WILKE, I., GROSSE BEILAGE, E., DREXLER, C. (2006):
Characterization of current Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) field isolates in Germany
In: 7th European Society of Veterinary Virology (ESVV), Lisbon, Portugal, September 24-27, 2006
FIEBIG, K., GREISER-WILKE, I., GROSSE BEILAGE, E., DREXLER, C. (2006):
Aktuelle PRRSV Feldisolate in Deutschland
Intervet-Fortbildungsveranstaltung, Vortrag im Rahmen des Themenkreises: Emerging Diseases, Schweinfurt, Deutschland, 18. September 2006
FIEBIG, K., GREISER-WILKE, I., GROSSE BEILAGE, E., DREXLER, C. (2006):
Charakterisierung aktueller PRRSV Feldisolate aus verschiedenen Regionen Deutschlands In: BPT-Kongress, Nürnberg, Deutschland; Vortrag im Rahmen des Themenkreises: Impfen wir zu viel oder zu wenig?, November 9-12, 2006
FIEBIG, K., GREISER-WILKE, I., GROSSE BEILAGE, E., DREXLER, C. (2007):
Occurrence of NA and EU genotype PRRSV field isolates in a pig dense region of North Western Germany between 2004 and 2006
In: Emerging and Re-emerging pig diseases, Krakow, Polen, June 24-27, 2007, Poster
FIEBIG, K., GREISER-WILKE, I., GROSSE BEILAGE, E., DREXLER, C. (2007):
Molecular Epidemiology of German and European Porcine reproductive and respiratory syndrome virus
In: International PRRS Symposium, Chicago, USA, November, 2007, Poster
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG ... 1
2. LITERATUR ... 3
2.1 PORCINE REPRODUCTIVE UND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS... 3
2.1.1 Geschichte ... 3
2.2 CHARAKTERISIERUNG DES PRRSV ... 4
2.2.1 Taxonomie und Morphologie... 4
2.2.2 Genomorganisation von PRRSV... 5
2.2.3 Virale Proteine... 7
2.3 Genetische und antigene Variabilität ... 9
2.3.1 Replikationszyklus der Arteriviridae ... 10
2.3.2 Immunologie ... 11
2.3.3 Impfung ... 13
2.3.4 Klinische Symptome ... 16
2.3.5 Pathologie... 17
2.3.6 Labordiagnostischer Nachweis ... 17
2.3.7 Direkter und indirekter Erregernachweis ... 18
2.4 EPIDEMIOLOGIE... 19
2.4.1 Weltweite Verbreitung ... 19
2.4.2 Erregerübertragung und Virusausscheidung ... 21
2.4.3 Persistente Infektion... 22
2.5 PHYLOGENETISCHE ANALYSEN ALS HILFSMITTEL DER EPIDEMIOLOGIE... 22
2.5.1 Darstellung phylogenetischer Analysen... 23
2.5.2 Für phylogenetischen Analysen verwendete Algorithmen ... 25
2.5.3 Überprüfung der Robustheit von Bäumen (Bootstrap-Werte) ... 25
2.6 GENETISCHE TYPISIERUNG VON PRRSV ... 26
2.6.1 Molekulare Epidemiologie... 28
3.1 MATERIAL... 31
3.1.1 Herkunft des Probenmaterials ... 31
3.1.2 Untersuchungsmaterial... 32
3.1.3 Virusisolate... 34
3.1.4 Herdenspezifische Daten und statistische Auswertung... 34
3.1.5 Zellkultur... 35
3.2 METHODEN... 37
3.2.1 BLUTENTNAHMETECHNIK... 37
3.2.2 KLASSISCHE VIROLOGISCHE METHODEN... 37
3.2.2.1 Passagierung von Marc-145-Zellen ... 37
3.2.2.2 Kultivierung der porzinen Alveolarmakrophagen... 38
3.2.2.3 Virustitration ... 38
3.2.2.4 Vorbereitung von virushaltigem Organmaterial für die Virusanzucht und den Virusnachweis ... 39
3.2.2.5 Virusvermehrung... 40
3.2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN... 42
3.2.3.1 Isolierung viraler RNA... 42
3.2.3.2 Positive und negative Kontrollen ... 44
3.2.3.3 Primer ... 44
3.2.3.4 Reverse Transkription ... 47
3.2.3.5 RT-PCR... 47
3.2.3.6 Reverse Transkriptase Kit ... 48
3.2.3.7 cDNA-Synthese (Protokoll I, SCHEIBNER et al., 2001)... 48
3.2.3.8 cDNA-Synthese aus dem PRRSV-Genom (Protokoll II, optimiert)... 49
3.2.3.9 Polymerase-Kettenreaktion ... 50
3.2.3.10 Agarosegelelektrophorese ... 52
3.2.3.11 Reinigung der PCR Produkte ... 53
3.2.3.12 Sequenzierung ... 53
3.2.4 PHYLOGENETISCHE ANALYSE MIT NUKLEOTIDSEQUENZEN... 54
3.2.5 PHYLOGENETISCHE ANALYSE... 55
3.2.6 GRAPHISCHE DARSTELLUNG DER PHYLOGENETISCHEN ANALYSEN... 56
3.2.8 ERMITTLUNG VON SEQUENZIDENTITÄTEN UND DER VARIABLEN
NUKLEOTIDPOSITIONEN... 57
4 ERGEBNISSE ... 59
4.1OPTIMIERUNG DER RT-PCR... 59
4.1.1 Reverse Transkription mit einem spezifischen RT-Primer ... 59
4.1.2 Reverse Transkription mit Random Primern und einer thermostabilen Reversen Transkriptase ... 60
4.2 KULTIVIERUNG VON PRRSVISOLATEN IN ZELLKULTUR... 61
4.3 ERHEBUNG HERDENSPEZIFISCHER DATEN... 62
4.3.1 Auswertung der herdenspezifischen Daten ... 63
4.3.2 Einfluss einer akuten PRRSV-Infektion auf die Reproduktionsleistung ... 69
4.4 VERGLEICHENDE GENETISCHE TYPISIERUNG DER PRRSV-ISOLATE AUS 35 WIEDERHOLT UNTERSUCHTEN HERDEN IM ORF5 ... 73
4.4.1 Phylogenetische Analyse der ORF5 Nukleotidsequenzen zwischen 2004 bis 2005 . ... 73
4.4.2 Phylogenetische Analyse der ORF5 Nukleotidsequenzen der Isolate aus 2006 bis 2007... 77
4.4.3 Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der GP5-Proteine... 83
4.4.4 Phylogenetische Analyse anhand der ORF7 Sequenzen... 87
4.4.5 Vergleichende phylogenetische Analyse der abgeleitenen Sequenzen des GP 5 und N-Proteins... 92
4.5 MOLEKULARE EPIDEMIOLOGIE DEUTSCHER PRRSV-ISOLATE... 95
5 DISKUSSION ... 103
5.1 AMPLIFIKATION DES ORF5–OPTIMIERUNG DER RT-PCR ... 104
5.2 VERMEHRUNG DER PRRSV-ISOLATE IN ZELLKULTUR... 105
5.3 HERDENSPEZIFISCHE DATEN... 106
5.3.1 Klinik und Impfungen ... 106
5.3.2 Reproduktionsdaten... 108
5.4 MOLEKULARE EPIDEMIOLOGIE AKTUELLER DEUTSCHER ISOLATE... 109
5.4.2 Genetische Typisierung der PRRSV-Isolate (ORF7-Sequenzen)... 113
5.5 GENETISCHE TYPISIERUNG EUROPÄISCHER ISOLATE... 114
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 119
7 LITERATURVERZEICHNIS ... 123
8 ANHANG ... 151
8.1 VIRUSISOLATE... 152
8.1.1 Herdenspezifische Virusisolate ... 152
8.1.2 PRRSV-Isolate für den Gesamtvergleich... 154
8.1.3 Impfstämme... 159
8.2 KOMMERZIELLE REAGENZIEN UND KITS... 160
8.3 ZUSAMMENSETZUNG DER VERWENDETEN MEDIEN UND REAGENZIEN... 162
8.3.1 Zellkulturmedien ... 162
8.3.2 Puffer, Zellkultur... 163
8.3.3 Sonstige Puffer und Reagenzien ... 164
8.4 GERÄTE UND GEBRAUCHSGEGENSTÄNDE... 165
8.5 VERBRAUCHSMITTEL... 166
8.6 SOFTWARE... 168
8.7 GENETISCHER CODE... 169
8.8 HERDENSPEZIFISCHE FRAGEBÖGEN... 171
8.8.1 Fragebogen I... 171
8.9 TABELLEN UND ABBILDUNGEN... 176
8.9.1 Abbildungen ... 176
8.9.2 Tabellen... 177
Abkürzungsverzeichnis
A. bidest. Aqua bidestillata
AK Aujeszkysche Krankheit
AMV Avian myoblastosis virus
AS Aminosäure
ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaare
cDNA komplementäre DNA
CSFV Classical swine fever virus
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxynukleosid-Triphosphate
dpi day’s post infection
dsDNA doppelsträngige DNA
DTT Dithiothreitol
EAV Equine arteritis virus
EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäure
ELISA Enzyme-linked immuno sorbent assay
EMEM Eagle’s Minimum Essential Medium
FKS fetales Kälberserum
g Erdanziehungskonstante
G/C Guanin / Cytosin-Gehalt
h Stunde
HCV HepatitisC virus
H2O Reinstwasser
IFT Immunfluoreszenztest
IK interne Kontrolle
LV Lelystad-Virus
log dekadischer Logarithmus
mAk monoklonaler Antikörper
MARC-145 Zelllinie der Grünen Meerkatze
MES 2-(N-morpholino)-ethansulfonsäure
min Minute
M-MLV Moloney murine leukaemia virus
M-Protein Membran-Protein
mRNA ”messenger RNA“
N/D nicht durchgeführt
N-J Neighbor-Joining
N-Protein Nukleokapsid-Protein
nt Nukleotide
NTR nicht translatierte Region
OD optische Dichte
OIE Office International des Epizooties
ORF offener Leserahmen (open reading frame)
OTU Operational Taxonomic Unit
PAM porzine alveolare Makrophagen
