Epitopanalyse von Matrix-Metalloproteinase-19- spezifischen monoklonalen Antikörpern
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften
an der Universität Konstanz
Naturwissenschaftlich-mathematische Sektion Fachbereich Biologie
vorgelegt von Birgit Annette Kolb
Tag der mündlichen Prüfung: 5. Juli 2001 Referent: Prof. Dr. Michael Przybylski
Referent: Prof. Dr. Konrad Hofer
meinem „Döte“
Werner Kolb
1940-1983
in memoriam
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Mai 1997 bis Februar 2001 am Lehrstuhl für Immunologie und im Arbeitskreis für Analytische Chemie der naturwissenschaftlich- mathematischen Sektion der Universität Konstanz.
Mein Dank gilt:
- Prof. Dr. Ulrich Krawinkel für die interessante Themenstellung und die Unterstützung meiner Arbeit. Ich werde ihn in guter Erinnerung behalten.
- Prof. Dr. Michael Przybylski für seine Bereitschaft nach Ulrichs Tod die Betreuung dieser Arbeit zu übernehmen, seine Diskussionsbereitschaft und die finanzielle Unter- stützung.
- Prof. Dr. Hofer für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens.
- Dr. Radislav Sedlacek für seine Betreuung.
- Besonders Markus Kohlmann für die sehr gute Zusammenarbeit.
- Dr. Martin Blüthner für die Bereitstellung des Protokolls und der verschiedenen Bak- terien für das „Phage Display“.
- Dr. Stephan Witte für die Einführung in das Baculovirussystem und das Einblick ge- währen in “politische” Dinge.
- Dr. Simon Mauch für das Einführen in das molekularbiologische Arbeiten, das zur Verfügung stellen von verschiedenen MMP-19 Plasmiden und seine Diskussionsbe- reitschaft.
- Dr. Cornelia Kolb für ihr ausgleichendes Wesen und ihre Hilfe in vielen Dingen.
- Der AG Krawinkel für das gute Arbeitsklima und der AG Przybylski für ihre freundli- che Aufnahme und das sehr gute Arbeitsklima.
- Dem Team der Malhaus-Apotheke. Sowohl die Samstags-Dienste, als auch die Tref- fen nach der Arbeit haben immer Spaß gemacht.
- Meinen Freunden für ihre Unterstützung in allen Lebenslagen.
- Meiner Familie, die mich immer unterstützt hat.
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Å Ångström
aa Aminosäure
Abb. Abbildung
AK Antikörper
amp Ampicillin
APS Ammoniumpersulfat
ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaar
BSA Rinderserumalbumin
°C Grad Celsius
cDNA copy DNA
CDR complementarity determining region
cm2 Quadratzentimeter
COMP cartilage oligomeric matrix protein DDW doppelt destilliertes Wasser
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxynukleotidtriphosphate
DTT Dithiothreitol
ECM extrazelluläre Matrix
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGF epidermal growth factor
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
FCS fötales Kälberserum
g Erdbeschleunigung
h Stunde
HEPES N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethansulfonicacid]
HLA human leucocyte antigen
HPLC Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie IEF Isoelektrische Fokussierung
IgG Immunglobulin-γ
Il Interleukin
INF Interferon
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid
LB Luria-Bertani-Medium
kan Kanamycin
kD Kilodalton
L Liter
M Mol
mA Milliamper
MALDI-MS Matrix-unterstützte Laserdesortions-/Ionisations- Massenspektrometrie
MHC major histocompatibility comples; Haupthistokompatibilität- skomplex
min Minute
MMP(n) Matrix Metalloprotease(n)
MP Milchpulver
Abkürzungsverzeichnis
mRNA Boten (messenger) Ribonukleinsäure
MT-MMP membran-type MMP
MW Molekulargewicht
m/z Verhältnis der Masse zur Ladung
nm Nanometer (Wellenlänge)
NS Normalserum; Serum einer Kontrollperson Ni-NTA Nickel-Nitrilotriessigsäure Agarose
OD optische Dichte
ORF open reading frame; offenes Leseraster
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerasenkettenreaktion
PBS-T PBS-Tween® 20
PDGF platelets-derived growth factor
PEG Polyethylenglycol
pfu plaque forming units
pH negativer dekadischer Logarithmus der H3O+-Ionenkonzentration
PNK Polynukleotid Kinase
POD Peroxidase
RA Rheumatoide Arthritis
rf reading frame
rpm Rotationen pro Minute
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkiptase-PCR
SDS Sodium Lauryl Sulfate, Natriumlaurylsulfat
sek Sekunde(n)
Sf9 Spondoptera frugiperda
SLE Systemischer Lupus Erythematodes
strep Streptomycin
Tab. Tabelle
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TE Tris-EDTA-Puffer
TFA Trifluoresigsäure
tet Tetracyclin
tfu transforming unit
TGF transforming growth factor
TIMP tissue inhibitor of matrix metalloproteinases
TNF tumor necrosis factor
TNT Tris-NaCl-Tween® 20
TOF time of flight
TRE TPA response element
Tris Trishydroxymethylaminomethan
Tween® 20 Polyoxyethylen Sorbitan Monolaurat uPA Urokinasetyp Plasminogen Aktivator
UV Ultraviolett
v Volumen
V Volt
VCAM-1 vacsular cell adhesion molecule-1) VLA-4 very late antigen 4)
Abkürzungsverzeichnis
Aminosäuren
Alanin Ala A
Cystein Cys C
Asparaginsäure Asp D
Glutaminsäure Glu E
Phenylalanin Phe F
Glycin Gly G
Histidin His H
Isoleucin Ile I
Lysin Lys K
Leucin Leu L
Methionin Met M
Asparagin Asn N
Prolin Pro P
Glutamin Gln Q
Arginin Arg R
Serin Ser S
Threonin Thr T
Valin Val V
Tryptophan Trp W
Tyrosin Tyr Y
Nukleotide
A Adenin
C Cytosin
G Guanin
T Thymidin
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1. Die Familie der Matrix-Metalloproteinasen (MMPn): Struktur und Regulation 1
1.1.1. Die Domänenstruktur 1
1.1.2. Die Unterfamilien der Matrix-Metalloproteinasen 5 1.1.3. Die Regulation der Expression und der Aktivität 6 1.2. Die physiologische und pathophysiologische Funktion von MMPn 9 1.2.1. Matrix-Metalloproteinasen bei der Rhe umatoiden Arthritis 10
1.2.2. Matrix-Metalloproteinasen bei Krebs 12
1.3. Die Matrix-Metalloproteinase-19 (Rasi-1) 13
1.4. Grundlagen und Struktur von Antigen-Antikörper Wechselwirkungen 17
1.5. Methoden der Epitopanalyse 19
1.6. Ziel dieser Arbeit 23
2. Material und Methoden 25
2.1. Material 25
2.1.1. Chemikalien und Reagenzien 25
2.1.2. Molekularbiologie: Bakterienstämme, Enzyme, Reagenzien, Primer und Plasmide
25
2.1.3. Antikörper 27
2.1.4. Humanseren und –gewebe 27
2.2. Molekularbiologischer Teil 27
2.2.1. Polymerasenkettenreaktion (PCR) 28
2.2.1.1. Standard-PCR 28
2.2.1.2. Kolonie-PCR 28
2.2.1.3. Klonierungs-PCR 29
2.2.2. Reinigung von PCR-Produkten 30
2.2.3. Präparation von Plasmid-DNA 30
2.2.4. Restriktionsverdau 30
2.2.5. Isolierung von DNA aus präparativen Agarose-Gelen 31
2.2.6. Ligation 31
2.2.7. Herstellung CaCl-kompetenter Bakterien 31
2.2.8. Hocheffiziente Transformation von E.coli 32
2.2.9. DNA-Sequenzanalyse 32
2.3. In vitro 35S-Markierung von Proteinen 32
2.4. Phage Display 33
2.4.1. Material 33
2.4.2. Präperation von SfiI verdauter fUSE-5 rfDNA 33 2.4.3. Präparation von beliebigen cDNA Fragmenten 33
2.4.4. Herstellung der Phagen Bank 35
2.4.5. Biopanning 36
2.5. Das Baculovirus Expressionssystem 38
2.5.1. Material 38
Inhaltsverzeichnis
2.5.2. Zellkultur 38
2.5.3. Plasmidkonstruktion 38
2.5.4. Cotransfektion 40
2.5.5. Plaque-Assay 40
2.5.6. Identifizierung und Reinigung von rekombinantem Virus 41
2.5.7. Rekombinante Virusamplifikation 42
2.5.8. Reinigung von Virus-DNA aus infizierten Insektenzellen und Identifi- zierung rekombinanter Virus-DNA
42 2.5.9. Charakterisierung der rekombinanten Proteinexpression 43
2.6. Elektrophorese 43
2.6.1. Gelelektrophorese von DNA 43
2.6.2. Gelelektrophorese von Proteinen 43
2.6.3. Coomassie Färbung 44
2.6.4. Isoelektrische Fokussierung (IEF) 44
2.7. Konstruktion von Oligohistidin-MMP-19 Fragmenten 44 2.8. Expression und Reinigung von rekombinanten Oligohistidin-Fusionsproteinen 45
2.8.1. Expression in E.coli 45
2.8.2. Reinigung durch Ni-Affinitätschromatographie 46
2.9. Photometrische Proteinquantifizierung 46
2.10. Immunologische Methoden 47
2.10.1. Immunoblot 47
2.10.2. Dot Blot 47
2.10.3. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 47
2.10.4. Inhibitions-ELISA 48
2.10.5. Sandwich-ELISA 48
2.10.6. Immunhistochemie 49
2.11. Festphasenpeptidsynthese 49
2.11.1. Synthese nach der Fmoc-Synthesemethode 49
2.11.2. Partialpeptide aus MMP-19 51
2.12. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) 51
2.13. Proteolytischer Abbau von Proteinen 51
2.13.1. Verwendete Proteasen 51
2.13.2. Abbau in Lösung 52
2.13.3. Abbau im SDS-Gel 52
2.14. Proteolytische Abbaumethoden zur massenspektrometrischen Epitopanalyse 53 2.14.1. Kopplung von Antikörpern an NHS-aktivierte Sephasose 53
2.14.2. Epitop-Excision 53
2.14.3. Epitop-Extraktion 53
2.15. Matrix-unterstützte-Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS)
54
2.15.1. Prinzip 54
2.15.2. Probenpräparation 55
2.15.3. Spektrenaufnahme 55
2.16. Verwendete Software 55
3. Ergebnisse 56
3.1. Epitopanalyse mittels „Gene-Fragment Phage Display“ 56 3.2. MMP-19 Expression in Spondoptera frugiperda (Sf9)-Zellen 56 3.3. Nachweis der Monoklonalität der verwendeten Antikörper 58
Inhaltsverzeichnis
3.4. Experimente mit rekombinantem His-MMP-19(RS) Fusionprotein 59 3.4.1. Expression und Reinigung von His-MMP-19(RS) 59 3.4.2. Der Einsatz von Epitop-Extraktion und –Excision zur Epitopanalyse 61 3.4.3. Kombination verschiedener Methoden zur Epitopanalyse: Proteolyti-
scher Abbau von rekombinantem His-MMP-19, HPLC, Dot Blot und MALDI-MS
63 3.5. Neue Konstrukte von Oligohistidin-getagten MMP-19 Fragmenten 64
3.5.1. Klonierung von MMP-19 Fragmenten 64
3.5.2. Darstellung der MMP-19 Fragmente 64
3.5.3. Expression und Reinigung der rekombinanten MMP-19 Fragmente 66 3.5.4. Charakterisierung der MMP-19 Fragmente (pET-Fragmente) 67 3.5.5. Immunologische Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern 72
3.5.5.1. Untersuchungen im Immunoblot 72
3.5.5.2. Untersuchungen im ELISA 73
3.6. Verwendung synthetischer Peptide zur Epitopkartierung der anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper
76
3.6.1. Entwurf der synthetischen Peptide 76
3.6.2. Charakterisierung der Peptide 77
3.6.3. Peptid-ELISA 78
3.6.4. Inhibitions-ELISA 81
3.6.5. Das Epitop des monoklonalen Antikörpers CK8/4 83 3.6.6. Sind die anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper spezifisch für
MMP-19?
