Auf der Suche nach neuen Autoantigenen, die mit rheumatoider Arthritis (RA) assoziiert sind, wurde eine Expressions-cDNA-Bank aus der entzündeten Synovialmembran einer RA-Patientin hergestellt und mit autologen gereinigten IgG durchsucht. Dabei konnte eine neue Matrix-Metalloproteinase, die Matrix-Metalloproteinase 19 (MMP-19 oder auch Ra-si-1), als neues Autoantigen bei RA identifiziert werden (Mauch, Diplomarbeit 1996; Sed-lacek, Dissertation 1996; Sedlacek et al. 1998). Weitere Untersuchungen haben gezeigt,
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dass 26% von RA-Patienten und 33% von Patienten mit systemischem Lupus Erythomato-des (SLE) Autoantikörper gegen MMP-19 besitzen (Sedlacek et al. 1998).
MMP-19 stellt damit die erste Matrix-Metalloproteinase und überhaupt die erste Protease dar, die als Autoantigen bei systemischen, rheumatoiden Autoimmunerkrankungen gefun-den wurde. Eine Immunantwort gegen ein Enzym, welches zu einer Proteinfamilie gehört, deren Mitglieder direkt an der Zerstörung von Gelenken und damit am Krankheitsgesche-hen beteiligt sind, lässt interessante Hypothesen zu. Vor allem die Hypothese einer gerich-teten Autoimmunantwort in Form eines Abwehr- oder auch Hilfsmechanismus gegen die Zerstörung von körpereigenem Gewebe, die durch körpereigene Substanzen verursacht wird, erscheint hier sehr attraktiv.
Die Matrix-Metalloproteinase 19 ist ein 508 Aminosäuren langes Enzym mit einem Mole-kulargewicht von ca. 58kD. Sie besitzt eine Signalsequenz, ein Propeptid, eine katalytische Domäne, eine Hämopexin-ähnliche Domäne und eine Hingeregion, die sich zwischen den beiden letztgenannten befindet, so dass MMP-19 eindeutig der Matrixinfamilie zugeordnet werden kann (Sedlacek et al. 1998). Neben den vier Membranständigen MMPn gehört MMP-19 zu den frühesten Zweigen der MMP-Familie (Woessner 1998).
Das Gen, das für MMP-19 kodiert, wurde auf dem Chromosom 12q14 lokalisiert, eine chromosomale Lokalisation, die für MMPn typisch ist, was eine Zuordnung zu der MMP-Familie ebenfalls rechtfertigt (Pendas et al. 1997). Es finden sich aber auch Sequenzab-schnitte, welche sich von anderen Mitgliedern der MMP-Familie unterscheiden, so dass sie das erste Mitglied einer neuen MMP-Subklasse darstellt (Pendas et al. 1997; Sedlacek et al. 1998).
So ist in der hochkonservierten Autoinhibitorsequenz innerhalb des Propeptids ein Valin durch ein Leucin und ein Prolin durch eine Glutaminsäure ersetzt (Sedlacek et al. 1998).
Ein Austausch des Prolins innerhalb dieser Sequenz kann drastische Auswirkungen auf die Latenz bzw. die Aktivität des Enzyms haben, wie für andere MMPn gezeigt wurde (San-chez-Lopez et al. 1988; Windsor et al. 1991; Park et al. 1991). So konnte Park und Kolle-gen (1991) durch Mutationsstudien zeiKolle-gen, dass eine Modifikation des Prolins zu einer autoaktiven Form von MMP-3 führt.
Der Carboxy-Terminus enthält eine Threonin-reiche Sequenz von 37 Aminosäuren, von denen 27 keine Homologie zu anderen bekannten Proteinen zeigt (Sedlacek et al. 1998).
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Auch die Hinge-Region unterscheidet sich von der anderer MMPn: Sie besitzt eine Prolin-reiche Sequenz welcher eine Oligo-Glutamin-Sequenz vorausgeht (Sedlacek et al. 1998).
Auch dieser Bereich zeigt keine Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen.
Eine schematische Darstellung der Domänenstruktur von MMP-19 ist in Abbildung 1.2.
gezeigt.
Abb. 1.2.: Schematische Darstellung der Domänenstruktur von MMP-19 (aus Sedlacek et al. 1998) Charakteristische MMP-19 Sequenzen sind gezeigt. Die ausgetauschten Aminosäuren innerhalb der Autoin-hibitor sind unterstrichen, konservierte Aminosäuren innerhalb der Zinkbindungsstelle fett gedruckt. Die Sequenz des synthetischen Peptides Pep21, das zur Herstellung polyklonaler Antikörper verwendet wurde, ist dargestellt.
Immunhistochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass MMP-19 im Synovium von RA-Patienten in der Tunica Media von Blutgefäßen lokalisiert ist. Dies steht im Gegensatz zum Expressionsmuster von Stromelysin 1, Gelatinase A und B, und der interstitionellen Collagenase. Es konnte dabei keine Kolokalisation mit TIMP-1 gefunden werden (C. Kolb et al. 1997). MMP-19 wird in Blutgefäßen entzündeter Synovia und nicht entzündeter Haut und Uterus gefunden, nicht aber in Synovia von Patienten mit Luxationen oder Arthritis (C. Kolb et al. 1997). Für immunhistochemische Färbungen von MMP-19 wurde ein poly-klonaler Kaninchen Antikörper verwendet, der gegen ein 21 Aminosäuren langes Peptid (Pep21, s. Abb. 1.2.) innerhalb der Hingeregion gerichtet ist. Diese Sequenz ist für MMP-19 sehr spezifisch. Es konnte weiter gezeigt werden, dass MMP-MMP-19 in der glatten Musku-latur der Tunica Media, nicht aber in der Endothelzellschicht großer Blutgefäße eines RA-Patienten exprimiert wird (C. Kolb et al. 1999). MMP-19 ist in Kapillaren von akut ent-zündetem Synovialgewebe, bei gleichzeitiger Abwesenheit von TIMP-1, hoch exprimiert.
TIMP-1 wiederum ist in Gefäßen, die kein MMP-19 exprimieren, vorhanden. Dies konnte sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gezeigt werden konnte. Dies weist auf eine
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regulierte Induktion von MMP-19 in Endothelzellen von Kapillaren in entzündetem Gewe-be und damit auf eine Rolle von MMP-19 Gewe-bei der Angiogenese hi n (C. Kolb et al. 1999).
MMP-19 wird in mikrovaskulären Endothelzellen neu entstehender Gefäße reguliert ex-primiert, während makrovaskuläre Endothelzellen adulter Gefäße negativ für MMP-19 sind (Mauch, Dissertation 2000). Ein weiteres Indiz für die wichtige Rolle von MMP-19 bei der Angiogenese.
Die Expression von MMP-19 wird im Verlauf der Makrophagenentwicklung, induziert durch die gleichzeitige Zunahme der Zelladhäsion, hochreguliert, was auf eine mögliche Rolle von MMP-19 bei der Migration der Makrophagen durch das Gewebe hindeutet (Mauch, Dissertation 2000).
Kottinen und Kollegen (1999) konnten durch RT-PCR feststellen, dass MMP-19, neben MMP-2 und MMP-11 und im Gegensatz zu anderen MMPn, in der Synovialmembran ko n-stitutiv exprimiert wird. Dennoch scheint MMP-19 im Krankheitsbild der RA involviert zu sein. MMP-19 ist in der Lage zwei charakteristische Bestandteile der ECM, Aggrecan und COMP („cartilage oligomeric matrix protein“) des Knorpels in vitro zu spalten (Stracke et al. 2000).
Die Expression von MMP-19 mRNA ist relativ weit verbreitet. So konnte MMP-19 mRNA in humaner Placenta, Lunge, Pankreas, Ovarien, Milz und Darm nachgewiesen werden (Pendas et al. 1997). MMPn werden unter normalen Umständen nicht in reifen Zellen pro-duziert, sondern nur dann ,wenn eine Umwandlung des Bindegewebes notwendig ist, wie z.B. bei der Wundheilung, dem Knochenwachstums oder der Ovulation (Woessner 1991;
Matrisian 1992; Birkedal-Hansen et al. 1993; Stetler-Stevenson et al. 1993). Da MMP-19 in so vielen verschiedenen Geweben vorkommt, könnte das Enzym eine Rolle bei allen Umwandlungsprozessen der ECM dieser Gewebe spielen (Pendas et al. 1997).
Auch bei der Ovulation scheint MMP-19 eine Rolle zu spielen. Bei der Maus ist MMP-19 und auch TIMP-1 zum Zeitpunkt der Ovulation in den Follikelepithelzellen und in den bindegewebsartigen Thekazellen der großen präovulatorischen und der Ovulationsfollikel stark exprimiert. Dies deutet darauf hin, dass MMP-19 in den Gewebsabbau während der Follikelruptur involviert ist und TIMP-1 eine Rolle bei der Aufhebung der MMPn Aktivität nach der Ovulation spielt (Hägglund et al. 1999).
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1.4. Grundlagen und Struktur von Antigen-Antikörper