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
PCV-1 Porcines Circovirus Typ 1
PCV-2 Porcines Circovirus Typ 2
PDNS porzines Dermatitis und Nephropathie Syndrom
p.i. post infectionem, nach Infektion
PK porcine kidney
PRDC Porcine respiratory disease complex
PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome PRRSV Porcine reproductive and respiratory syndrome virus PRRSV-EU PRRSV europäische Stämme / Isolate
PRRSV-NA PRRSV nordamerikanische Stämme / Isolate
RT Reverse Transkriptase, reverse Transkription
sec Sekunde
TCID zellkulturinfektiöse Dosis (tissue culture infectious dose)
TBE Tris-Borat-EDTA
TiHo Tierärztliche Hochschule Hannover
TT Trächtigkeitstage
U Einheit (Unit)
u.a. unter anderem
VNT Virusneutralisationstest
WWW World Wide Web (Internet)
zpE zytopathischer Effekt
Länderabkürzungen (Quelle: ISO 3166)
BE Belgien
DE Deutschland
DK Dänemark
ES Spanien
FR Frankreich
GB Großbritannien
IT Italien
Abkürzungen deutscher Bundesländer
BW Baden Württemberg
BY Bayern
NS Niedersachsen
NW Nordrhein Westfalen
SA Sachsen Anhalt
NL Niederlande
1. Einleitung
Das Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) ist außer in Australien, Neuseeland, Schweden und der Schweiz in nahezu allen schweineproduzierenden Ländern verbreitet. Über die Verbreitung des Virus in Südamerika ist bisher nichts bekannt. Die Infektion führt zu einer der wirtschaftlich bedeutendsten Krankheiten des Schweines. Es verursacht sowohl in Zucht- als auch in Mastbetrieben große finanzielle Schäden. In Deutschland ist das Virus endemisch. Aufgrund genetischer und antigener Unterschiede werden europäische (EU) und nordamerikanische (NA) Genotypen differenziert. Darüber hinaus unterscheidet man verschiedene Subtypen.
Die genetische Variabilität des Virus in bestimmten Genomabschnitten und die relativ problematische Anzucht des Erregers stellen hohe Anforderungen an die Diagnostik und Bekämpfung, da Erregernachweis und Vakzinierungen fehlschlagen können, wenn sie für den in einem Bestand auftretenden Virusstamm nicht geeignet sind.
Als eine grundlegende Voraussetzung für die Kontrolle der PRRSV Infektion wird derzeit eine Bestandsimmunität angesehen, die am zuverlässigsten durch eine Impfung zu erreichen ist. In Deutschland sind mehrere Impfstoffe zugelassen. Neben zwei inaktivierten Vakzinen stehen auch zwei attenuierte Impfstoffe zur Verfügung, die entweder Virus des NA- oder des EU-Genotyps enthalten. Die Bekämpfung wird häufig durch den endemischen Verlauf der Infektion in den Beständen und der Koexistenz verschiedener Isolate in einem Betrieb erschwert.
Voraussetzung für die Wirksamkeit der Impfstoffe ist die Induktion einer ausreichenden Immunität gegen die zirkulierenden Feldisolate. Für den Einsatz von Vakkzinen gegen das PRRSV sind Kenntnisse der genetischen und antigenen Variabilität der Isolate unabdingbar.
Für Nordamerika liegen bereits umfangreiche Untersuchungen zur Variabilität der NA-Typ- Isolate vor. Inzwischen wurde für Europa ebenfalls eine genetische Vielfalt der EU-Typ- Isolate festgestellt. Für phylogenetische Analysen wurde vorwiegend die Nukleotidsequenz des open reading frame 5 (ORF5) herangezogen, welche für das Hauptimmunogen des Virus kodiert. Die Isolate stammten u. a. aus Italien, Spanien, Österreich, Tschechien und
Deutschland. In einigen asiatischen Ländern (China, Japan) scheinen überwiegend Isolate vom NA-Genotyp vorzukommen, während in anderen Ländern, wie z. B. Thailand oder Korea, beide Genotypen weit verbreitet sind. In den letzten Jahren wurde auch in den USA eine deutliche Zunahme von Isolaten des EU-Genotyps registriert. Zudem zeigte die Untersuchung von Isolaten aus osteuropäischen Ländern, dass ein dritter Subtyp des PRRSV existiert. Diese genetische Diversität könnte die Wirksamkeit der in Europa verwendeten Impfstoffe beeinflussen.
Die Untersuchung wurde mit dem Ziel durchgeführt, die genetische Variabilität aktueller PRRSV-Feldisolate aus Deutschland über einen ein- bis zweijährigen Zeitraum zu untersuchen. Dazu wurden Feldisolate aus verschiedenen Regionen Deutschlands gesammelt und in geeigneten Zellkulturen vermehrt. Teile der Virusgenome wurden sequenziert und zur genetischen Typisierung verwendet. Sequenzen aus Deutschland und aus anderen EU-Staaten wurden in die Untersuchung miteinbezogen. Zusätzlich sollte die klinische Symptomatik in ausgewählten Herden erfasst werden. Dafür wurden herdenspezifische Daten (Lage und Größe des Bestandes, Dauer der Infektion im Bestand, klinische Symptomatik, Impfstatus) so weit wie möglich erfasst.
2. Literatur
2.1 Porcine reproductive und respiratory syndrome virus
2.1.1 Geschichte
Im Jahre 1987 wurde in den USA erstmals vom Auftreten einer bis zu diesem Zeitpunkt unbekannten Epidemie akut verlaufender Reproduktionsstörungen beim Schwein berichtet. Im Zusammenhang mit der Erkrankung wurde ein vermehrtes Auftreten von Spätaborten, eine erhöhte Anzahl lebensschwacher und totgeborener Ferkel und ein Anstieg der Umrauschquote beobachtet. Begleitet wurde dieses Krankheitsgeschehen von hochgradigen respiratorischen Symptomen bei Saug- und Absetzferkeln (KEFFABER, 1989). Schon kurze Zeit später wurden erste Epidemien mit ähnlicher klinischer Symptomatik in Kanada (DEA et al., 1992) und Japan (SHIMIZU et al., 1994) beobachtet. In Europa trat das Virus erstmals 1990 in Deutschland auf (LINDHAUS u. LINDHAUS, 1991). Ab 1991 wurden erste PRRS-Ausbrüche aus den Niederlanden, Spanien, Frankreich und Großbritannien (WENSVOORT et al., 1991;
MEREDITH, 1995) sowie 1992 aus Dänemark (BØTNER et al., 1994) gemeldet. Mittlerweile ist die Erkrankung weltweit in nahezu allen schweineproduzierenden Ländern verbreitet. Seit 1991 wurde von der EU Kommission der einheitliche Name Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) für das Virus vergeben und ersetzte so die unterschiedliche Namensgebung in den verschiedenen Ländern.
2.2 Charakterisierung des PRRSV
2.2.1 Taxonomie und Morphologie
Die moderne Klassifikation der Viren bezieht neben den morphologischen Merkmalen die Genomorganisation und die Sequenzidentitäten ein. Das PRRSV gehört zur Ordnung der Nidovirales. Sie besteht aus drei Familien, den Coronaviridae, den Arteriviridae und den Roniviridae (CAVANAGH et al., 1993; CAVANAGH, 1997; COWLEY et al., 2004). Das Genom besteht aus einem einzelsträngigen, positiv-polaren RNA-Molekül. Nidoviren synthetisieren einen 3’-koterminalen Satz (nested set) subgenomischer mRNAs (CANAVANAGH, 1993).
Der Erreger des seuchenhaften Spätabortes der Schweine (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) wird aufgrund morphologischer, physikalischer und molekularbiologischer Eigenschaften zusammen mit dem Lactate-dehydrogenase elevating virus der Mäuse (LDV), dem Simian haemorrhagic fever virus der Affen (SHV) und dem Equinen arteritis virus der Pferde (EAV) der Familie der Arteriviridae zugeordnet (PLAGEMANN UND MOENNIG, 1991). Die Viren dieser Familie sind ausschließlich tierpathogene Erreger. Gemeinsam sind diesen Viren eine hohe morphologische Ähnlichkeit, die annährend gleiche Genomorganisation, ein sehr ähnlicher Replikationszyklus und die Präferenz für Makrophagen. PRRSV kann wie alle Arteriviren in Makrophagen replizieren und eine persistierende, asymptomatische Infektion hervorrufen.