84
3.7. Expression von MMP-19 in humanem Gewebe 85
3.8. Charakterisierung von Autoantikörpern gegen MMP-19 87
3.9. Ist MMP-19 in RA-Seren vorhanden? 89
4. Diskussion 91
4.1. Der Einsatz des „Gene Fragment Phage Display“ zur Epitopanalyse 91
4.2. MMP-19 Expression in Sf9-Zellen 92
4.3. Der Einsatz massenspektrometrischer Methoden zur Epitopanalyse: Epitop- Excision und Epitop-Extraktion
93 4.4. Die Epitope der anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper 94
4.5. MMP-19 Expression in humanem Gewebe 98
4.6. Die humorale Autoimmunantwort gegen MMP-19 101
4.7. Vorkommen von MMP-19 im Serum 102
4.8. Ausblick
5. Zusammenfassung 103
6. Literaturverzeichnis 105
7. Anhang 120
7.1. Aminosäuresequenzen der pET-Fragmente 1 bis 5 120
7.2. Zugeordnete Massen der In-Gel Abbauten der pET-Fragmente 1, 2 und 3 121
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1. Domänenstruktur der Matrix-Metalloproteinasen 2 Abb. 1.2. Schematische Darstellung der Domänenstruktur von MMP-19 15 Abb. 1.3. Schematische Darstellung des Prinzips der Epitop Extraktion und
Excision zur massenspektrometrischen Analyse von Epitopen
23 Abb. 2.1. Aminosäuresequenz des Fusionsproteins His-MMP-19(RS) 26 Abb. 2.2. Prinzip der Panning Verfahrens nach Blüthner et al. (1996) 37 Abb. 2.3. Schematische Darstellung der Domänenstruktur der pSM-Plasmide 45 Abb. 2.4. Schematische Darstellung der MALDI-Massenspektrometrie 54 Abb. 3.1. Kontroll-PCR mit rekombina nter Baculovirus-DNA 57 Abb. 3.2. Immunoblot mit Baculovirus infizierten Sf9-Kulturmedien, bzw. Sf9-
Zelllysaten
58 Abb. 3.3. IEF der gereinigten monoklonalen Antikörper CK7/5, 8/2, 8/3, 8/4
und 8/6
59 Abb. 3.4. Ni-affinitätschromatographisch gereinigtes His-MMP-19(RS) aufge-
trennt auf einem 10%igem SDS-Gel
60 Abb. 3.5. MALDI-Spektren der Epitop-Excisions Experimente mit den mono-
klonalen Antikörpern CK7/5 und CK8/2 (C) und CK8/4 (A, B).
62 Abb. 3.6. Analytischer Restriktionsverdau der pET-Fragmente 1 bis 6 mit
EcoR1 und XhoI
64 Abb. 3.7. Schematische Darstellung der pET-Fragmente 1 bis 6 65
Abb. 3.8. Aminosäuresequenz pET-Fragment 6 66
Abb. 3.9. Expression und Reinigung der pET-Fragmente 67 Abb. 3.10.1. MALDI Spektrum eines In-Gel Abbaus des pET-Fragments 1 68 Abb. 3.10.2. MALDI Spektrum eines In-Gel Abbaus des pET-Fragments 2 69 Abb. 3.10.3. MALDI Spektrum eines In-Gel Abbaus des pET-Fragments 3 69 Abb. 3.10.4. MALDI Spektrum des In-Gel Abbaus des pET-Fragments 4 70 Abb. 3.10.5. MALDI Spektrum des In-Gel Abbaus des pET-Fragments 5 71 Abb. 3.10.6. MALDI Spektrum des In-Gel Abbaus des pET-Fragments 6 71
Abb. 3.11. Immunoblot der pET-Fragmente 1, 2 und 3 73
Abb. 3.12. pET-Fragmente ELISA 75
Abb. 3.13. Hydrophobizitätsblot von pET-Fragment 6 78
Abb. 3.14. ELISA mit den synthetischen Peptiden MK-P1 und MK-H (A,B) bzw. MK-P1, MK-P2 und MK-H (C-F)
79 Abb. 3.15. ELISA mit den synthetischen Peptiden MK-Z1 (A) und MK-Z2 (B) 81
Abb. 3.16. Inhibitions-ELISA (MK-P1) 82
Abb. 3.17. Inhibitions-ELISA (MP-H) 83
Abb. 3.18. Aminosäuresequenz von MK-P1 und MK-P2 83
Abb. 3.19. Sequenzvergleich des MMP-19 Partialpeptids, MK-P1, mit verschie- denen MMPn
85
Abb. 3.20. Immunhistochemie humaner Haut mit CK 8/4 86
Abb. 3.21. Immunhistochemie von Uterusgewebe 87
Abb. 3.22. Graphische Darstellung der Erkennung der Fragmente 1, 2 und 3 durch 20 verschiedene anti-MMP-19 positive Seren von RA- Patienten
88
Abbildungsverzeichnis
Abb. 3.23. Exemplarische MMP-19-Standardkonzentrationskurve eines Sand- wich-ELISAs
90 Abb. 4.1. Schematische Darstellung der Epitopbereiche der anti-MMP-19
monoklonalen Antikörper
95
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab. 1.1. Übersicht über die MMP-Subklassen und ihren Mitgliedern 5 Tab. 1.2. Physiologische und pathologische Prozesse bei denen MMPn beteiligt
sind
10 Tab. 2.1. FUSE-5 Oligonukleotide (Blüthner et al. 1996) 35 Tab. 2.2. Verwendete Oligonukleotidprimer des Baculovirus Expressionssystem 39 Tab. 2.3. Darstellung der pSM-Plasmide samt ihrem Vektor und der repräsen-
tierten MMP-19 Domänen
44 Tab. 2.4. Aminosäuresequenz der MMP-19 Partialpeptide 51
Tab. 2.5. Zusammenfassung der verwendeten Proteasen 52
Tab. 3.1. Isoelektrische Bereiche der anti-MMP-19 Antikörper 59 Tab. 3.2. pET-Fragmente: Domänenzuordnung, Größe = Anzahl der Aminosäu-
ren (aa), berechnetes Molekulargewicht in Dalton, berechneter Extink- tionskoeffizient (ε)
65 Tab. 3.3.1. Identifizierte Massen des In-Gel Abbaus mit Schweinetrypsin des pET-
Fragments 1
68 Tab. 3.3.2. Identifizierte Massen des In-Gel Abbaus mit Rindertrypsin des pET-
Fragments 2
69 Tab. 3.3.3. Identifizierte Massen des In-Gel Abbaus mit Schweinetrypsin des pET-
Fragments 3
70 Tab. 3.3.4. Identifizierte Massen des In-Gel Abbaus des pET-Fragments 4 70 Tab. 3.3.5. Identifizierte Massen des In-Gel Abbaus des pET-Fragments 5 71 Tab. 3.3.6. Identifizierte Massen des In-Gel Abbaus des pET-Fragments 6 71 Tab. 3.4. Zusammenfassung der Ergebnisse der Reaktivität der anti-MMP-19
monoklonalen Antikörper gegen die pET-Fragmente 1 bis 6
76 Tab. 3.5. Zuordnung der MMP-19 Partialpeptide in die Proteinsequenz von
MMP-19 und verschiedener MMP-19 Kontrukte
77 Tab. 3.6. Zusammenfassung der Ergebnisse der Reaktivität der anti-MMP-19
monoklonalen Antikörper gegen die verschiedenen synthetischen MMP-19 Partialpeptide
81 Tab. 3.7. Zusammenfassung der Reaktivität der Seren von RA Patienten gege n-
über den pET-Fragmenten 1, 2 und 3
88
Einleitung
1. Einleitung
1.1. Die Familie der Matrix-Metalloproteinasen (MMPn):
Struktur und Regulation
Matrix-Metalloproteinasen (MMPn) sind eine Familie Zink-bindender Endoproteinasen, welche die verschiedenen Bestandteile der Extrazellulären Matrix (ECM) spalten, abbauen und umwandeln können. Die Mitglieder dieser Enzymfamilie haben viele strukturelle und funktionelle Gemeinsamkeiten, unterscheiden sich aber oftmals in ihrer Substratspezifität (Birkedal-Hansen et al. 1993; Corcoran et al. 1995; Goetzl et al. 1996). Mittlerweile sind über 20 verschiedene Matrix-Metalloproteinasen bekannt und es kommen regelmäßig neue hinzu.
