Die Epitope der anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper

Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Epitopbereiche der anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper CK7/4, 7/5, 8/2, 8/3, 8/4 und 8/6 identifiziert werden. Mit einigen dieser Anti-körper wurden Epitop-Excisions und –Extraktions Experimente durchgeführt und alle An-tikörper wurden im Immunoblot mit rekombinanten MMP-19 Proteinfragmenten, im ELISA mit MMP-19 Fragmenten und synthetischen Peptiden und in Inhibitions-ELISAs untersucht. Die Ergebnisse all dieser Untersuchungen stimmen überein und ergeben fol-gendes: vier dieser Antikörper (CK7/4, 7/5, 8/2 und 8/3) erkennen mehrere Epitop-bereiche, während zwei Antikörper (CK8/4 und CK8/6) lediglich einen Epitopbereich er-kennen. In Abbildung 4.1. ist eine schematische Darstellung dieser Epitopbereiche darge-stellt.

Die verschiedenen Epitopbereiche von CK7/5 und CK8/2 wurden in Abschnitt 4.3. dieses Kapitels bereits erwähnt. Mit diesen beiden Antikörpern wurde in Epitop-Excisions und – Extraktions Experimenten ein nahezu identisches Elutionsspektren erhalten. Der Antikörper CK8/3 wurde zwar nicht mit Epitop-Excision und –Extraktion untersucht, verhält sich aber im ELISA und im Immunoblot gleich wie CK8/2. Es ist jedoch bisher nicht geklärt, ob CK8/2 auch ein Epitop innerhalb der katalytischen Domäne erkennt. Die Epitope dieser Antikörper liegen innerhalb der MMP-19 Sequenz weit voneinander

Diskussion

Antikörper liegen innerhalb der MMP-19 Sequenz weit voneinander entfernt und haben keine Ähnlichkeiten in ihrer Aminosäuresequenz.

Abb. 4.1.: Schematische Darstellung der Epitopbereiche der anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper.

Erläuterung siehe Text.

Der Antikörper CK7/4 erkennt wie alle anderen untersuchten Antikörper, mit Ausnahme von CK8/6, das Epitopfragment (d.h. das synthetische Peptid MK-P1) innerhalb des Pro-peptids. Zusätzlich erkennt auch CK7/4 das pET-Fragment 2, welches die katalytische Domäne und die Hingeregion von MMP-19 darstellt. Dabei wird die Hingeregion, bzw.

das synthetische Partialpeptid MK-H der Hingeregion von diesem Antikörper, im Gege n-satz zu allen anderen anti-pET-Fragment 2 positiven Monoklonalen, nicht identifiziert. Da von CK7/4 nicht ausreichend Material vorhanden war, wurde die Epitopregion innerhalb der katalytischen Domäne nicht mehr genau bestimmt.

Vier von sechs untersuchten anti-MMP-19 monoklonalen Antikörpern erkennen also mehr als ein Epitop ihres Antigens, die dazu keine Sequenzähnlichkeiten besitzen und in der Primärstruktur des Enzyms weit voneinander entfernt sind. Dies ist ein erstaunliches Er-gebnis, da eigentlich anzunehmen ist, dass monoklonale Antikörper nur ein Epitop erke n-nen. Monoklonale Antikörper sollten nur dann mehrere Epitope erkennen, wenn diese in räumlicher Nähe zueinander liegen und so ein konformationelles Epitop bilden, oder wenn die Epitope strukturelle Ähnlichkeiten oder Ähnlichkeiten in ihrer Aminosäuresequenz aufweisen.

Es stellt sich zunächst einmal die Frage, ob die anti-MMP-19 Antikörper tatsächlich monoklonal sind. Da diese Antikörper aber durch „limiting dilution“ hergestellt wurden und ihre Monoklonalität zusätzlich durch IEF überprüft wurde, ist gewährleistet, dass sie monoklonal sind.

Diskussion

Bisher wurde erst einmal beschrieben, dass mehrere Epitope bei monoklonalen Antikör-pern identifiziert wurden, die keine Homologie in ihrer Aminosäuresequenz aufweisen (Desai et al. 2000). Dabei handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper, der sich sowohl gegen die schwere Kette von HLA Klasse I β2-Microglobulin frei, als auch β2 -Microglobulin –assoziiert richtet. Die Assoziation von β2-Microglobulin an die schwere Kette von HLA Klasse I bewirkt eine Konformationsänderung beider Komponenten, was zu eine Veränderung ihres antigenen Profils führt. Der genannte Antikörper erkennt trotz dieser Konformationsänderung beide möglichen Antigene. Er erkennt eine lineare und eine konformationelle Determinante. Diese sind räumlich voneinander entfernt und weisen zwar keine Homologie in ihrer Aminosäuresequenz auf, besitzen aber strukturelle Ähnlichkei-ten.

Die hier identifizierten Epitope der anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper weisen keine Ähnlichkeit in ihrer Aminosäuresequenz auf, was eine Kreuzreaktivität zwischen den anti-genen Determinanten ausschließt. Die Epitopbereiche des Propeptids und der Hingeregion, die von den meisten Antikörpern erkannt werden, sind sehr hydrophil. Solche hydrophilen Aminosäuresequenzen stellen häufig antigene Determinanten dar (Hopp und Woods, 1981). Der Epitopbereich der zinkbindenden Region, der von CK7/5 und CK8/2 identifi-ziert wurde, ist dagegen eher hydrophob. Eine Kreuzreaktivität der Antikörper, die sowohl die antigenen Determinante des Propeptids als auch der Hingeregion erkennen, lediglich aufgrund einer ähnlichen Hydrophobizität erscheint aber unwahrscheinlich, da im Immun-system eine sehr hohe Spezifität notwendig ist. Antikörper, die sich gegen solche undefi-nierten Domänen richten widersprechen dieser Anforderung.