PRRSV ist ein kleines, behülltes Virus. Es misst 50-65 nm im Durchmesser und hat eine glatte Oberfläche (Abbildung 1). Das Nukleokapsid hat eine Größe von 25-35 nm und ist von kubisch-symmetrischer Gestalt (ROSSOW, 1998).
Literatur
Abbildung 1: Schematische Darstellung des PRRS-Virus. Nach MODROW et al., (2003)
2.2.2 Genomorganisation von PRRSV
Das Genom besteht aus einer 15,1 kB langen, einzelsträngigen, linearen und polyadenylierten RNA mit einer positiven Polarität (MEULENBERG et al., 1997). Das Genom enthält acht sich überlappende offene Lesrahmen (ORF), welche für insgesamt 19 verschiedene Proteine kodieren (Abbildung 2 A).
GP2-Protein
GP3-Protein GP5-Protein
M-Protein GP4-Protein
RNA N-Protein
Virushülle
Nukleokapsid 3’poly-A
5’-cap
Abbildung 2: A: Genom-Organisation von PRRSV; nsp 1-n = Nichtstrukturprotein1, GP2-GP5 = Glykoproteine 2-5, M = Matrix-Protein, N = Nukleokapsid,
B: Messenger RNA (mRNA) (MEULENBERG et al., 2000)
Die offenen Leserahmen sind unterschiedlich lang. Die ORFs 1a und 1b, welche für Nichtstrukturproteine kodieren, haben eine Größe von ca. 12 kb, wohingegen die ORFs 2-7, die für Strukturproteine kodieren, nur noch eine Größe von ca. 3,1 kb des Genoms aufweisen.
Typisch für die Arteriviren aus der Ordnung der Nidovirales ist die Bildung sich überlappender, subgenomischer mRNAs (nested set). In der Regel sind 6 solcher subgenomischer mRNAs ausgebildet, eine für jeden offenen Leserahmen (ORF2 bis 7) (Abbildung 2 B). Für einige wenige Stämme wurde allerdings noch eine weitere, siebte subgenomische mRNA gefunden, deren Funktion oder Bedeutung allerdings bisher noch nicht geklärt werden konnte (MENG et al., 1996). Die Anzahl der subgenomischen mRNAs hat keinen Einfluss auf die Virulenz eines Stammes (MENG et al., 1996).
Nichtstrukturproteine Strukturproteine
mRNA 1 mRNA 2 mRNA 3 mRNA 4 mRNA 5 mRNA 6 mRNA 7 nsp 1-n
GP5
? GP3
ORFs GP4 M
GP2
N A
B
Literatur
2.2.3 Virale Proteine
Die acht ORFs kodieren für insgesamt 18 bzw. 19 Proteine. ORF1a und 1b kodieren für die 12 Nichtstrukturproteine und ORF2 bis 7, für sechs bzw. sieben Strukturproteine. Die Reihenfolge im Genom lässt sich wie folgt darstellen (von 5`-Ende bis 3`-Ende): Die ORFs 1a und 1b: sie kodieren für Proteine der Replikation und Transkription der RNA, die sog. RNA-abhängige RNA-Polymerase. Sie werden als nsp1-12 bezeichnet. Die ORFs 2 bis 5: sie kodieren für membranassoziierte Glykoproteine. Das ORF6 kodiert für das nicht glykolisierte Membranstützprotein M und das ORF7 kodiert für das nicht glykosilierte Nukleokapsidprotein N (Abbildung 2 A).
2.2.3.1 Nichtstrukturproteine
Die ORFs 1a und 1b kodieren für die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RNA-Replikase) und belegen mit etwa 80 % den größten Anteil des Genoms (CONZELMANN et al., 1993;
MEULENBERG, 2000; TRUYEN et al., 2006; CHRISTOPHER-HENNINGS et al., 2006).
Die durch ORF1a und 1b kodierten Polyproteine werden durch drei Proteasen prozessiert, die im ORF1a gelegenen Abschnitt liegen. Zusammen mit einer Rahmenverschiebung (Frameshift) ergibt dies 12 kleinere Endprodukte, die als Nichtstrukturproteine Nsp 1-12 bezeichnet werden. Für PRRSV sind nur die ersten beiden Spaltprodukte, Nsp1α und Nsp1β identifiziert, die ein Papain-ähnliches Cystein Protease-Motiv enthalten (DEN BOON et al., 1995). Diese führen die schnelle Abspaltung von Polyproteinen durch.
2.2.3.2 Strukturproteine
Die subgenomischen mRNAs kodieren für fünf bis sieben Strukturproteine, die nach Major- und Minor-Strukturproteinen unterschieden werden.
Die drei Major-Strukturproteine sind das Glykoprotein 5 (GP5), das Matrixprotein M und das Nukleokapsidprotein N, welche von den entsprechenden ORFs kodiert werden (MARDASSI et
al., 1996; MEULENBERG et al., 1997). Die Proteine GP2, GP3 und GP4 sind Minor- Strukturproteine.
Das GP2 ist ein glykolisiertes Klasse I-Membranprotein, welches sich über Wasserstoffbrücken faltet, aber weder Homodimere noch Heterodimere mit anderen Proteinen bildet. Die Funktion des GP2 ist nicht bekannt (MEULENBERG u. PETERSEN-DEN BESTEN, 1996). Das am stärksten glykolisierte Protein des PRRSV ist das GP3, welches sieben Glykolisierungsstellen besitzt. Neben dem GP5 ist es das Protein mit den größten Sequenzunterschieden zwischen den EU- und NA-Isolaten, deren Aminosäureidentität zwischen 54 und 60 % auf Genebene liegt (MURTAUGH et al., 1995; MARDASSI et al., 1995; MENG et al., 1995). Die genaue Funktion des GP3 als Strukturprotein ist bislang unklar (LEE et al., 2005; PRIETO u. CASTRO, 2005). Einerseits konnte eine Bedeutung als Strukturprotein gezeigt werden (VAN NIEUWSTADT et al., 1996), im Gegensatz dazu war das GP3 aus NA-Typ-Isolaten infizierten Zellen nur in löslicher Form nachweisbar (MARDASSI et al., 1998). Das GP3-Protein besitzt bei NA-Typ-Isolaten eine Deletion von 12 Aminosäuren am C-terminalen Ende. Dadurch wird dieser Abschnitt bei NA-Typ-Isolaten amphiphatisch. Im Gegensatz dazu ist das GP3-Protein der EU-Typ-Isolate an dieser Stelle hydrophil (KATZ et al., 1995; GONIN et al., 1998).
Das GP4 Protein besitzt eine Sequenz mit hydrophoben Eigenschaften und ist bei den EU- und NA-Typ-Isolaten konserviert. Das GP4-Protein des Lelystad Virus (LV) ist an der Bildung von neutralisierenden Antikörpern beteiligt. Die Epitope sind jedoch bei den Proteinen zwischen EU- und NA-Typ-Isolaten verschieden und unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit zur Induktion von neutralisierenden Antikörpern (WEILAND et al., 1999).
Das ORF5 kodiert für das 24-26 kDA große Hüllprotein GP5 mit einem charakteristischen hydrophatischen Profil und mehreren potentiellen Glykolisierungsstellen (MARDASSI et al., 1995; MARDASSI et al., 1996; MEULENBERG u. PETERSEN-DEN BESTEN, 1996). Trotz der großen genetischen Unterschiede zwischen EU- und NA-Isolaten zeigen die Hydrophobizitätsprofile der entsprechenden Proteine hohe Übereinstimmungen, was auf eine sehr ähnliche Faltung des Proteins hindeutet (MURTAUGH et al., 1995; MARDASSI et al., 1995; MENG et al., 1995).
Das GP5 bildet zusammen mit dem Matrixprotein M und dem Nukleokapsidprotein N den Hauptteil der viralen Strukturproteine von PRRSV (SNIJDER u. MEULENBERG, 1998).
Literatur
Das nicht glykolisierte GP6 Protein ist mit 78 bis 81 % Identität des Genabschnittes auf Aminosäureebene das Strukturprotein der Arteriviridae mit dem höchsten Konservierungsgrad (MARDASSI et al., 1995; MEULENBERG, 2000). Ähnlich dem M-Protein der Coronaviridae befinden sich die caboxyterminalen Domänen im Partikelinneren und die aminoterminalen an der Virusoberfläche. Das Protein besitzt zudem stark hydrophobe Bereiche, die das Protein in der Virushülle verankern (MARDASSI et al., 1995; MEULENBERG et al., 1997). Über einen Cysteinrest an der aminoterminalen Domäne bildet das M-Protein eine Disulfidbrücke mit dem Glykoprotein GP5 (ANDREYEV et al., 1997; MURTAUGH et al., 1998). Die Bildung von Heterodimeren gilt als ausschlaggebend für die Bindung an zelluläre Rezeptoren (SNIJDER u.
MEULENBERG, 1998). Es wird angenommen, dass eine Zerstörung dieser Disulfidbrücken die Infektiosität von PRRSV, ähnlich wie bei EAV, reduzieren kann (FAABERG et al., 1995).