Proteasen, Exo- und Endopeptidasen, werden aufgrund ihrer katalytischen Gruppe im akti- ven Zentrum in vier verschieden Gruppen unterteilt. Dies sind Serin/Threonin-, Cystein-, Aspartat- und Metalloproteasen, zu den letztgenannten zählen die Matrix- Metalloproteinasen (Woessner 1998).
Matrix-Metalloproteinasen werden aufgrund ihrer funktionellen und strukturellen Eigen- schaften der Familie der Matrixine zugeordnet (Woessner 1991, 1994; Jiang und Bond 1992), die zur Überfamilie der Metzincine gehört. Metzincine besitzen, neben einer typi- schen Zinkbindestelle einen carboxyterminal dieser Bindestelle liegenden konservierten, Struktur-bildenden Metheoninrest, den sogenannten „met-turn“ (Bode et al. 1993, 1994).
Woessner (1994) beschreibt verschiedene Kriterien, die ein Enzym der Familie der Matri- xine zuordnen. Dazu gehören neben einer Konsensussequenz für die Zinkbindung (HEXGHXXGXXHS/T) und einer konservierten Sequenz innerhalb des Propeptids (PRCGxPD), die Fähigkeit proteolytisch zu wirken sowie die Funktionen des Enzyms au- ßerhalb der Zelle.
1.1.1. Die Domänenstruktur
Die Mitglieder der Familie der Matrix-Metalloproteinasen (MMPn) besitzen eine charakte- ristische Domänenstruktur aufgrund derer sie in verschiedene Typen unterteilt werden können. Nicht jede Matrix-Metalloproteinase besitzt jede dieser Domänen. Beginnend vom
Einleitung
Aminoterminus treten folgende Domänen auf: Signalpeptid, Propeptid, Furin- Erkennungssequenz, katalytische Domäne, Fibronektin-ähnliche Domäne, Hingeregion, Hämopexin-ähnliche Domäne und Transmembrandomäne. Bei manchen MMPn tritt eine zusätzliche Domäne auf, die keine Homologie zu anderen Strukturen aufweist (Woessner 1998). Abbildung 1.1. zeigt die unterschiedliche Anordnung der Domänen bei den ver- schiedenen Mitgliedern der MMP-Familie.
Minimaldomänen Matrix-Metalloproteinase
Matrix-Metalloproteinasen mit Hämopexin-ähnlicher Domäne
Matrix-Metalloproteinasen mit Fibronektin-ähnlicher Domäne Matrilysin
Kollagenasen, Stromelysine, Metalloelastase, Enamelysin MMP-19
Stromelysin-3
Matrix-Metalloproteinasen mit Transmembrandomäne
Matrix-Metalloproteinasen ohne Signalsequenz
Gelatinase A Gelatinase B
MT1, 2 und 3-MMP MT4-MMP
?
MMP-23
MMP-21, MMP-22
katalytische Domäne Signalpeptid Propeptid
Furin-Erkennungssequenz Fibronektin-ähnliche Domäne
Hämopexin-ähnliche Domäne
IL1R-ähnliche Domäne Hingeregion
Transmembrandomäne
Typ V Kollagen ähnliche Domäne MMP-19 Domäne ohne Homologie Domäne ohne Homologie
Abb.1.1.: Domänenstruktur der Matrix-Metalloproteinasen. Modifiziert und ergänzt nach Tschesche und Farr (1998).
Das Signalpeptid besteht aus 17 bis 20 hauptsächlich hydrophoben Aminosäuren und dient der Sekretion des Proteins in das Endoplasmatische Reticulum und dem anschließenden Export aus der Zelle (Woessner 1998). Mit Ausnahme von MMP-17 (Puente et al. 1996),
Einleitung
MMP-21 und-22 (Gururajan et al. 1998) und MMP-23 (Velasco et al. 1999), besitzen alle MMPn diese Sequenz.
Das ca. 80 Aminosäuren lange Propeptid besitzt C-terminal die hochkonservierte Autoin- hibitorsequenz PRCXXPD, deren Cysteinrest das Zinkion der katalytischen Domäne bin- det. Das Enzym wird durch diesen sogenannten „Cystein-switch“ in seiner latenten Form gehalten (Van Wart und Birkedal-Hansen 1990; Woessner 1994; Becker et al. 1995).
Durch die Cystein-Zink-Bindung wird das Propeptid über die katalytische Domäne gefaltet und somit das aktive Zentrum maskiert (Springman et al. 1990; Van Wart und Birkedal- Hansen 1990). Auch wird durch die Wechselwirkung des Cysteins mit dem Zink des kata- lytischen Zentrums ein für die Katalyse notwendiges Wassermolekül verdrängt, welches der vierte Substituent für das aktive Enzym ist (Vallee et al. 1990). Dieses Cystein wird, mit Ausnahme von MMP-21 und MMP-22 (Gururajan et al. 1998), in allen MMPn gefun- den (Woessner 1998). Eine proteolytische Abspaltung des Propeptids führt zu einer Akti- vierung der Ma trix-Metalloproteinase (Nagase 1997).
Alle membranständigen MMPn, MMP-11 und –23 besitzen eine Furin-Erkennungssequenz mit der Konsensussequenz RXKR/RRKR, die eine intrazelluläre Spaltung und damit höchstwahrscheinlich auch die Aktivierung durch Furin bewirkt (Woessener 1998; Velasco et al. 1999). Das Enzym wird dabei in der Mitte des Propeptids gespalten, was zu einer autokatalytischen Spaltung des verbleibenden Enzyms führt (Woessner 1998).
Die ca. 170 Aminosäuren lange katalytische Domäne enthält Bindestellen sowohl für Cal- ciumionen als auch für ein strukturelles und ein katalytisches Zinkatom (Woessner 1994, 1998). Diese Domäne besitzt ein fünfblättriges β–Faltblatt, drei α–Helixes und überbrük- kende Schleifen (Dhanaraj et al. 1996). Das aktive Zentrum des Enzyms wird durch die bereits erwähnte hochkonservierte Konsensussequenz HEXGHXXGXXHS/T gestaltet (Matrisian 1990; Woessner 1991). Die Bindung des katalytischen Zinkatoms kommt durch die in dieser Sequenz enthaltenen 3 Histidinreste zustande (Birkedal-Hansen et al. 1993;
Woessner 1994).
Die Fibronektin-ähnliche Domäne liegt innerhalb der katalytische Domäne und ist an der Bindung der Gelatinasen (MMP-2 und MMP-9) an Gelatin beteiligt (Collier et al. 1992;
Strongin et al. 1993; Woessner 1998).
Einleitung
Die variable Hingeregion ist eine Art Linkerregion und verbindet die katalytische mit der Hämopexin-ähnlichen Domäne. Sie kann bis zu 75 Aminosäuren lang sein, ist sehr reich an Prolinresten und bewirkt eine Rückfaltung der C-terminalen Hämopexin-ähnlichen Domäne auf die katalytische Domäne (Woessner 1994).
Die ca. 210 Aminosäuren lange Hämopexin-ähnliche Domäne besteht aus 4 Einheiten, die eine starke Ähnlichkeit mit Hämopexin und Vitronectin aufweisen (Jenne und Stanley 1987). Am Ende jeder Einheit befindet sich ein Cysteinrest. Zwischen diesen Cysteinresten bilden sich Disulfidbrücken was dazu führt, dass sich die Einheiten so falten, dass eine Art 4-blättrige Propellerstruktur entsteht, wobei jedes Blatt aus vier antiparallelen β- Faltblättern und einer α-Helix besteht (Gomis-Rüth et al. 1996, Woessner 1998). Die Funktion dieser Domäne liegt sehr wahrscheinlich in der Definition der Substratspezifität der Enzyme (Birkedal-Hansen et al. 1993). Matrilysin und Makrophagen Elastase sind auch ohne diese Domäne enzymatisch aktiv (Woessner 1994). Wird diese Domäne bei der interstinellen Collagenase entfernt, so besitzt dieses Enzym weiterhin eine gute katalyti- sche Aktivität, verliert jedoch die Fähigkeit, die Triplehelix von Collagen abzubauen (Woessner 1994). Entsprechendes konnte auch für die Neutrophilen-Collagenase gezeigt werden (Knäuper et al. 1993). Wenn die Hämopexin-ähnliche Domäne der interstinellen Collagenase mit der katalytischen Domäne von Stromelysin-1 verbunden wird, kann diese Stromelysin-1-Chimäre zwar an Collagen binden, es aber nicht abbauen (Murphy et al.
1992).
Die Hämopexin-ähnliche Domäne vermittelt auch die Bindung der TIMPs (tissue inhibi- tors of matrix-metalloproteinases) an das aktive Zentrum und spielt daher eine Rolle in der Regulation der Aktivität der MMPn (Murphy et al. 1992).
Die Funktion der MMP-19 spezifischen C-terminalen Domäne ist bisher nicht bekannt.
Die von Gururajan und Kollegen (1998) isolierten MMP-21 und MMP-22 haben keine Hämopexin-ähnliche Domäne. Hier folgen auf die katalytische Domäne eine Cystein- reiche und, je nach Spliceform auch eine Prolin-reiche, eine IL-1Rezeptor-ähnliche und eine wahrscheinliche Transmembran- und cytoplasmatische Domäne( s. Abb. 1.1.).