Das Phänomen, dass mehrere weit voneinander entfernt liegende Epitope von den anti-MMP-19 Antikörpern erkannt werden lässt sich anhand folgender Hypothese erklären:

Diese Aminosäureabschnitte gelangen durch die Faltung des Proteins in eine räumliche Nähe zueinander, obwohl sie innerhalb der Sequenz nicht dicht beieinander liegen, so dass sie gemeinsam das konformationelle Epitop des jeweiligen Antikörpers bilden. Jede identi-fizierte antigene Determinante trägt dabei zur Gesamtbindung des Antikörpers an sein An-tigen bei. Im Falle von CK7/5 ist nachweislich die Beteiligung der einzelnen Epitope an der Antigenbindung unterschiedlich, wobei das Epitop der zinkbindenden Region am we-nigsten beteiligt ist, wie im Abschnitt 3.6.3., Kapitel Ergebnisse gezeigt.

Diskussion

Die dreidimensionale Struktur von MMP-19 ist bisher noch nicht bekannt. Bisher wurden von verschiedenen MMPn bzw. einzelne MMPn-Domänen meist in Komplexen mit Sub-strat oder Inhibitoren kristallisiert (Bode et al. 1994; Li et al. 1995; Brandstetter et al.

1998; Meng et al. 1999; Botos et al. 1999). Wie im Abschnitt 1.1.1. der Einleitung bereits erläutert, wird das Propeptid einer MMPn durch den „Cystein switch“ über die katalytische Domäne gefaltet, um das Enzym in seiner latenten Form zu halten (Springman et al. 1990;

Van Wart und Birkedal-Hansen 1990). Die prolinreiche Hingeregion wiederum faltet die C-terminale Hämopexin-ähnliche Domäne auch auf die katalytische Domäne zurück (Woessner 1994).

Wenn man sich nun vorstellt, dass das Propeptid mit seiner C-terminalen Autoinhibitorre-gion in Kontakt mit der zinkbindenden ReAutoinhibitorre-gion tritt und dadurch das Propeptid über die katalytische Domäne gefaltet wird, und gleichzeitig die Hingeregion einknickt und dadurch die Hämonpexin-ähnliche Domäne ebenfalls über die katalytische faltet, ist es durchaus möglich und denkbar, dass der N-Terminus des Propeptids, in dem sich der identifizierte Epitopbereich befindet, in eine räumliche Nähe zur Hingeregion gelangt. Die zinkbindende Region selber könnte dabei ebenfalls in die Nähe der beiden anderen Epitopbereiche der Hingeregion und des Propeptids gelangen, was diesen Bereich als drittes Epitop, zumindest von CK7/5 und CK8/2, erklären würde. Derzeit ist ein Beweis dieser Hypothese nicht möglich. Dennoch erscheint dies als eine sinnvolle und logische Erklärung des Epitoppro-fils der anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper. Die Kristallisation von Antikörper gebun-den an sein Antigen könnte darüber Aufschluss geben.

Die ursprüngliche Fragestellung, das unterschiedliche Färbemuster das mit diesen Antikör-pern in immunhistochemischen Untersuchungen erhalten wurde, war Ausgang der Epito-panalyse der anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper. Die anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper konnten aufgrund ihres Färbeeigenschaften in 3 verschiedene Gruppen unter-teilt werden (persönliche Mitteilung Dr. Cornelia Kolb). CK8/4 verhält sich dabei völlig anders als alle anderen Antikörper und ist auch in den hier dargestellten Untersuchungen der einzige Antikörper, der lediglich ein Epitop des Propeptids erkennt, was sein differen-ziertes Färbeverhalten erklärt. Weiterhin wurden CK7/4, 8/2 und 8/3 in einer Gruppe zu-sammenfasst. CK8/2 und CK8/3 verhalten sich auch in Untersuchungen der Epitopanalyse sehr ähnlich. CK 7/4 erkennt im Gegensatz zu diesen Antikörpern nicht die Hingeregion, jedoch die katalytische Domäne, wobei das genaue Epitop nicht geklärt werden konnte.

Aufgrund der Ergebnisse die hier erhalten wurden, würde sich CK7/5 eher in die Gruppe

Diskussion

von CK8/2 und CK8/3 einordnen lassen. Jedoch zeigt CK7/5 ein ähnliches Färbemuster wie CK8/6. Dies korreliert jedoch nicht mit den identifizierten Epitopen dieser Antikörper, da CK8/6 als einziger nicht das Propeptid erkennt.

Das unterschiedliche Färbeverhalten der anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper konnte hier nicht vollständig geklärt werden. Dennoch ist es eindeutig, dass auch aufgrund der Ergebnisse der Epitopanalyse dieser Antikörper, diese in verschiedene Gruppen unterteilt werden können. CK8/4, CK 8/6 und auch CK7/4 scheinen ein eigenes Epitop-Erkennungsmuster zu besitzen, während CK7/5, 8/2 und auch CK8/3 bezüglich ihres Epi-top-Erkennungsmusters in einer Gruppe zusammengefasst werden können.