Das phosphorylierte N-Protein (12-15 kD) ist an das RNA-Genom gebunden und bildet das Nukleokapsid. Mit 123 von 124 bzw. 128 von 129 Aminosäuren Übereinstimmung gilt es als konserviertes Protein (MARDASSI et al., 1995). Monoklonale Antikörper (mAK) gegen dieses Protein haben allerdings keine neutralisierenden Eigenschaften (NELSON et al., 1993; DREW et al., 1995; DEA et al., 1996).
2.3 Genetische und antigene Variabilität
Die genetische und antigene Variabilität von PRRSV und anderen RNA-Viren ist auf die fehlende Korrekturfunktion der viralen RNA abhängigen RNA-Polymerase während der RNA-Biosynthese zurückzuführen. Dabei kommt es zu Mutationen, also zum Austausch einzelner Basen (Punktmutationen), Wegfall (Deletion) oder Hinzufügen (Insertionen) von Basen (CHANG et al., 2002). Die hohe Mutationsrate des PRRSV begünstigt zudem die Bildung von Quasispezies (GOLDBERG et al., 2003). PRRSV Isolate unterscheiden sich hinsichtlich der klinischen Symptomatik und der Virulenz (BENFIELD et al., 1999).
Auf Grundlage genetischer und antigener Unterschiede lassen sich die verschiedenen Isolate in einen EU- und NA-Genotyp einteilen. Mittlerweile wurden für Osteuropa (Polen, Weißrussland und Litauen) Isolate eines neuen Subtyps beschrieben (STADEJEK et al., 2002;
STADEJEK et al., 2006), die zwar einen hohen Verwandtschaftsgrad zu den bisherigen
EU-Isolaten zeigen, aber mit ihnen nur noch zu 70 bis 75 % auf Nukleotidebene übereinstimmen. Isolate aller Genotypen können vergleichbare respiratorische und reproduktive Erkrankungen verursachen. Allerdings sind einige klinische Symptome, wie z. B.
das Blauverfärben der Ohren, der Zitzen und der Rüsselscheibe, nur nach Infektion mit EU-Typ-Isolaten festgestellt worden (GOYAL, 1993). Durch Untersuchungen der Veränderungen am Lungengewebe von Schweinen, die zuvor in einem Versuch mit PRRSV infiziert worden waren, konnten hoch- und schwachvirulente PRRSV-Isolate unterschieden werden (HALBUR et al., 1995; HALBUR et al., 1996).
2.3.1 Replikationszyklus der Arteriviridae
Als Zielzellen infizieren Arteriviren bevorzugt Makrophagen. Der Replikationszyklus von PRRSV ähnelt dem anderer Arteriviren (MEULENBERG et al., 1997; SNIJDER u.
MEULENBERG, 1998). Arteriviren replizieren im Zytoplasma infizierter Zellen.
Der Replikationszyklus von PRRSV beginnt mit der Translation der Replikasegene, die im ORF1a und 1b lokalisiert sind. Die Polymerase transkribiert die gesamte Plusstrang-RNA in eine komplemetäre Negativstrang-RNA. Diese wiederum dient einerseits als Matrize für die Synthese der genomischen RNA, andererseits zur Synthese von sechs subgenomischen mRNAs. Diese subgenomischen mRNAs besitzen eine positive Polarität und bilden einen Satz sich überschneidender Moleküle (nested set) mit einem gemeinsamen 3’-Ende, die einheitlich mit einer ca. 200 Basen großen Leitsequenz (leader sequence) beginnen. Diese Leitsequenz ist dem zu translatierenden Bereich des Gens vorangestellt. Alle subgenomischen mRNAs besitzen die vollständige, genetische Information der jeweils nächst kleineren mRNA. Die subgenomischen RNA-Spezies werden in die verschiedenen Strukturproteine translatiert.
Die virale Transkriptasen von RNA-Viren haben keine Fehlerkorrektur (proofreading), was zu einer fehlerhaften Replikation des Genoms mit Auftreten einer hohen Anzahl von Nukleotidaustauschen führen kann. Als Folge resultieren daraus u. a. die Bildung von Quasispecies (ROWLAND et al., 1999; GOLDBERG et al., 2003; BIEBRICHER u. EIGEN, 2006).
Literatur
2.3.2 Immunologie
Eine Infektion mit dem PRRS Virus induziert humorale und zelluläre Immunreaktionen. Bisher ging man davon aus, dass die humorale Immunreaktion mit der Bildung von neutralisierenden Antikörpern (nAK) von zentraler Bedeutung ist (LOPEZ u. OSORIO, 2004; LOPEZ u.
OSORIO, 2004; LOPEZ et al., 2007). Im Anschluss an eine Infektion mit PRRSV sind die ersten nicht neutralisierenden Antikörper 7 Tage post infectionem (p. i.) nachweisbar (NELSON et al., 1994). Die ersten nAK lassen sich nach etwa 9 bis 12 Tagen im Serum infizierter Tiere nachweisen (YOON et al., 1995), wobei es zu maximalen Anstiegen der Titer bis zur 6. Woche p. i. kommt. Nach 137 bis 356 Tagen fielen diese Werte wieder unter die Nachweisgrenze ab. Experimentell konnte im Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay (ELISA) gezeigt werden, dass Sauen nach dem 10. Tag p. i. serokonvertierten (ALBINA et al., 1994).
Eine protektive Wirkung der nAK konnte nachgewiesen werden. Ferkel waren durch nAK sicher vor einer klinischen Erkrankung geschützt (LOPEZ u. OSORIO, 2004). Ferkel mit maternaler Immunität sind entsprechend besser vor einer Infektion geschützt als Ferkel, die keine Antikörper mit dem Kolostrum erhalten haben. Weiterhin konnte durch die Übertragung von hohen Mengen nAK auf hochtragende Sauen eine sterile Immunität erreicht und Reproduktionsstörungen sicher verhindert werden (OSORIO et al., 2002).
Spezifische Antikörper und Virus können allerdings über einen gewissen Zeitraum gleichzeitig in einem Tier existieren (BILODEAU et al., 1994). Ein hoher nAK-Titer ist daher nicht zwangsläufig mit einer Protektion gegen PRRSV gleichzusetzen (NELSON et al. 1994). Die Schweine waren ohne nennenswerten Antikörpertiter geschützt oder trotz eines hohen Antikörpertiters nicht geschützt (SAALMÜLLER, 2006).
Durch experimentelle Infektionsversuche konnte gezeigt werden, dass die adaptive Immunantwort des Schweins auf PRRS Virus-Infektionen unzureichend ist (MURTAUGH et al., 2002; HORTER et al., 2002; WILLS et al., 2003). Im Vergleich zu anderen viralen Erkrankungen des Schweins (z.B. Aujeszkysche Krankheit) ist die protektive humorale Immunantwort gegen das PRRS Virus verzögert (drei bis vier Wochen p. i.) und fällt im Gegensatz zu anderen viralen Infektionen deutlich schwächer aus (MEIER et al., 2003;
ROYAEE et al., 2004). Die verzögerte Immunantwort könnte auch ein Grund dafür sein, dass das Virus erst nach Monaten eliminiert wird (ALLENDE et al., 2000).
Aufgrund des zeitgleichen Vorkommens von nAK und einer Virämie scheint neben der angeborenen Immunreaktion mit nachfolgender Bildung von nAK auch die Reaktivität des adaptiven zellulären Immunsystems eine wichtige Rolle in der Immunreaktion des Schweines gegen das PRRSV zu spielen. Die angeborene Immunität ermöglicht eine frühe Abwehrreaktion gegen pathogene Mikroorganismen wie z. B. PRRSV und spielt eine Schlüsselrolle für die Induktion der späteren Antigen-spezifischen, adaptiven Immunantwort und stellt somit die Weichen für eine koordinierte adaptive Immunreaktion des Schweines gegen das Virus. Bei der Reaktion des angeborenen Immunsystems sind in erster Linie antigenpräsentierende Zellen wie Makrophagen und dendritische Zellen beteiligt (Abbildung 3). Die Reaktiviät des adaptiven Immunsystems ist durch die Aktivität antigenspezifischer T-Lymphozyten charakterisiert (SAALMÜLLER, 2006). Hierbei spielt das von den T-Helferzellen sezernierte Interferon Gamma (IFN-γ) eine zentrale Rolle (DIAZ et al., 2006). Dieses wird in einer frühen Phase der Infektion von Makrophagen, natürlichen Killerzellen (NK) und T-Helferzellen gebildet und erreicht schon 10 Tage nach der Infektion den Höhepunkt (WESLEY et al., 2006). TH1 Zellen, welche verstärkt IFN-γ produzieren, sind hauptsächlich für die Unterstützung der zellulären Immunantwort verantwortlich. Weiterhin sind auch andere Zytokine, wie die Typ-I-Interferone (IFN-α und IFN-β), an der Einleitung einer Immunreaktion gegen virale Infektionen beteiligt. Die Typ-I-Interferone stellen eine bedeutende immunregulatorische Verbindung zwischen der angeborenen und der erworbenen Immunabwehr dar (LEE et al., 2004), denn für eine effektive Immunantwort muss das angeborene mit dem adaptiven Immunsystem interagieren. NA-Typ-Isolate reagierten dosisabhängig sensitiv gegenüber IFN-α, induzierten jedoch schlechte Immunantworten in vitro (LEE et al., 2004).