Die zuletzt isolierte Matrix-Metalloproteinase MMP-23 wurde aus einer ovariellen c- DNA-Bank kloniert und besitzt ebenfalls keine Hämopexin-ähnliche Domäne, sondern
Einleitung
eine kurze C-terminale Domäne, die keine Ähnlichkeit mit Hämopexin besitzt (Velasco et al. 1999).
1.1.2. Die Unterfamilien der Matrix-Metalloproteinasen
Die Mitglieder der Matrix-Metalloproteinasen Familie besitzen neben den Trivialnamen auch jeweils eine spezifische MMP-Nummer. In Tabelle 1.1. ist eine Übersicht über die bisher bekannten Familienmitglieder dargestellt. Die Zugehörigkeit in eine bestimmte Un- tergruppe wird durch verschiedene Kriterien bestimmt, hierzu gehören Sequenzhomologi- en, ähnliche Domäne nstruktur und Substratspezifität.
Bezeichnung MMP Nummer Mr latent/aktiv Bemerkungen Collagenasen
Collagenase 1 MMP-1 52,000 / 42,000 Interstitielle Collagenase Collagenase 2 MMP-8 85,000 / 64,000 Neutrophile Collagenase Collagenase 3 MMP-13 52,000 / 42,000 Interstitielle Collagenase, Nager Collagenase 4 MMP-18 53,000 / 42,000
Gelatinasen
Gelatinase A MMP-2 72,000 / 66,000 Typ IV Collagenase Gelatinase B MMP-9 92,000 / 84,000 Typ V Collagenase Stromelysine
Stromelysin 1 MMP-3 57,000 / 45,000 Transin
Stromelysin 2 MMP-10 54,000 / 44,000 Transin-2
Stromelysin 3 MMP-11 64,000 / 46,000 Membranständige
MMPn
MT1-MMP MMP-14 66,000 / 54,000
MT2-MMP MMP-15 72,000 / 60,000
MT3-MMP MMP-16 64,000 / 53,000
MT4-MMP MMP-17 57,000 / 53,000
Andere MMPn
Matrilysin MMP-7 28,000 / 19,000 keine Hämopexin-ähnliche Domäne
Metalloelastase MMP-12 54,000 / 22,000 Makrophagen Elastase
Rasi1 MMP-19 58,000 / 45,000
Enamelsin MMP-20 54,000 / 22,000 MMPn ohne Signal-
peptid
MMP-21 MMP-22
MMP-23 44,000
Tab. 1.1.: Übersicht über die MMP-Subklassen und ihren Mitgliedern. Die meisten der angegebenen Molekulargewichte leiten sich von der cDNA und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz ab und können sich durch Glykosilierung erhöhen. Die Molekulargewichte der aktivierten MT-MMP sind von der Furinspalt- stelle abgeleitet.
Modifiziert und erweitert nach Woessner (1998).
Einleitung
1.1.3. Die Regulation der Expression und der Aktivität von Matrix- Metalloproteinasen
In den meisten Zellen, neutrophile Granulocyten und Makrophagen ausgenommen, exi- stiert kein Vorrat an MMPn. Diese werden nur dann synthetisiert und sezerniert, wenn die Zelle spezifische Signale erhält (Woessner 1991). Unphysiologisch aktivierte, bzw. fehlre- gulierte MMPn können zu einer ungewollten Zerstörung von Gewebe und damit zu einem pathologischen Geschehen führen. MMPn müssen also streng reguliert sein. Diese Regula- tion erfolgt sowohl auf Ebene der Genexpression, als auch durch Kontrolle der proteolyti- schen Aktivität der Proteine. So wird ein Gleichgewicht aus latenten, d.h. inaktiven, akti- vierten und inaktivierten Enzymen hergestellt.
MMPn werden als latente Proenzyme sezerniert. Nach der Sekretion erfolgt eine strikt re- gulierte Prozessierung und Aktivierung. Aktivierte MMPn können durch ebenso strikt re- gulierte Prozesse inaktiviert, bzw. gehemmt werden. Die Regulation der sezernierten MMPn ist also sehr ko mplex.
Die meisten MMPn-Gene sind induzierbar. Die Genexpression kann durch Wachstums- faktoren, bestimmte Cytokine, verschiedene chemische Reagenzien wie z.B. Phorbolester, physikalischen Stress und zelluläre Transformation bei Krebs hochreguliert und durch Faktoren wie z.B. Glucocorticoide, Retinolsäure, Progesteron, TGF-β, IFN-β und -γ, run- terreguliert werden (Matrisian 1990; Birkedal-Hansen 1993b; Vincenti et al. 1994; Goetzl et al. 1996; Nagase 1996). TNF-α und Il-1 werden häufig als Hauptstimulatoren der MMPn-Synthese erwähnt (Feldmann 1996; Krane 1994; Birkedal-Hansen 1993b), aber auch Wachstumsfaktoren wie EGF (epidermal growth factor) und PDGF (platelets-derived growth factor) induzieren die MMPn-Synthese (Birkedal-Hansen 1993b; Vincenti et al.
1994; Goetzl et al. 1996).
Aber nicht nur lösliche Faktoren, sondern auch Zell-Matrix und Zell-Zell Interaktionen können in die Genexpression eingreifen. So wird die Expression von MMP-1, MMP-2 und MMP-3 in Fibroblasten durch EMMPRIN (M6 Antigen oder Basigin), einem Mitglied der Immunglobulin Familie, das auf T-Lymphomazellen exprimiert wird, induziert (Guo et al.
1997). MMP-2 wird in T-Zellen durch die Adhäsion des VLA-4 (very late antigen 4) an VCAM-1 (vacsular cell adhesion molecule-1) von Endothelzellen induziert (Romanic und Madri 1994). MMP-9 wird in Monozyten durch die gp39-CD40 Interaktion von aktivierten T-Zellen (Malik et al. 1996) und während der Differenzierung von Makrophagen durch die
Einleitung
Interaktion von α5β1 Integrin mit Fibronektin induziert (Xie et al. 1998), um nur einige Beispiele zu nennen. Arner und Tortorella (1995) zeigten anhand von RGD Sequenz ent- haltenden Peptiden, welche die Bindung an den Integrin Rezeptor vermittelt, und anhand von Fibronectin Fragmenten, dass eine Signaltransduktion durch Integrin Rezeptoren in Chondrocyten die Synthese von Stromelysin induziert. Dies geschieht wahrscheinlich, in- dem Il-1 hochreguliert wird, was wiederum die Expression von Integrin Rezeptoren erhöht.
Auf transkriptioneller Ebene spielen die Proto-Oncogene c-Jun und c-Fos, deren Expressi- on durch Il-1 und TNF-α induziert wird, eine wichtige Rolle (Matrisian 1990; Woessner 1991; Corconan et al. 1995). In die zugehörige Signaltransduktionskaskade ist die Pro- teinase C involviert (Birkedal-Hansen 1993b). C-Jun und c-Fos bilden dabei Homo- oder Heterodimere (AP-1) und binden als solche an die TRE/AP-1 Bindestelle im Promotorbe- reich verschiedener MMPn-Gene. Dies allein reicht aber nicht zur Induktion der Tran- skription dieser Gene aus. Hier ist die Koinduktion durch weitere Faktoren notwendig (Birkedal-Hansen 1993b; Krane 1994).
Abgesehen von den wenigen Furin-aktivierten Mitgliedern der MMPn Familie werden die meisten MMPn als inaktive Zymogene sezerniert. Die sezernierten Proenzyme werden in vitro durch Proteinasen und nicht proteolytische Agenzien, wie denaturierende oder SH- reaktive Agenzien oder reaktiver Sauerstoff aktiviert (Nagase und Woessner 1999). In al- len Fällen ist die Zerstörung der Cystein-Zink Interaktion eine Vorraussetzung für die Ak- tivierung. Die dazu nötige Abspaltung des Propeptids verläuft schrittweise (Nagase 1997).
Verschiedene Proteasen wie Cathepsin B, Cathepsin C, Plasmin und Urokinasetyp Plasmi- nogen Aktivator (uPA) und Elastase sind am Aktivierungsprozess beteiligt (Murphy et al.
1992; Kleiner 1993; Matrisian 1990). Das uPA/Plasmin-System scheint in pathophysiolo- gischen Prozessen eine Rolle bei der Aktivierung von Pro-MMPn zu spielen (Carmeliet et al. 1997). MMPn selbst spielen dabei jedoch auch eine Rolle, indem sie sich selbst auto- katalytisch aktivieren oder proteolytisch auf andere MMPn wirken. So bewirkt z.B. Stro- melysin die völlige Aktivierung der zuvor durch andere Mechanismen teilweise aktivierten interstitiellen Collagenase (Corcoran 1995). Eine Membranassoziation bestimmter MMPn ist wichtig für deren Aktivierungsprozess (Vassalli et al. 1994).
So wird Pro-MMP-2 auf der Zelloberfläche aktiviert. Sato und Kollegen (1994) konnten das erste Mitglied der membranständigen MMPn (MT1-MMP) klonieren und zeigen, dass Pro-MMP-2 durch MT1-MMP aktiviert wird. Aber nicht nur aktive, sondern auch TIMP-2
Einleitung
gebundene MT1-MMP wird für diese Aktivierung benötigt (Strongin et al. 1995; Butler et al. 1998; Kinoshita et al. 1998). TIMP-2 bindet hier mit seiner C-terminalen Domäne an die Hämopexin ähnliche Domäne von Pro-MMP-2, was eine Lokalisierung des latenten Zymogens in die Nähe von MT1-MMP bewirkt (Butler et al. 1998). TIMP-1 ist hier also nicht als Inhibitor wirksam, sondern ist substantieller Teil des Aktivierungsprozesses.
Oberflächengebundene Pro-MMP-2 kann alternativ durch das oberflächenassoziierte uPA/Plasmin System aktiviert werden (Mazzieri et al. 1997).
MMPn können durch verschiedene Inhibitoren gehemmt werden. Hierzu gehört das α2- Makroglobulin, welches MMPn kovalent bindet und die bereits erwähnten MMP- spezifischen TIMPs (Murphy et al. 1992; Vincenti 1994). TIMPs sind die endogenen Hauptregulatoren der MMP-Aktivität. Bis heute konnten 4 Homologe identifiziert werden (Gomez et al. 1997). TIMPs binden nicht kovalent an aktive oder auch inaktive MMPn.
Der Komlex von TIMP-1 und der katalytischen Domäne von MMP-3 konnte von Gomis- Rüth und Kollegen (1997) kristallisiert werden. Die kritischen Aminosäurenreste die an der MMP Inhibition beteiligt sind, lassen sich in der Region der Disulfidbrücke zwischen den Cysteinen an Position 1 und 70 lokalisieren. Sowohl die Carboxyl- als auch die Amino- gruppe ihrer N-terminalen Aminosäure interagieren direkt mit dem katalytischen Zinkion und verhindern damit die Bindung des für die Katalyse notwendigen Wassermoleküls. Die ersten fünf Aminosäuren des N-Terminus von TIMP-1 binden an das aktive Zentrum der MMPn. Diese Bindung entspricht der Substratbindung. Ähnliches wurde auch für die Bin- dung und damit die Hemmung von MMPn durch TIMP-2 gezeigt (Tuuttila et al. 1998).
Neben der Inhibition von aktivierten MMPn und der Beteiligung an der Aktivierung von Pro-MMPn, haben TIMPs noch weitere physiologische Funktionen: Sie sind ebenfalls an der Matrix-Bindung, der Förderung des Zellwachstums, der Inhibition der Angiogenese und der Induktion der Apoptose beteiligt (Brew et al. 2000).
Einleitung
1.2. Die physiologische und pathophysiologische Funktion von Matrix- Metalloproteinasen
Die Aufrechterhaltung der Integrität der extrazellulären Matrix (ECM) ist unabdingbar für einen gesunden, funktionstüchtigen Organismus. Die ECM besteht aus verschiedenen Komponenten. Neben Proteoglykanen sind diverse Faserproteine vorhanden. Die Faser- proteine lassen sich in Strukturproteine, wie Elastin und Collagen, und Adhäsionsmolekü- le, wie Laminin oder Fibronektion unterteilen. Die verschiedenen Makromoleküle der ECM werden von den in sie eingebetteten Zellen, meist spezialisierte fibroblastenartige Zellen, wie z.B. Chondroblasten im Knorpel oder Osteoblasten im Knochen, sezerniert (Mosher et al. 1992).
Die ECM ist kein festes und starres Gebilde, sondern befindet sich ständig im Umbau. Sie wird, je nach Situation, auf-, um- oder auch abgebaut. Für die Degradation und damit für die Reorganisation der ECM sind bis heute fünf verschiedene Wege bekannt (Birkeldal- Hansen et al. 1993). Dies sind der sogenannte osteoklastische, der phagozytotische, der Plasmin-abhängige, der Serinproteinasen-abhängige und der MMPn-abhängige Stoffwech- selweg (Birkeldal-Hansen et al. 1993). Welcher Stoffwechselweg zum Einsatz kommt, hängt von vielerlei Faktoren, wie z.B. der Matrixstruktur, ab. In jedem Fall ist ein erster extrazellulärer Fragmentierungsschritt für den weiteren proteolytischen Abbau von festen Matrixkomponenten notwendig (Birkeldal-Hansen et al. 1993).
Aufgrund ihrer Fähigkeit die unterschiedlichen Bestandteile der ECM abzubauen, spielen die Mitglieder der Matrix-Metalloproteinasen Familie bei vielen normalen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen eine meist wichtige, wenn nicht zentrale, Rolle. In Tabelle 1.2. ist eine Auflistung dieser Prozesse dargestellt.
Einleitung
Physiologisch Pathologisch
Entwicklung Gewebszerstörung
Implantation des Blastozyten Embryonale Entwicklung Nervenwachstum
Knorpelabbau in Wachstumsplatten Skelett- und Knochenwachstum Zahnschmelzreifung
Zahnbildung
Rheumatoide Arthritis Osteoarthritis
Krebsinvasion Metastasierung Dekubitusgeschwür Magengeschwür Korneageschwür
Peridontale Erkrankungen
Reproduktion Fibrotische Erkrankungen
Endometriotische Zyklus Ovulation
Luteolyse
Dilatation der Zervix
Postpartum Uterusrückbildung Morphogenese der Brustdrüse Rückbildung der Brustdrüse Umbau fötaler Membranen
Leberzirrhose
Fibrotische Lungenerkrankungen Otosklerose
Arthereosklerose Multiple Sklerose
Aufrechterhaltung Matrixschwäche
Knochenumbau
Zyklus der Haarfollikel Wundheilung
Angiogenese Apoptose
Nervenregeneration
Makrophagen Funktion (z.B. Migration) Neutrophilen Funktion (z.B. Migration)
erweiterte Kardiomyopathie Epidermolysis Bullosa Aortenaneurisma
Tab. 1.2.: Physiologische und pathologische Prozesse bei denen MMPn beteiligt sind (Woessner 1998).
1.2.1. Matrix-Metalloproteinasen bei der Rhe umatoiden Arthritis
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch, entzündliche Autoimmunerkrankung, die primär die Synovia der Gelenke betrifft und einen systemischen Charakter annehmen kann.
Es kommt zur Invasion von verdicktem Synovialgewebe, auch Pannus genannt, in das Ge- lenk. Dies führt dann zu einem progressivem Knorpel- und Knochenabbau, d.h. einem Ab- bau von Bestandteilen der ECM.
Dieser Abbau der ECM bei RA geschieht zu einem Großteil durch die Aktivität von Mit- gliedern der MMPn-Familie, damit spielen MMPn eine kritische Rolle in der Entwicklung von RA (Di Girolamo et al. 1996).
Die MMPn werden von aktivierten Makrophagen und Fibroblasten als Antwort auf pro- inflammatorische Cytokine, wie Il-1 und TNF-α, produziert (Feldmann et al. 1996b). In der Synovialflüssigkeit von Patienten mit RA oder Osteoarthritis sind, neben IL-1 auch
Einleitung
Integrin Rezeptor-bindende Adhäsionsmoleküle in erhöhtem Maß vorhanden. Signaltrans- duktion durch den Integrin Rezeptor induziert wiederum die Synthese von MMPn, was ein weiterer Hinweis auf ihre Rolle bei RA ist (Arner et al. 1995).
Verschiedene MMPn sind in der Synovialflüssigkeit von RA Patienten vorhanden. Es konnte ein hoher Gehalt an MMP-1, MMP-2, MMP-8, MMP-9 und vor allem MMP-3 in RA-Synovialflüssigkeit nachgewiesen werden (Yoshihara et al. 2000). MMP-3 wurde so- wohl in der Synovia, als auch in Chondrocyten durch Immunolokalisation nachgewiesen, Collagenase im Pannusgewebe von Ratten mit Collagen-induzierter Arthritis (Hasty et al.
1990). In Kultur gehaltene Chondrocyten erhöhen als Antwort auf Il-1 ihre Produktion an MMP-3 um das Dreifache, was sich auch auf mRNA Ebene zeigen lässt (Hasty et al.
1990). In Zell-Linien von Synoviagewebe von Patienten mit aktiver RA konnte die Ex- pression von interstitieller Collagenase und Stromelysin nachgewiesen werden (McCach- ren 1991). Auch ist in Synoviagewebskulturen von RA-Patienten deutlich mehr Stromely- sin-mRNA enthalten als in entsprechenden Kulturen von Patienten mit Osteoarthritis (Case et al. 1989). Neben diesen beiden Enzymen wurde auch die Expression von Collagenase-3 in der Synovialmembran (Wernicke et al. 1996) und die Existenz von aktiver Gelatinase-B (MMP-9) in der Synovialflüssigkeit (Koolwilk et al. 1995) von RA-Patienten, gezeigt.
MMP-13 (Collagenase 3) konnte sowohl mit RT-PCR, als auch durch immunhistochemi- sche Untersuchungen, in der Synovialmembran von RA-Patienten identifiziert werden (Moore et al. 2000).
Auch MT-MMPn sind an der Gelenkszerstörung bei RA maßgeblich beteiligt. Sowohl MT1-MMP, als auch MT3-MMP, werden in RA Synovialgewebe exprimiert, wobei MT1- MMP um das 11-fache mehr als MT3-MMP exprimiert wird (Yamanaka et al. 2000).
MT1-MMP trägt wesentlich zur Aktivierung von MMP-2 bei (s. Kapitel 1.1.3.). Yamanaka und Kollegen konnten zeigen, dass der Expressionslevel von MT1-MMP mit der Aktivie- rungsrate von Pro-MMP-2 korreliert. MT1-MMP spielt daher auch im rheumatoiden Synovialgewebe bei der Aktivierung von MMP-2 eine wichtige Rolle. Dies lässt darauf schließen, dass seine Aktivität in die RA assoziierte Gelenkszerstörung involviert ist.
MT1-MMP wird nicht nur in der Synovia exprimiert. Durch Immunhistochemie konnte MT1-MMP in Osteoklasten ähnliche Zellen nachgewiesen werden. MT1-MMP und auch MT3-MMP wurden in Fibroblasten, Makrophagen und Osteoklasten-ähnlichen Zellen de- tektiert. Dies deutet auf eine Kooperation zwischen diesen Zelltypen in der Degradation von Knorpel und Knochen hin (Pap et al. 2000).
Einleitung
Der Knorpelabbau bei RA durch MMPn kommt wahrscheinlich durch ein Ungleichgewicht in der Produktion von MMPn und den spezifischen TIMPs zustande (Feldmann et al. 1996;
Yoshihara et al. 2000). Die Balance zwischen der Expression von MMPn und TIMPs im Synovialgewebe von RA-Patienten ändert sich im Laufe der Entzündung: Bei starker Ent- zündung ist die Expression von TIMPs geringer als die der MMPn (McCachren 1991).