Dendritische Zellen (DZ) des angeborenen Immunsystems spielen ebenfalls eine wichtige Rolle der bei Antigenpräsentation. Nach Aktivierung sind nur sie imstande, die T-Zellen effektiv zu aktivieren (LUDEWIG et al., 1998; MELLMANN u. STEINMAN, 2001).
Literatur
Abbildung 3: Induktion des immunologischen Gedächtnisses (SAALMÜLLER, 2006).
Aktivierung des adaptiven Immunsystems mit Beteiligung des immunologischen Gedächtnisses. TH1/TH2 = T-Helferzellen, ZTL = zytotoxische Leukozyten, DZ = Dendritische Zellen, APZ = antigenpräsentierende Zellen
2.3.3 Impfung
Seit dem ersten Auftreten von PRRSV wurden zur Bekämpfung der Erkrankung mehrere Impfstoffe entwickelt. Die Bekämpfung mittels Vakzinen gehört seit Jahren zu den Standardverfahren der tierärztlichen Praxis. Der Einsatz von Vakzinen dient dabei in erster Linie der Kontrolle des Virus in den Beständen (GROSSE BEILAGE, 2002). Das Ziel einer Impfung gegen das PRRSV ist neben der Verhinderung klinischer Symptome auch das Unterbinden der Ausbreitung eines virulenten Virusstammes im Bestand (MENGELING et al.,
Impfstoff
angeborenes Immunsystem APZ / DZ
antigenspezifische Immunantwort hummorale
Immunantwort zelluläre
Immunantwort
B-Lymphozyten
Plasmazellen
antigenspez.
Antikörper
naive T-Lymphozyten
TH2 TH1 ZTL
antigenspezifische Gedächtniszellen
Gefahr einer Übertragung der Feldvirusinfektion vermindert werden. Die Generierung von Gedächtniszellen des adaptiven Immunsystems ist das vorrangige Ziel einer Vakzination (Abbildung 3).
Die Bekämpfung des PRRSV mittels Impfung unterliegt besonderen Schwierigkeiten, die sich u. a. aus der hohen Mutationsrate und der damit verbundenen Bildung von Quasispecies (2.2.5) ergeben. Dies führt dazu, dass nur ein partieller Schutz aufgebaut wird. Weltweit werden sowohl modifizierte, attenuierte Lebendvakzinen (MLV), als auch inaktivierte Impfstoffe eingesetzt. Aufgrund des Vorkommens von unterschiedlichen Genotypen und der damit verbundenen Diversität verschiedenster PRRSV-Isolate, stehen auch unterschiedliche Vakzinen zur Verfügung (MENG, 2000). Zurzeit sind vier Vakzinen gegen das PRRSV in Deutschland zugelassen (Tabelle 1).
Tabelle 1: Übersicht der in Deutschland zugelassenen Impfstoffe Handelsname
Anbieter
Ingelvac® PRRS MLV BIV*
Porcilis® PRRS Intervet**
Ingelvac®PRRS KV BIV*
Progressis® Merial***
Einführung 4/1996 2/2001 2/2001
Typ lebend, attenuiert lebend, attenuiert inaktiviert
Genotyp NA EU EU
Eigenschaften
• induziert Immunität ähnlich einer Feldvirus- infektion
• Ausscheidung des
Impfstammes
• antigenisch verschieden von EU-
Feldstämmen
• induziert
Immunität ähnlich einer
Feldvirusinfektion
• Ausscheidung des Impfstammes
• antigene
Übereinstimmung mit EU-
Feldstämmen
• keine Impfvirus- ausscheidung
• keine belastbare Immunität
• nur für Sauen zugelassen
* BIV= Boehringer Ingelheim Vetmedica, 55216 Ingelheim / Rhein,
** Intervet, 85716 Unterschleißheim,
*** Merial, 85399 Hallbergmoos
Literatur
Die Impfung mit einem Lebendimpfstoff induziert die gleiche immunologische Reaktion wie eine Feldvirusinfektion, da attenuiertes Impfvirus in gleicher Weise wie Feldvirus mit dem Immunsystem der Tiere interagiert (MENGELING, 2005). Dieses führt allerdings auch dazu, dass Impfvirus, wie für den NA-Typ des PRRS-Impfstoff gezeigt, genauso wie Feldvirus die Plazentarschranke überwinden und es so zu einer intrauterinen Infektion kommen kann (MENGELING et al., 1999).
Die Ausbildung einer protektiven Immunität bzw. die Effizienz einer Impfung gegen das PRRSV ist unterschiedlich. Die Immunität scheint Isolatabhängig zu sein und ist gegenüber homologen Isolaten besser ausgeprägt als gegenüber heterologen (LAGER et al., 1997;
LAGER et al., 2003; ROCK et al., 2007). Die Impfung mit heterologen PRRSV-Stämmen induziert eine partielle Immunität, welche klinische Symptome deutlich reduzieren kann, aber i. d. R. nicht ausreicht, um vor einer Infektion zu schützen (MENGELING et al., 2003).
Attenuierte Impfstoffen könnten ein großes Potential in Bezug auf die Kontrolle des Infektionsgeschehens aufweisen (DEE u. JOO, 1997), bezüglich ihres Einsatzes müssen aber einige Aspekte berücksichtigt werden:
Lebendimpfstoffe können sich wie Feldvirusisolate verhalten und somit einige Wochen und Monate in den geimpften Tieren persistieren und replizieren (MENGELING et al., 1996;
WILLS et al., 1997; MARTELLI et al., 2007). Durch Ausscheidung des Impfstammes können naive, seronegative Schweine infiziert werden (BØTNER et al., 1997; MENGELING et al., 1998). Lebendvakzinen können auch mit dem Sperma übertragen werden (CHRISTOPHER- HENNINGS et al., 1995; CHRISTOPHER-HENNINGS et al., 1997; CHRISTOPHER- HENNINGS et al., 2001). Ein weiteres Problem, das bei Impfungen auftreten kann, ist, dass ähnlich einer Feldvirusinfektion die Immunreaktion der Schweine nur unzureichend ist. Einige Tiere serokonvertieren überhaupt nicht (MENGELING et al., 1998) und eine belastbare Immunität entwickelt sich nur verzögert (MEIER, 2003). Aufgrund der Fehleranfälligkeit während der Virusreplikation von PRRSV besteht die Möglichkeit, dass apathogenes Impfvirus zum pathogenen Ursprungsstamm revertiert (BØTNER et al., 1997; STORGAARD et al., 1999; NIELSEN et al., 2001).
2.3.4 Klinische Symptome
Die klinische Symptomatik einer PRRSV Infektion wird von Faktoren wie der Virulenz des Virusstammes (HALBUR et al., 1996), dem Immunstatus der gesamten Herde (KEFFABER, 1989; WENSVOORT, 1993), dem Alter und Immunstatus der einzelnen Tiere sowie dem Herdenmanagement bestimmt. Klinische Symptome sind in der Phase der akuten Virämie zu beobachten (TERPSTRA et al., 1991). Schwach virulente PRRSV-Isolate rufen eher subklinische Herdeninfektionen hervor (MORRISON et al., 1992), wohingegen hochvirulente Isolate zu ausgeprägten klinischen Symptomen führen können. Beim erstmaligen Auftreten der Infektion in einer Herde sind Tiere aller Altersgruppen gegenüber PRRSV empfänglich. Die Symptome einer akuten PRRSV-Infektion gleichen denen einer Schweinepestinfektion. Diese gehen mit Fieber (39 bis 41 °C), Herz-Kreislaufstörungen (Zyanose oder Hyperämie im Bereich der Akren und blau-roten Verfärbungen der Ohren, der Rüsselscheibe, Säugeleiste und der Vulva) einher. Diese akute Phase dauert ca. zwei Wochen und betrifft je nach Art des Betriebes 5 bis 75 % der Tiere. Bei Zuchtsauen kommt es nach Viruskontakt ab dem 100.
Trächtigkeitstag zu einer Zunahme von totgeborenen, mumifizierten und lebensschwachen Ferkeln. Die Zahl der Sauen, die nicht konzipieren, kann steigen, die Abferkelraten sinken (DONE u. PATON, 1995). In der Akutphase der Infektion werden bei 1 bis 3 % der Sauen Aborte zwischen dem 21. und 109. Trächtigkeitstag festgestellt (BENFIELD et al., 1999).