Firestein und seine Kollegen (1991) zeigten weiterhin, dass neben der Expression von Collagenase und TIMP, auch die von Komplementfaktoren und HLA-DR Genen mit dem Grad der Synovitis korreliert. Nach intraartikulärer Injektion von Corticosteroiden, die zu einer Abschwächung der Entzündung führt, ist weder Collagenase- noch TIMP-mRNA nachweisbar (Firestein et al. 1991).
Die wichtige Rolle der MMPn bei der RA assoziierten Gelenkszerstörung liefert neue The- rapieansätze. Der Einsatz von synthetischen MMP-Inhibitoren könnte bei RA zu einer verminderter Gelenkszerstörung und damit zu einem verbessertem Krankheitsbild führen.
1.2.2. Matrix-Metalloproteinasen bei Krebs
Die Degradation von Basalmembranen und ECM ist ein zentraler Prozess bei der Invasion, dem Wachstum und der Metastasierung von malignen Zellen. Für diese Prozesse ist auch die Bildung neuer Blutgefäße, d.h. die Angiogenese, von entscheidender Bedeutung.
Der Abbau der ECM wird von Proteinasen initiiert, die von verschiedenen, bei der Tumo- rinvasion beteiligten Zelltypen, sezerniert werden. Eine erhöhte Expression oder eine er- höhte Aktivität von Mitgleidern jeder der bekannten Klasse von Proteinasen, d.h. MMPn, Serin- Aspartat- und Cysteinproteinasen, ist an der Tumorinvasion und der Malignität eines Tumors beteiligt (Westermarck und Kähäri 1999).
MMPn spielen bei der Invasion, der Metastasierung und dem Wachstum von Tumorzellen, wie auch bei der Tumor Angiogenese eine bedeutende Rolle (Stetler-Stevenson et al. 1993;
Koop et al. 1994; Kim et al. 1998; Brooks et al. 1998). Eine verstärkte Expression von TIMPs durch Tumor- oder durch normale Zellen führt dagegen zu einer verringerten Inva- sion und zu einer verminderten Metastasierungsfähigkeit von transformierten Zellen (Kr u- ger et al. 1998; Ahonen et al. 1998). Dies ist ein weiterer Hinweis für die doch starke Be- teiligung von MMPn an all diesen Prozessen.
Einleitung
Die Verwendung von MMPn knock-out Mäusen lieferte weitere Erkenntnisse über die Rolle von MMPn bei Krebs. MMP-7 knock-out Mäuse besitzen eine verminderte interstiti- elle Tumorgenese (Wilson et al. 1997), MMP-11 defiziente Mäuse zeigen eine reduzierte Antwort auf chemische Mutagenese (Masson et al. 1998). MMP-2 knock-out Mäuse zei- gen wiederum eine verringerte Angiogenese und ein geringeres Tumorwachstum (Itoh et al. 1998).
In Tumorgeweben werden meist mehrere MMPn gleichzeitig exprimiert. So werden beim Coloncarzinom sechs verschiedene MMPn, Matrilysin (MMP-7), Fibroblasten Collagenase (MMP-1), zwei Gelatinasen (MMP-2 und –9) und Stromelysin-1 und –3 (MMP-3 und – 11), überexprimiert (Duncan et al. 1996).
Auch Melanomzellen können mehrere MMPn, MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13 und MT1-MMP, wie auch TIMP-1, TIMP-2 und TIMP-3 exprimieren (Übersicht in Hofmann et al. 2000). Auch Adhäsionsmoleküle wie CD44 und αvβ3 Integrin sind bei der Positionie- rung aktivierter MMPn auf die Zelloberfläche invasiver Tumorzellen involviert. Somit sind nicht nur das Gleichgewicht zwischen aktivierten MMPn und ihren TIMPs, sondern auch die Coexpression von aktivierten MMPn und Adhäsionsmolekülen wichtige Faktoren bei der Tumorinvasion, dem Tumorwachstum und der Metastasierung von Melanomzellen (Übersicht in Hofmann et al. 2000).
Wie bei der rheumatoiden Arthritis stellt auch hier der Einsatz von MMPn Inhibitoren ei- nen neuen und erfolgversprechenden Therapieeinsatz dar. Es werden verstärkt Studien betrieben, die zur Entwicklung von MMPn Inhibitoren führen sollen, welche sowohl bei Tumoren, als auch bei RA eine klinische Anwendung finden.
1.3. Die Matrix-Metalloproteinase-19 (Rasi-1)
Auf der Suche nach neuen Autoantigenen, die mit rheumatoider Arthritis (RA) assoziiert sind, wurde eine Expressions-cDNA-Bank aus der entzündeten Synovialmembran einer RA-Patientin hergestellt und mit autologen gereinigten IgG durchsucht. Dabei konnte eine neue Matrix-Metalloproteinase, die Matrix-Metalloproteinase 19 (MMP-19 oder auch Ra- si-1), als neues Autoantigen bei RA identifiziert werden (Mauch, Diplomarbeit 1996; Sed- lacek, Dissertation 1996; Sedlacek et al. 1998). Weitere Untersuchungen haben gezeigt,
Einleitung
dass 26% von RA-Patienten und 33% von Patienten mit systemischem Lupus Erythomato- des (SLE) Autoantikörper gegen MMP-19 besitzen (Sedlacek et al. 1998).
MMP-19 stellt damit die erste Matrix-Metalloproteinase und überhaupt die erste Protease dar, die als Autoantigen bei systemischen, rheumatoiden Autoimmunerkrankungen gefun- den wurde. Eine Immunantwort gegen ein Enzym, welches zu einer Proteinfamilie gehört, deren Mitglieder direkt an der Zerstörung von Gelenken und damit am Krankheitsgesche- hen beteiligt sind, lässt interessante Hypothesen zu. Vor allem die Hypothese einer gerich- teten Autoimmunantwort in Form eines Abwehr- oder auch Hilfsmechanismus gegen die Zerstörung von körpereigenem Gewebe, die durch körpereigene Substanzen verursacht wird, erscheint hier sehr attraktiv.
Die Matrix-Metalloproteinase 19 ist ein 508 Aminosäuren langes Enzym mit einem Mole- kulargewicht von ca. 58kD. Sie besitzt eine Signalsequenz, ein Propeptid, eine katalytische Domäne, eine Hämopexin-ähnliche Domäne und eine Hingeregion, die sich zwischen den beiden letztgenannten befindet, so dass MMP-19 eindeutig der Matrixinfamilie zugeordnet werden kann (Sedlacek et al. 1998). Neben den vier Membranständigen MMPn gehört MMP-19 zu den frühesten Zweigen der MMP-Familie (Woessner 1998).
Das Gen, das für MMP-19 kodiert, wurde auf dem Chromosom 12q14 lokalisiert, eine chromosomale Lokalisation, die für MMPn typisch ist, was eine Zuordnung zu der MMP- Familie ebenfalls rechtfertigt (Pendas et al. 1997). Es finden sich aber auch Sequenzab- schnitte, welche sich von anderen Mitgliedern der MMP-Familie unterscheiden, so dass sie das erste Mitglied einer neuen MMP-Subklasse darstellt (Pendas et al. 1997; Sedlacek et al. 1998).
So ist in der hochkonservierten Autoinhibitorsequenz innerhalb des Propeptids ein Valin durch ein Leucin und ein Prolin durch eine Glutaminsäure ersetzt (Sedlacek et al. 1998).
Ein Austausch des Prolins innerhalb dieser Sequenz kann drastische Auswirkungen auf die Latenz bzw. die Aktivität des Enzyms haben, wie für andere MMPn gezeigt wurde (San- chez-Lopez et al. 1988; Windsor et al. 1991; Park et al. 1991). So konnte Park und Kolle- gen (1991) durch Mutationsstudien zeigen, dass eine Modifikation des Prolins zu einer autoaktiven Form von MMP-3 führt.
Der Carboxy-Terminus enthält eine Threonin-reiche Sequenz von 37 Aminosäuren, von denen 27 keine Homologie zu anderen bekannten Proteinen zeigt (Sedlacek et al. 1998).
Einleitung
Auch die Hinge-Region unterscheidet sich von der anderer MMPn: Sie besitzt eine Prolin- reiche Sequenz welcher eine Oligo-Glutamin-Sequenz vorausgeht (Sedlacek et al. 1998).
Auch dieser Bereich zeigt keine Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen.
Eine schematische Darstellung der Domänenstruktur von MMP-19 ist in Abbildung 1.2.
gezeigt.
Abb. 1.2.: Schematische Darstellung der Domänenstruktur von MMP-19 (aus Sedlacek et al. 1998) Charakteristische MMP-19 Sequenzen sind gezeigt. Die ausgetauschten Aminosäuren innerhalb der Autoin- hibitor sind unterstrichen, konservierte Aminosäuren innerhalb der Zinkbindungsstelle fett gedruckt. Die Sequenz des synthetischen Peptides Pep21, das zur Herstellung polyklonaler Antikörper verwendet wurde, ist dargestellt.
Immunhistochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass MMP-19 im Synovium von RA-Patienten in der Tunica Media von Blutgefäßen lokalisiert ist. Dies steht im Gegensatz zum Expressionsmuster von Stromelysin 1, Gelatinase A und B, und der interstitionellen Collagenase. Es konnte dabei keine Kolokalisation mit TIMP-1 gefunden werden (C. Kolb et al. 1997). MMP-19 wird in Blutgefäßen entzündeter Synovia und nicht entzündeter Haut und Uterus gefunden, nicht aber in Synovia von Patienten mit Luxationen oder Arthritis (C. Kolb et al. 1997). Für immunhistochemische Färbungen von MMP-19 wurde ein poly- klonaler Kaninchen Antikörper verwendet, der gegen ein 21 Aminosäuren langes Peptid (Pep21, s. Abb. 1.2.) innerhalb der Hingeregion gerichtet ist. Diese Sequenz ist für MMP- 19 sehr spezifisch. Es konnte weiter gezeigt werden, dass MMP-19 in der glatten Musku- latur der Tunica Media, nicht aber in der Endothelzellschicht großer Blutgefäße eines RA- Patienten exprimiert wird (C. Kolb et al. 1999). MMP-19 ist in Kapillaren von akut ent- zündetem Synovialgewebe, bei gleichzeitiger Abwesenheit von TIMP-1, hoch exprimiert.
TIMP-1 wiederum ist in Gefäßen, die kein MMP-19 exprimieren, vorhanden. Dies konnte sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gezeigt werden konnte. Dies weist auf eine
Einleitung
regulierte Induktion von MMP-19 in Endothelzellen von Kapillaren in entzündetem Gewe- be und damit auf eine Rolle von MMP-19 bei der Angiogenese hi n (C. Kolb et al. 1999).
MMP-19 wird in mikrovaskulären Endothelzellen neu entstehender Gefäße reguliert ex- primiert, während makrovaskuläre Endothelzellen adulter Gefäße negativ für MMP-19 sind (Mauch, Dissertation 2000). Ein weiteres Indiz für die wichtige Rolle von MMP-19 bei der Angiogenese.
Die Expression von MMP-19 wird im Verlauf der Makrophagenentwicklung, induziert durch die gleichzeitige Zunahme der Zelladhäsion, hochreguliert, was auf eine mögliche Rolle von MMP-19 bei der Migration der Makrophagen durch das Gewebe hindeutet (Mauch, Dissertation 2000).
Kottinen und Kollegen (1999) konnten durch RT-PCR feststellen, dass MMP-19, neben MMP-2 und MMP-11 und im Gegensatz zu anderen MMPn, in der Synovialmembran ko n- stitutiv exprimiert wird. Dennoch scheint MMP-19 im Krankheitsbild der RA involviert zu sein. MMP-19 ist in der Lage zwei charakteristische Bestandteile der ECM, Aggrecan und COMP („cartilage oligomeric matrix protein“) des Knorpels in vitro zu spalten (Stracke et al. 2000).
Die Expression von MMP-19 mRNA ist relativ weit verbreitet. So konnte MMP-19 mRNA in humaner Placenta, Lunge, Pankreas, Ovarien, Milz und Darm nachgewiesen werden (Pendas et al. 1997). MMPn werden unter normalen Umständen nicht in reifen Zellen pro- duziert, sondern nur dann ,wenn eine Umwandlung des Bindegewebes notwendig ist, wie z.B. bei der Wundheilung, dem Knochenwachstums oder der Ovulation (Woessner 1991;
Matrisian 1992; Birkedal-Hansen et al. 1993; Stetler-Stevenson et al. 1993). Da MMP-19 in so vielen verschiedenen Geweben vorkommt, könnte das Enzym eine Rolle bei allen Umwandlungsprozessen der ECM dieser Gewebe spielen (Pendas et al. 1997).
Auch bei der Ovulation scheint MMP-19 eine Rolle zu spielen. Bei der Maus ist MMP-19 und auch TIMP-1 zum Zeitpunkt der Ovulation in den Follikelepithelzellen und in den bindegewebsartigen Thekazellen der großen präovulatorischen und der Ovulationsfollikel stark exprimiert. Dies deutet darauf hin, dass MMP-19 in den Gewebsabbau während der Follikelruptur involviert ist und TIMP-1 eine Rolle bei der Aufhebung der MMPn Aktivität nach der Ovulation spielt (Hägglund et al. 1999).
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1.4. Grundlagen und Struktur von Antigen-Antikörper Wechselwir- kungen
Verschiedene Methoden, wie z.B. Affinitätsmarkierung oder Röntgenstrukturanalysen von Immunkomplexen, haben in den letzten Jahren zu einem besserem Verständnis der Anti- gen-Antikörper Interaktion geführt.
Die Antigenbindungsstelle eines Antikörpers bildet sich aus den variablen Regionen so- wohl der schweren, als auch der leichten Kette. Die Aminosäuren der schweren und der leichten Kette, die an der Antigenbindungsstelle beteiligt sind, sind den hypervariablen Regionen (CDRs, „complementarity determining regions“) zuzuordnen. Diese befinden sich an den Enden der variablen Regionen und bilden dort Schleifen aus, welche durch das Zusammenlagern der variablen Region der leichten und schweren Kette zusammen ko m- men (Al-Lazikani et al. 1997). Sie bilden so die für die spezifische Erkennung von Antige- nen verantwortliche Antigenbindungsstellen. Jede der beiden Ketten besitzt 3 CDRs. Meist sind alle sechs an der Bindung an ein Proteinantigen beteiligt (Davies und Cohen 1996).
Bereiche eines Proteins, welche spezifisch von Antikörpern erkannt werden, nennt man antigene Determinanten oder auch Epitope. Sie bestehen aus einer definierten dreidime n- sionalen Struktur, die mit dazu komplementären Aminosäureresten des Antikörpers in Wechselwirkung treten (Colman et al. 1987). Man unterscheidet zwischen linearen oder auch kontinuierlichen und Konformations- oder diskontinuierlichen Epitopen (Atassi und Smith 1978; Atassi 1984). Erkennt ein Antikörper eine Folge von Aminosäuren, spricht man von linearen Epitopen. Bindet hingegen ein Antikörper an diverse Aminosäuren, die innerhalb der Primärsequenz nicht aufeinander folgen, sondern in einem nativen Protein durch Faltung in eine räumliche Nähe zueinander gelangen, so handelt es sich in solchen Fällen um konformationelle Epitope (Atassi und Saplin 1968; Amit et al. 1986).
Am besten lässt sich dies anhand folgendem exemplarischem Beispiel darstellen. Lyso- zym-Antikörper Kokristalle haben gezeigt, dass die Aminosäuren der antigenen Determi- nanten in diesem Fall von zwei unterschiedlichen Bereichen (aa 18-27 und aa 116-129) der Lysozym Primärsequenz stammen (Amit et al. 1986). Diese beiden Bereiche liegen auf der Proteinoberfläche dicht beieinander. Im Antigen-Antikörper Kontakt sind 16 Aminosäuren des Antigens und 17 Aminosäuren des Antikörpers, welche von allen 6 CDRs stammen, beteiligt (Amit et al. 1986).
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Die Antigenbindungsstelle eines Antikörpers kann als eine Art Tasche angesehen werden, in die sich das Epitop einfügt (Novotny et al. 1987). Es sind nur relativ wenige Aminosäu- reseitenketten der CDRs bei der Antigenerkennung beteiligt, jedoch können auch Seite n- kettenreste, die nicht innerhalb der CDRs liegen, an der Bindung beteiligt sein.
Innerhalb der CDRs wurden bestimmte Aminosäuren vermehrt gefunden. So wurden As- paragin und Histidin in einer achtfach und Tyrosin in einer dreifach höheren Konzentration als in anderen Regionen der variablen Regionen auf (Kabat et al. 1977, Padlan 1990). Da- neben wurden auch Tryptophan und Serin in höheren Konzentrationen gefunden (Mian et al. 1991).
Antikörper binden Proteinantigene über viele sterische und elektrostatische komplementäre Strukturen (Braden und Poljak 1995). Die Antigen-Antikörper Bindung ist nicht kovalent.
Es sind verschiedene charakteristische Kräfte an der Bindung beteiligt, welche den Anti- gen-Antikörper Komplex stabilisieren. Der Antigen-Antikörper Komplex befindet sich im Gleichgewicht mit den freien Komponenten. An den nicht kovalenten Kräften der Antigen- Antikörper Bindung sind hauptsächlich elektrostatische Wechselwirkungen zwischen gela- denen Aminosäureketten, Wasserstoffbrücken und van-der-Waals-Kräfte, aber auch hy- drophobe Wechselwirkungen beteiligt (Braden und Poljak 1995). Die Struktur des Epitops muss, im Falle der hydrophoben und der van-der-Waals-Kräfte, der des antigenbindenden Region des Antikörpers komplementär sein.
Bereits geringe Veränderungen in der Antigenstruktur können die Stärke der Antigen- Antikörper Interaktion wesentlich beeinflussen. So kann schon der Verlust einer Wasser- stoffbrücke oder der Austausch einer Aminosäure in der Binderegion zu einem drastischen Änderung der Bindungsstärke führen (Duncan et al. 1988).
Diese nicht kovalente und reversible Bindung eines Antikörpers an ein Antigen unterliegt damit thermodynamischen Prinzipien (Novotny et al. 1987). Die Affinität ist ein Maß für die Bindungsstärke eines Epitops an einen Antikörper und beschreibt im Normalfall den Antikörper-Antigen-Komplex, der im Gleichgewicht gefunden wird. Das bedeutet, dass hoch affine Antikörper in einer kürzeren Zeit mehr Antigen binden als nieder affine Anti- körper.
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1.5. Methoden der Epitopanalyse
Die Epitopanalyse, auch „epitope mapping“ genannt, ermöglicht verschieden Einsichten.
Die Identifizierung von immunogenen Determinanten von Autoantikörpern kann mehr und neue Einblicke in das zugehörige Krankheitsgeschehen liefern und damit neue Möglich- keiten in der Diagnostik oder der Krankheitsprognose eröffnen. Des weiteren können neue Ziele der Immunisierung oder der Immunsuppresion identifiziert werden.
Die Epitopanalyse monoklonaler Antikörper dient nicht nur deren Charakterisierung. Sie liefert Informationen über mögliche Kreuzreaktivitäten in immunologischen Tests. Dar- über hinaus ermöglicht sie auch Aussagen über Struktur-Wirkungsbeziehungen in biologi- schen Systemen. Inhibitorische monoklonale Antikörper sind in der Lage die Funktion eines Makromoleküls, wie z.B. Adhäsionsmoleküle oder die unterschiedlichsten Rezepto- ren, zu unterbinden. Ist die Epitopsequenz dieser inhibitorischen monoklonalen Antikörper identifiziert kann man Aussagen über die funktionellen Regionen dieses Makromoleküls machen.