Innerhalb der Würfe kommt es zu vermehrten Totgeburten. Die Auswertung der Leistungsdaten anhand von neun Ferkelerzeugerbetrieben ergab, dass vier Monate nach Ausbruch von PRRS die Zahl der lebend und totgeborenen Ferkel sowie die Ferkelverluste wieder das Niveau vor dem Ausbruch erreicht hatten (GROSSE BEILAGE u. GROSSE BEILAGE, 1993). Die klinischen Symptome einer akuten PRRSV Infektion bei Saugferkeln sind sehr vielfältig. Sie reichen von Fieber, Apathie, Abmagerung, Kümmern und Dyspnoe bis zu Diarrhoe. Zentralnervöse Symptome mit Tremor und Ruderbewegungen in Seitenlage wurden ebenfalls festgestellt (KEFFABER, 1989; LOULA, 1991; ROSSOW et al., 1995, 1996 u. 1999). Die Verluste bei einer akuten Infektion treten hauptsächlich in den ersten Tagen nach Geburt bis zum Absetzen der Ferkel auf. Die klinischen Symptome einer PRRSV Infektion bei Absetzferkeln und Masttieren ähneln denen anderer respiratorischer Erkrankungen. Zudem können mehrere bakterielle und / oder virale Erreger gleichzeitig in einem Tier auftreten und
Literatur
dabei annähernd die gleichen klinischen Symptome verursachen. Dieses Krankheitsbild wird als Porcine respiratory disease complex (PRDC) bezeichnet (THACKER, 2001; KIM et al., 2003; ROCK et al., 2007). Eine akute Infektion äußert sich durch Störungen des Allgemeinbefindens wie Anorexie, Pneumonien, kutane Hyperämie sowie Kümmern. Als Konsequenz ergibt sich daraus das typische Bild des „Auseinanderwachsens“ einer Gruppe, sowie einer erhöhten Anfälligkeit für bakterielle Sekundärinfektionen (GALINA et al., 1994;
ROSSOW et al., 1995). Sekundärerkrankungen führen zu einer erhöhten Mortalitätsrate, die durch schlechte Hygiene und Betriebsmanagement noch weiter gesteigert werden kann.
2.3.5 Pathologie
Die primäre Vermehrung von PRRSV erfolgt in den Makrophagen der Schleimhaut, z.B. im Endometrium oder in den Makrophagen der Lunge. Die Grundlage dafür ist der ausgesprochene Tropismus des Virus zu Zellen des Monozyten-Makrophagensystems, die der bevorzugte Ort der Virusreplikation sind (ROSSOW et al., 1996). Zwölf Stunden nach Erstinfektion kommt es zu einer Virämie und zur Streuung innerhalb des lymphatischen Systems (ROSSOW et al., 1995). Die erste Virusvermehrung findet in den regionalen Makrophagen statt. Danach kommt es zur Besiedelung der lokalen Lymphknoten, von wo aus sich das Virus systemisch in alle Gewebe ausbreitet. Durch in-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie konnte das PRRSV in Makrophagen verschiedenster Gewebe, in Monozyten und Endothelzellen nachgewiesen werden (HALBUR et al., 1995; ROSSOW et al., 1996).
2.3.6 Labordiagnostischer Nachweis
Die Verdachtsdiagnose einer PRRSV-Infektion kann aufgrund der Anamnese, der klinischen Befunde, der pathologischen Veränderungen und der Auswertung von betrieblichen Leistungsdaten gestellt werden. Sie sollte jedoch immer durch einen direkten Virusnachweis
Nachweis von Antikörpern untermauert werden, da eine Freiheit von klinischen Symptomen, die mit dem PRRS assoziiert sind, keine PRRSV-Freiheit bedeuten (BENFIELD et al., 1999).
2.3.7 Direkter und indirekter Erregernachweis
Der serologische Nachweis von Antikörpern ist eine häufig verwendete Methode der Routinediagnostik, um am lebenden Tier eine PRRSV Infektion festzustellen. Hierzu stehen folgende Testverfahren zur Verfügung: Immunfluoreszenztest (IFT) (YOON et al., 1992), Imunperoxidase Monolayer Assay (IPMA) (DREW et al., 1995), Serumneutralisationstest (SNT) und ELISA (als indirekter und blocking ELISA) (ALBINA et al., 1992; CHO et al., 1996; FERRIN et al., 2004). Der ELISA bietet in der Routinediagnostik gegenüber anderen Techniken durch seine Automatisierbarkeit und Schnelligkeit einige Vorteile. Es werden Antikörper gegen Isolate beider Genotypen erfasst, allerdings kann zwischen ihnen nicht differenziert werden (PLAGEMANN, 2006).
Da nicht zwischen Impfantikörpern, maternalen Antikörpern und solchen, die durch eine Feldvirusinfektion hervorgerufen werden, unterschieden werden kann, sind ELISA-Ergebnisse immer vorsichtig zu interpretieren (HOUBEN et al., 1995) .
Eine nachweisbare Immunreaktion kann auch nach mehrmaligem Erregerkontakt bzw.
Impfungen ausbleiben, so dass z. B. Serumproben von mehrfach geimpften Sauen im ELISA negativ reagieren können (MEIER et al., 2000).
Die Tatsache, dass neben Antikörpern auch replikationsfähiges Virus in einem Tier vorkommen kann, macht den Einsatz des direkten Erregernachweises unumgänglich. Für den Antigennachweis stehen folgende Methoden zur Verfügung: In situ Hybridisierung (ISH) (LAROCHELLE et al., 1996), Immunhistochemie (IHC) (HALBUR et al., 1995), Immunfluoreszenztest (IFT), Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) (VAN WOENSEL et al., 1994; GILBERT et al., 1997; OLEKSIEWICZ et al., 1998), Real- time RT-PCR (CHRISTOPHER-HENNINGS et al., 1995; CHRISTOPHER-HENNINGS et al., 1998; EGLI et al., 2001) und die Virusisolierung mit Hilfe der Zellkultur (WENSVOORT et al., 1991; KIM et al., 1993). Die RT-PCR ist das wichtigste Instrument des direkten
Literatur
Erregernachweises und damit das Mittel der Wahl, da sich PRRSV-Isolate schlecht in Zellkulturen vermehren lassen.
Als Probenmaterial für eine RT-PCR werden neben Serum, bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit und Leukozyten auch Gewebeproben aus Lunge, Tonsillen und Lymphknoten verwendet. Die PCR ist eine in vitro Technik zur Amplifikation eines spezifischen Genomfragments aus Desoxyribonukleinsäure (DNA) (MULLIS et al., 1986;
MULLIS et al., 1992), das zwischen zwei Genomregionen mit bekannter Nukleotidsequenz liegt. Dafür wird die Eigenschaft der DNA-Polymerasen genutzt, die zur Amplifikation kurze spezifische Oligonukleotide, sogenannte Primer, benötigen. Nach enzymatischer Umschreibung durch eine Reverse Transkription (RT) in die komplementäre DNA (cDNA) kann auch RNA mit Hilfe der PCR amplifiziert werden. Dieser Vorgang mittels PCR wird daher als RT-PCR bezeichnet. Die spezifische Amplifikation von Genomabschnitten kann für den diagnostischen Nachweis von Viren genutzt werden. Für den Nachweis der PRRSV spezifischen Nukleinsäure mit der RT-PCR wurden seit 1994 zahlreiche Protokolle etabliert, die meist auf der Amplifizierung des ORF5 bzw. des ORF7 beruhen (OLEKSIEWICZ et al., 1998; PESCH et al., 2005).
2.4 Epidemiologie
2.4.1 Weltweite Verbreitung
Erste klinische Fälle mit dem bis dahin unbekannten Erreger, dem Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), wurden erstmals 1987 in Nord-Amerika, den Vereinigten Staaten (NA-Typ-Isolate) festgestellt (KEFFABER, 1989), von wo aus sich das Virus u. a. nach Kanada schnell weiter verbreitete. Es ist davon auszugehen, dass das PRRSV weltweit in nahezu allen Schweine produzierenden Ländern endemisch geworden ist. Lediglich Schweden, die Schweiz und Australien konnten eine PRRSV-Freiheit ihrer Bestände nachweisen (ELVANDER et al., 1997; GARNER et al., 1997; CORBELLINI et al., 2006).
Anhand retrospektiver serologischer Untersuchungen wurde versucht, das erste Auftreten des Erregers in der Hausschweinepopulation zeitlich einzugrenzen. In Kanada konnten PRRSV- Antikörper retrospektiv im ELISA erstmals im Jahr 1979 nachgewiesen werden (CARMAN et
al., 1995). Die Seroprävalenz stieg von anfangs 3,9 % auf 15,7 % im darauf folgenden Jahr an.
In den USA konnten Antikörper gegen das PRRSV erstmalig 1985 detektiert werden (ZIMMERMAN et al., 1997). Die anfänglich niedrige Prävalenz (3,8 %) stieg innerhalb von drei Jahren auf 63 % der Herden bzw. 47,6 % der Schweine an. Nach ZIMMERMAN et al.
(1997) muss eine Virusverbreitung in Iowa vor 1985 stattgefunden haben. Ähnliche retrospektive Untersuchungen wurden auch in Südkorea (SHIN et al., 1993) und in Japan durchgeführt (HIROSE et al., 1995). Vom erstmaligen Auftreten des PRRSV bis zur weltweiten Ausbreitung benötigte der Erreger nur 10 Jahre.
Die ursprüngliche Quelle und die Umstände der Übertragung auf das Hausschwein sind bisher unklar. Auch die am häufigsten thematisierte Theorie, dass das PRRSV vom Wildschwein auf das Hausschwein übertragen worden ist, konnte nicht bestätigt werden. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass Wildschweine in Nordamerika vor dem Nachweis der PRRSV-Infektion beim Hausschwein seronegativ waren. Die Übertragung erfolgte somit eher vom Hausschwein auf das Wildschwein (ZIMMERMAN, 2003). Die Virusevolution ist bis heute nicht geklärt.
Ein weiterer Ansatz zur Klärung der Herkunft des PRRSV basiert auf der Verwandtschaft zum Lactatdehydrogenase elevating virus (LDV) der Mäuse. Dieses soll Anfang des 20.