Die Epitopanalyse monoklonaler Antikörper verläuft meist in zwei Schritten. Im ersten Schritt wird das Epitop einer, meist größeren, funktionellen oder strukturellen Domäne zugeordnet. Im zweiten Schritt wird die Epitopanalyse verfeinert, d.h. die tatsächliche Epitopsequenz wird auf möglichst wenige Aminosäuren bestimmt. Dies bedeutet, dass mindestens zwei oder noch mehr, Methoden zum Einsatz kommen.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten Epitope zu analysieren. Dies können einmal Bi n- dunsgstudien mit rekombinanten Proteinen oder synthetischen Peptiden sein. Aber auch das immunologische „Screening“ von rekombinanten cDNA Expressionsbibliotheken. Der Einsatz von massenspektrometrischen Methoden in Kombination mit einer proteolytischen Spaltung gewinnt immer mehr an Bedeutung.
Im Folgenden wird auf einige Methoden der Epitopanalyse eingegangen.
Verwendung von Proteinfragmenten
Ist die Proteinsequenz, bzw. die korrespondierende cDNA-Sequenz, eines Antigens be- kannt, können kürzere überlappende Fragmente, oder auch Deletionsmutanten, konstruiert werden, welche mit einem geeigneten Expressionssystem, meist als Fusionsprotein, expri- miert werden können. Die so erhaltenen Proteinfragmente können in verschiedenen immu-
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nologischen Versuchssystemen, wie im ELISA oder im Immunoblot, untersucht werden. Je kürzer dabei die überlappenden Proteinfragmente sind, umso präziser kann das Epitop be- stimmt werden. Diese Methode eignet sich sowohl für die Epitopanalyse monoklonaler Antikörper (Leung et al. 1992; Martinez-Torrecuadrada et al. 1998; Wootton et al. 1998;
Zvirbliene et al. 1999), wie auch für die Analyse polyklonaler Serumantikörper, also in erster Linie Autoantikörper.
Unter Verwendung von Proteinfragmenten konnten Autoantikörper bei Scleroderma gegen verschiedene Centrosomen Antigene (Bao et al. 1995), bei Epidermolysis Bullosa gegen Collagenase VII (Tanaka et al. 1994) und bei SLE gegen das ribosomale Protein L7 unter- sucht werden (Neu et al. 1997), um nur einige Beispiele zu nennen.
Ergebnisse die durch die Epitopanalyse mit Proteinfragmenten erhalten werden, können als Basisinformation wie auch zur Kontrolle weiterer Analysen verwendet werden.
Verwendung von synthetischen Peptiden
Die Verwendung synthetischer Peptide stellt eine weiter Möglichkeit der Epitopanalyse dar. Die Vorteile der Epitopanalyse mittels synthetischen Peptiden gegenüber rekomb i- nanten Antigenen liegen darin, dass diese in kontrollierten Prozessen hergestellt werden, stabil sind und so synthetisiert werden können, dass sie in den unterschiedlichsten Ve r- suchssystemen verwendet werden können (Pettersson 1992).
Die Peptide können dabei zufällig oder von der Proteinsequenz des Antigens abgeleitet sein. Bei letzterem kann es sich wieder, wie bei den Proteinfragmenten, um überlappende Sequenzen handeln.
Zum Beispiel werden beim „Epitop-Screening“ oder auch Pepscan-Verfahren Antikörper auf ihre Reaktivität gegenüber synthetischen, überlappenden Partialsequenzen eines Pro- teins hin überprüft (Houghten 1985; Nagahira et al. 1995).
Nachteil eines solchen Verfahrens ist, dass nur relativ kurze Peptide, mit einer Länge von 6-10 Aminosäuren, synthetisiert werden können. Dies ist von Nachteil, wenn es sich um konformationelle Epitope handelt (Brigido et al. 1990). Kurze Peptide werden auch ver- stärkt von kreuzreaktiven Antikörpern erkannt, was vor allem bei Untersuchungen mit hu- manen Seren Schwierigkeiten bereitet (Geysen 1985).
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Phage Display als Methode der Epitopanalyse
Eine weitere Möglichkeit der Epitopanalyse stellt das immunologische „Screnning“ einer cDNA-Bank dar, das hier am Beispiel des Phage Display erläutert werden soll.
Phage Display basiert auf den Besonderheiten der filamentösen Phagen M13, fd und f1, welche Escherichia coli (E.coli), die ein F konjugatives Plasmid tragen, infizieren können (Smith 1985; ). Aufgrund ihrer Ähnlichkeiten und ihrer Abhängigkeit von diesem F- Plasmid für eine Infektion werden diese Phagen unter dem Oberbegriff Ff-Phagen zusam- mengefasst.
Die Klonierung von zufälligen DNA-Fragmenten, von ca. 50 bis zu 200 Basenpaaren, in das 5’-Ende des Gens das für das Capsidprotein P3 des Phagen kodiert, ist die Grundlage des Phage-Displays (Petersen et al. 1995). Das P3 Capsidprotein liegt in 5 Kopien vor und ist maßgeblich an der Infektion der Bakterien beteiligt. Die Methode des Phage Display basiert also auf der Darstellung von zufälligen Peptiden in Form von Fusionsproteinen auf der Oberfläche des Phagen, welche von Antikörpern oder anderen Proteinliganden erkannt werden können (Übersichten in Scott und Smith 1990; Lane und Stephen 1993; Smith und Scott 1993).
Die Epitopanalyse erfolgt durch einen „Biopanning“ genannten Prozess. Dabei wird der Antikörper auf einem festen Untergrund immobilisiert und mit der Phagenbank inkubiert.
Die Phagen, die ein Peptid darstellen, dass dem erkannten Epitop entspricht werden vom Antikörper gebunden und können dann analysiert werden (Gershoni et al. 1997). Die Anti- körper können sowohl monoklonal (Petersen et al. 1995; Tarassishin et al. 1999; van den Brink 2000) oder Serumantikörper sein (Blüthner et al. 1996; Blüthner et al. 1999).
Es können entweder Phagen cDNA-Banken verwendet werden, die willkürliche DNA Se- quenzen („random“) enthalten oder Phagen deren DNA-Fragmente sich vom zu untersu- chenden Gen ableiten. Bei letzteren handelt es sich um sogenannte „Gene-Fragment“ Pha- ge Display Banken. Fack und Kollegen (1997) konnten mit einer „Gene-Fragment“ Pha- gen-Bank Epitope von vier monoklonalen Antikörpern bestimmen, während dies unter Verwendung einer „random“ Phagen-Bank lediglich mit zwei Antikörpern gelang. Der Erfolg dieser Methode hängt auch von den die Fremd-DNA flankierenden Sequenzen ab.
So können die dargestellten Peptide mit flankierenden Cysteinresten, die eine Disulfid- brücke bilden, in einer Schleifen-Konformation präsentiert werden, was für konformatio- nelle Epitope vorteilhaft ist (Scott 1992; Luzzago et al. 1993; McLafferty et al. 1993).
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Zusammengefasst kann man sagen, dass Phage Display eine alternative Methode darstellt, die es ermöglicht lineare und konformationelle Epitope zu kartieren. Die Vorteile dieser Methode liegen darin, dass man viele Peptide pro Peptidbank erhält und dass im Falle des
„gene-Fragment“ Phage Display eine schnelle und effektive Detektion von Epitopen eines Proteins, deren cDNA verfügbar ist, möglich ist. Wenn diese Methode funktioniert ist sie schneller, einfacher und billiger als die Kontruktion von überlappenden Fusionsporteinen oder synthetischen Peptiden (Petersen et al. 1995). Das Peptid, welches von einem Phagen exprimiert wird ist einzigartig für diesen Phagen. Ein identifiziertes Epitop kann sehr leicht durch Amplifikation des Phagen selbst amplifiziert werden. Die Phagen können direkt in Dot Blots oder im ELISA eingesetzt werden und deren DNA, und damit das Epitop, kann durch einfach Sequenzierung identifiziert werden.
Massenspektrometrische Methoden: Epitop-Excision und -Extraktion
Fortschritte in der Entwicklung von spektrometrischen Methoden, kombiniert mit dem proteolytischen Abbau des Antigens, eröffnen weitere Möglichkeiten der Epitopanalyse.
Grundlage dieser Methoden ist die empirische Beobachtung, dass Antikörper generell eine hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber einem proteolytischem Abbau aufweisen (Modern und Ruff 1938; Schrohenloher 1963). Diese proteolytische Resistenz der Antikörper ga- rantiert eine lange Stabilität der Antikörper auch in Anwesenheit physiologisch vorko m- mender Proteasen und damit eine langanhaltende humorale Immunantwort.
Die Epitopanalyse erfolgt nach folgenden Prinzipien (Suckau et al. 1990; Fiedler et al.
1992; Zao und Chait 1994; Papac et al. 1994; Przybylski 1995; Macht et al. 1996; Parker et al. 1996): Immobilisierter monoklonaler Antikörper wird entweder mit dem Gesamta n- tigen (Epitop-Excision) oder mit einer proteolytischen Abbaumischung (Epitop- Extraktion) desselben inkubiert. Im Falle der Epitop-Excision erfolgt dann ein proteolyti- scher Abbaus des gebundenen Gesamtantigens. Die Antigen-Antikörperbindung ist dabei gegenüber einem proteolytischen Abbau geschützt (Schwyzer et al. 1980; Moelling et al.
1980; Eisenberg et al. 1982; Jemmerson und Paterson 1986). Das heißt, ein Epitop kann durch die Fähigkeit eines Antikörpers eine Region des Antigens bevorzugt vor dem pro- teolytischen Abbau zu schützen, identifiziert werden (van de Water et al. 1997). In beiden Fällen wird ungebundenes Protein durch Waschen entfernt und das gebundene Protein- fragment, also das Epitop, eluiert und massenspektrometrisch identifiziert. Die Massen- spektrometrie ermöglicht eine akkurate Bestimmung des Molekulargewichts von Polypep- tiden, womit diese identifiziert werden können (Glocker et al. 1994). Der Unterschied der