Jahrhunderts von Mäusen auf Wildschweine übertragen und mit Exporttieren nach Nordamerika gebracht worden sein (PLAGEMANN, 2003). Eine weitere Vermutung ist, dass sich das PRRSV durch Änderungen in der Transmembranregion erst Mitte 1980 von einem anderen Wirt an das Schwein adaptiert hat (HANADA et al., 2005). Prävalenzstudien in schweinedichten Regionen, in denen PRRSV endemisch ist, sind unter Vorbehalt zu interpretieren, da in der Regel in diesen Gebieten modifizierte Lebendvakzinen eingesetzt werden und die Impfantikörper nicht von denen einer Feldvirusinfektion zu unterscheiden sind.
Weiterhin stellt die Tatsache, dass Impfvirus über längere Perioden ausgeschieden werden kann, Seroprävalenzstudien in Frage.
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass es neben den bisher bekannten zwei Genotypen weitere Subtypen gibt, die bisher aber nur in Osteuropa isoliert werden konnten. Sie hatten einen um 250 Basen verkürzten ORF5-Bereich. (STADEJEK et al., 2006). In einigen asiatischen Ländern (China, Japan) scheinen überwiegend Isolate vom NA-Genotyp vorzukommen (KANG et al., 2004; YOSHII et al., 2005), während in anderen Ländern
Literatur
(Thailand) beide Genotypen weit verbreitet sind (THANAWONGNUWECH et al., 2004). In den letzten Jahren wurde auch in den USA eine steigende Zahl von Isolaten des EU-Genotyps registriert (ROPP et al., 2004).
In Deutschland trat das PRRS-Virus erstmals Ende 1990 auf (GROSSE BEILAGE et al., 1991;
LINDHAUS u. LINDHAUS, 1991). Da es sich bei PRRS derzeit weder um eine anzeigepflichtige noch um eine meldepflichtige Tierseuche handelt, liegen für Deutschland keine statistisch abgesicherten Daten über eine Verbreitung von PRRSV in Schweinebetreiben vor. Je nach Schweinedichte ist der Durchseuchungsgrad in Deutschland sehr unterschiedlich.
In sehr schweinedichten Regionen, wie z.B. dem Weser-Ems Gebiet oder dem Münsterland, sind etwa 90 % der Betriebe infiziert. Insgesamt muss davon ausgegangen werden, dass 70-80 % der deutschen Schweinebetriebe seropositiv auf PRRSV sind (ANONYM, 2006).
2.4.2 Erregerübertragung und Virusausscheidung
Die Übertragung von PRRSV auf empfängliche Schweine erfolgt auf oralem, nasalem, intramuskulärem, intraperitonealem, diaplazentaren oder vaginalem Weg. Die Dosis, die notwendig ist, um eine Infektion auszulösen, ist bis heute nicht eindeutig geklärt und wurde von Untersuchungen, die für das LDV durchgeführt wurden, abgeleitet. Sie variiert zwischen 3,16 x 10 3 und 2,0 x 105 Vironen (CAFRUNY u. HOVINEN, 1988)
Das Virus wird mit allen Körpersekreten und -exkreten ausgeschieden. Die Infektiosität variiert allerdings stark. Aus Ejakulaten von Ebern konnte das Virus bis zu 92 Tage p. i. mittels einer RT-PCR bzw. einer q-PCR nachgewiesen werden (CHRISTOPHER-HENNINGS et al., 1995;
CHRISTOPHER-HENNINGS et al., 2001). In Speichel und Kot lässt sich das Virus über einen Zeitraum von ca. 42 Tagen p. i. nachweisen (WILLS et al., 1997). Dabei muß jedoch beachtet werden, dass der Nachweis des Genoms nicht zwangsläufig mit der Replikationsfähigkeit des Virus korreliert (SUAREZ et al., 1996).
2.4.3 Persistente Infektion
Eine Infektion mit PRRSV führt zu einer längeren Erregerpersistenz im lymphoiden Gewebe (Tonsillen, Lymphknoten). Nach einer experimentellen Infektion konnte bis zu 157 Tage p. i.
Virus nachgewiesen werden (WILLS et al., 1997; WILLS et al., 2003). Eine Erregerpersistenz muß allerdings nicht zwangsläufig mit einer Virusausscheidung einhergehen. Die Dauer der Persistenz wird offensichtlich vom Alter der Tiere beeinflusst, wobei jüngere Tiere länger infiziert bleiben als Tiere, die zum Zeitpunkt der Infektion schon adult waren (MENGELING et al., 1994; BIERK et al., 2001).
Persistente Infektionen stellen ein erhöhtes Risiko innerhalb einer Herde dar, da eine Infektion wieder reaktiviert werden kann und so eine Erregerübertragung sowohl innerhalb einer Herde als auch zwischen verschiedenen Beständen erfolgen kann.
2.5 Phylogenetische Analysen als Hilfsmittel der Epidemiologie
Epidemiologische Untersuchungen werden zunehmend durch phylogenetische Analysemethoden ergänzt. So entstanden umfangreiche Fallstudien über die epidemiologische Geschichte weltweit verbreiteter Viruserkrankungen, wie z.B. HIV-1, Influenza-A oder dem Hepatitis-C-Virus (HCV) (KANDATHIL et al., 2005; TEO, 2005; MOURY et al., 2006;
ZHAO, 2007).
In der veterinärmedizinischen Virologie liegen vor allem Untersuchungen zu RNA-Viren vor (HAAS, 1997; HUNGNES et al., 2000). Anhand von Untersuchungen von Pestiviren (VILCEK et al., 2005; GREISER-WILKE et al., 2006) konnten Rückschlüsse auf Verbreitungswege, Interspeziesübertragung sowie die Unterscheidung von Feld- und Impfvirusstämmen gezogen werden.
Phylogenetische Analysen können unter anderem mit morphologischen, ätiologischen und molekularen Daten durchgeführt werden. Die seit den 1960er Jahren stark zunehmenden Erkenntnisse zur molekularen Evolution sowie die Anhäufung von molekularen Daten betreffend Protein- und Nukleinsäuresequenzen haben parallel zum Fortschritt in der Computertechnologie die Entwicklung und breite Anwendung zahlreicher Verfahren zur
Literatur
Untersuchung der evolutionären Geschichte von Organismen und Makromolekülen vorangetrieben.
Für computergestützte phylogenetische Analysen steht eine Vielzahl von Programmpaketen zur Verfügung. Diese sind häufig auf einen methodischen Schwerpunkt ausgerichtet. Unter der www-Adresse http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.html befinden sich Links zu den meisten Anbietern kommerzieller und frei erhältlicher Software. Das Programmpaket Phylip (Phylogenetic Inference Package, FELSENSTEIN 1989) bietet den Vorteil, dass es weit verbreitet ist und eine Vielzahl von Einzelprogrammen mit unterschiedlichen Methoden enthält. Zudem ist es frei erhältlich und verfügt über detaillierte Dokumentationen (SANDERSON, 1990).
2.5.1 Darstellung phylogenetischer Analysen
Pylogenetische Analysen werden graphisch als Dendrogramme dargestellt. Ein phylogenetischer Baum stellt die evolutionären Beziehungen zwischen verschiedenen Arten oder anderen Einheiten dar, von denen man vermutet, dass sie einen gemeinsamen Vorfahren besitzen. Im phylogenetischen Kontext ist ein Baum eine mathematische Konstruktion, welche die stammesgeschichtlichen Verwandtschaftsverhältnisse (Phylogenie) einer Gruppe von Lebewesen widerspiegelt. Ein Stammbaum besteht aus Knoten (Verzweigungspunkten), die durch Kanten (Äste) miteinander verbunden sind. In einem phylogenetischen Baum repräsentiert jeder Knoten den Vorfahren der nächsten gemeinsamen Verwandten (LI, 1997).
Die Kantenlänge entspricht der Anzahl der Mutationen während dieser Entwicklung. Jeder Knoten in einem phylogenetischen Baum wird als taxonomische Einheit bezeichnet. Innere Knoten symbolisieren die hypothetischen Vorfahren für jene Taxa, die sich in einem anschließenden Aufspaltungsprozess in zwei Tochterlinien geteilt haben (HILLIS, 1997). Die Anordnung der Zweige ergibt die Topologie des Baumes (Abbildung 4). Die äußeren Knoten repräsentieren Organismen, für die reale Daten vorliegen wie z. B. DNA-Sequenzen. Sie werden auch als Operational Taxonomic Units (OTUs) bezeichnet. Phylogenetische Bäume werden heute meist anhand von Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen definierter Genabschnitte berechnet. Dabei berechnet man ein Sequenzalignment des gleichen Gens (oder
der gleichen Gene) dieser Arten und verwendet die im Alignment erscheinenden Ähnlichkeiten und Unterschiede, um phylogenetische Analysen durchzuführen. Arten, deren Sequenzen ähnlich sind, liegen im Dendrogramm dann wahrscheinlich näher beieinander als solche mit stark unterschiedlichen Sequenzen. Zu einer der dabei am häufigsten angewendeten Algorithmen der molekular-phylogenetischen Analysen gehört das Neighbor-Joining (N-J) (FELSENSTEIN, 1992), bei dem einem definierten Algorithmus folgend Schritt für Schritt ein Dendrogramm erstellt wird (2.4.2). Ziel der Erstellung phylogenetischer Analysen ist es, die Evolution möglichst detailliert zu erklären. Allerdings weiß man heute, dass die Gene sich nicht gleichmäßig entwickelt haben. Einige Gene, die heute beim Menschen vorkommen, haben beispielsweise nur gemeinsame Vorfahren mit dem Schimpansen, andere kommen bei allen Säugetieren vor. Deshalb können bei der Analyse verschiedener Gene der gleichen Spezies unterschiedliche phylogenetische Bäume entstehen, die für sich jedoch alle korrekt sind. Um die Entstehungspunkte und Verzweigungen bei der Evolution der einzelnen Arten festzustellen, müssen deshalb verschiedene Genregionen untersucht werden. Weiterhin sollten Ergebnisse aus der klassischen Phylogenie sowie morphologische Merkmale zur Interpretation hinzugezogen werden (HAESELER u. LIEBERS, 2003; KNOOP u. MUELLER, 2006).
Abbildung 4: Bestandteile eines einfachen phylogenetischen Baumes Äußere Knoten (endständiges Taxon, OTU) Interne Knoten
(Verzweigungspunkt, hypothetischer Vorfahre) Wurzel (Vorfahre aller
untersuchten Taxa)
Nukleotidaustausche pro Länge
0,01
Literatur
2.5.2 Für phylogenetischen Analysen verwendete Algorithmen
Grundlage der phylogenetischen Analyse von Sequenzdaten ist ein Sequenzvergleich. Hierbei werden die einzelnen Substitutionen, Insertionen oder Deletionen unterschiedlich gewichtet und anhand dieser Werte die OTUs so angeordnet, dass die Kriterien des jeweils angewendeten Algorithmus optimal erfüllt werden. Dieses Vorgehen wird als Alignment bezeichnet. Für ein Alignment müssen die Sequenzen von definierten (festgelegten) Genomfragmenten stammen und immer die gleiche Länge aufweisen.
Die Berechnung eines phylogenetischen Baumes kann auf zwei unterschiedlichen Methoden basieren (SWOFFORD et al., 1996). Dies ist einerseits ein auf einem Direktvergleich der Sequenzen beruhenden Algorithmus, (Parismony, Maximum-Likelihood) oder andererseits auf einer Distanzmatrix basierenden Methode, zu denen die UPGMA (Unweighted Pair-Group Method) und die Neighbor-Joining (N-J) Methode gehören.
Die am häufigsten in der molekularen Phylogenie verwendete Methode ist der Neighbor- Joining-Algorithmus (N-J), bei dem aus den Sequenzen zuerst eine Distanzmatrix berechnet wird (SAITOU u. NEI, 1986). Die Sequenzen selber werden danach nicht mehr verwendet.
Distanzbasierende Methoden berechnen die Distanz für alle Sequenzpaare eines Alignements.
Das Ergebnis ist die Distanzmatrix, aus welcher ein Baum rekonstruiert wird, welcher die Anzahl der Substitutionen aller Sequenzpaare wiedergibt. Aus dieser Matrix berechnet das Programm entweder einen bewurzelten (rooted) oder einen unbewurzelten Baum (unrooted tree). Das Ziel des N-J ist, die Gesamtastlänge zu minimieren.
2.5.3 Überprüfung der Robustheit von Bäumen (Bootstrap-Werte)
Zur Überprüfung der Robustheit eines konstruierten phylogenetischen Baums wird das von Bradley Efron entwickelte Bootstrapping-Verfahren verwendet (EFRON, 1979; EFRON et al., 1996). Beim Bootstrap wird eine zufällige Stichprobe durch wiederholtes Ziehen mit Zurücklegen aus den bereits erhobenen Daten generiert, die Pseudoreplikate genannt werden.
Häufig werden auf diese Weise 1000 bis 10000 Bäume berechnet. Kommt dabei eine bestimmte Gruppierung in allen Bäumen vor, so bedeutet dies einen Bootstrap-Wert von
100 %. Für die verlässliche Rekonstruktion eines Dendrogramms ist die Stichprobengröße (Länge oder Anzahl der Sequenzen) von entscheidender Bedeutung. Das Bootstrapping ist ein statistischer Wert, der die Stabilität der Einteilung der Isolate in die einzelnen Gruppen und Genotypen angibt. Je höher der Wert ist, desto stabiler ist die Eingruppierung der untersuchten Sequenzen (s. o). Niedrige Bootstrap-Werte weisen dagegen nicht zwangsläufig auf ein falsches Ergebnis hin. Sie werden von den vorhandenen Sequenzen nicht genügend unterstützt, weil sie zu kurz sind oder weil eine zu geringe Anzahl an Sequenzen verfügbar ist (EFRON, 1979; FELSENSTEIN, 1992).
2.6 Genetische Typisierung von PRRSV
Für die genetische Typisierung werden Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen eines definierten Genomabschnitts mittels einer RT-PCR amplifiziert und anschließend direkt sequenziert. Durch den Einsatz der PCR und Sequenzierung konnten mittlerweile mit wenig Aufwand große Mengen an Sequenzdaten erstellt werden (VAN BELKUM et al., 2001). Eine entscheidende Grundlage zur Einteilung von PRRSV-Isolaten in die verschiedenen Genotypen, Gruppen oder Subgruppen bilden phylogenetische Bäume. PRRSV zeigt eine hohe genetische Variabilität. Die Nukleotididentität im ORF5 zwischen dem EU-Referenzstamm Lelystad (LV) und dem NA-Referenzstamm VR-2332 beträgt 61 bis 64 % (MARDASSI et al., 1994; MENG et al., 1995; ALLENDE et al., 1999; CHA et al., 2004; CANCEL-TIRADO et al., 2004;
BATISTA et al., 2004). Im Hinblick auf den gegebenenfalls einzusetzenden Impfstoff in einer Herde sind Hinweise auf die Identität des Isolates notwendig. Nicht nur der Genotyp, sondern auch der Grad der Verwandtschaft mit den in den Impfstoffen enthaltenen attenuierten Virusstämmen ist von Bedeutung. Die genetische Typisierung des PRRS-Virus basiert auf Vergleichen von Nukleinsäuresequenzen definierter Genombereiche. Zur genetischen Differenzierung wurden aufgrund ihrer antigenen Eigenschaften vorwiegend Nukleotidsequenzen des ORF5 herangezogen (CONZELMANN et al., 1993; ANDREYEV et al., 1997). Unterstützend werden ebenfalls häufig Nukleotidsequenzen des ORF7- Genomabschnitts zur phylogenetischen Analyse benutzt (MARDASSI et al., 1994;
OLEKSIEWICZ et al., 1998). Aufgrund von bisherigen Sequenzanalysen europäischer Isolate
Literatur
konnte gezeigt werden, dass EU-Typ-Isolate genau wie NA-Typ-Isolate eine Gruppenbildung (Clustering) erkennen lassen. Dieses kann allerdings geographisch verzerrt sein (FORSBERG et al., 2002). Innerhalb des EU-Genotyps kommt es zur Bildung verschiedener Cluster. Bisher unterscheidet man zwischen den italienischen, dänischen oder Lelystad-like Clustern (Abbildung 5).
Abbildung 5: Gruppierung der EU-Typ-Isolate nach FORSBERG et al., (2002) IT, SP, DK, NL, BE, DE und UK: Länderabkürzungen
Mittlerweile werden innerhalb des EU-Genotyps vier Subtypen des PRRSV unterschieden: der EU-Subtyp (MENG et al., 1995) und die drei bisher nur in Osteuropa vorkommenden osteuropäischen Subtypen zwei bis vier (STADEJEK et al., 2002; STADEJEK et al., 2006)
Lelystad-like
DK
Italian-like
8-DK
5-DK 12-DK
2-DK 10-SP
4-SP
3-SP 9-DK
8-SP
11-SP
8-DK
1-SP
15-DK
5-IT
6-IT 2-IT
12-IT
11-IT
4-IT
3-DK 16-DK 5-DE
2-SP
1-NL,2-NL,4- NL,1-BE,1-FR,3-
DE,5-UK..
Abbildung 6: Einteilung der PRRSV-Isolate innerhalb des EU-Genotyps nach STADEJEK et al. 2006. Abkürzungen stehen für Isolate.
2.6.1 Molekulare Epidemiologie
In den letzten Jahren nahm die molekulare Technik zur Klassifizierung viraler Erreger mittels Sequenzierung rapide zu. Die genetischen Typisierungen von PRRSV-Isolaten wurden in Anlehnung an die Genotypisierung von CSFV-Isolaten u. a. auch durchgeführt, um Aufschlüsse über epidemiologische Zusammenhänge einzelner Krankheitsausbrüche zu erhalten. Hierfür wurde routinemäßig die Amplifikation des ORF5-Gens des PRRSV verwendet (DEE et al., 2001; FORSBERG et al., 2001; LAROCHELLE et al., 2003;
FORSBERG, 2005). Dieser Genomabschnitt ist sehr variabel (YOON et al., 1994). Werden also Unterschiede zwischen Isolaten angenommen, so zeigen sie sich v. a. in dieser Region.
