Phage Display

Die Verwendung des „Gene-Fragment Phage Display“ zur Epitopkartierung von Antikör-pern wird bei Petersen et al. (1995) und Blüthner et al. (1996) geschildert. Das genaue Protokoll wurde von Dr. Martin Blüthner zur Verfügung gestellt und ist im Folgenden, mit einigen Abweichungen, näher beschrieben.

2.4.1. Material

Sämtliche Bakterienstämme wurden freundlicherweise von Dr. Martin Blüthner (Univer-sität Heidelberg) zur Verfügung gestellt. Es handelt sich dabei um den E.coli Stamm K802, welcher fUSE-5 Phagen-DNA als ringförmige DNA exprimiert (rfDNA). Weiter um die E.coli Stämme MC1061, Rezipient der Phagen-Bank, und K91kan, einem Pilus tragendem E.coli Stamm, welcher nur von infektiösen Phagen infiziert werden kann.

Antibiotika-Resistenzen: Der Phage fUSE-5 trägt eine Tetracyclin-Resistenz, MC1061 eine Streptomycin- und K91kan eine Kanamycin-Resistenz.

2.4.2. Präperation von SfiI verdauter fUSE-5 rfDNA

Die rfDNA des fUSE-5 Phagen durch eine Plamidmaxipräparation aus einer Übernacht-kultur des E.coli Stamms K802 gewonnen. Dazu wurde der Plasmid-Maxi-Kit Jetstar 2.0 von Genomed verwendet und nach Anweisung des Herstellers vorgegangen. Die DNA wurde in ca. 400µl TE-Puffer (10mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM EDTA) resuspendiert und mit 100Einheiten SfiI pro 10µg DNA abgebaut. Die abgebaute DNA wurde einmal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert, anschließend mit Isopropylalkohol 15min lang bei Raumtemperatur präzipitiert und mit 75% Ethanol gewaschen. Die präzipitierte Phagen-DNA wurde wieder in TE-Puffer resuspendiert.

2.4.3. Präparation von beliebigen cDNA Fragmenten

MMP-19 cDNA wurde durch Restriktionsverdau mit EcoR1 und XhoI von pcDNA3Rasi1 gewonnen. Die MMP-19 cDNA wurde mit präparative Agarosegele aufgetrennt und die Bande aus dem Gel ausgeschnitten. Durch Zentrifugation über silanisierte Glaswolle wur-de die cDNA von wur-der Agarose abgetrennt und anschließend gefällt.

Material und Methoden

Die cDNA wurde dann mit DNAseI verdaut. Je 0.5µg cDNA wurden zu einem Endvolu-men von 10µl in DNAse-Puffer (0,1mg/ml BSA, 1mM MnCl₂, 50mM TRIS pH 7.5) ver-dünnt. Dazu wurden unterschiedliche Konzentrationen von DNAseI (12,5 bis 50 units) gegeben und exakt 10min bei 15°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 500mM EDTA pH 8.0 gestoppt. Das Ergebnis des Verdaus wurde mit einem 2.5%igem Agarosegel kontrolliert und am selben Tag eine größere Menge cDNA mit der bestimmten optimalen Konzentration von DNAseI abgebaut. Die optimale Konzentration an DNAseI lag meist bei 100units/µg DNA und wurde jedes Mal unmittelbar vor dem Verdau neu be-stimmt. Die gesammelten Abbauten wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert und an-schließend gefällt.

Die abgebauten cDNA-Fragmente wurden mit Polynukleotid Kinase (PNK) (10units/µl) (NEB) phosphoryliert. Dazu wurden 136µl cDNA-Fragmente, 17µl PNK-Puffer, 8,5µl 10mM ATP und 8,5µl PNK 1h bei 37°C und, zur Inaktivierung der PNK, 20min bei 65°C inkubiert.

Um „blund ends“ zu generieren wurden die DNA-Enden mit Klenow Enzym (5units/µl) (NEB) aufgefüllt. Dazu wurden 35µl der phosphorylierten cDNA-Fragmente, 7µl dNTPs (25mM von jedem), 10µl 10xEcoPol Puffer (NEB) und 3,5µl Klenow Enzym in einem Gesamtvolumen von 100µl 1h bei 37°C und 20min bei 65°C inkubiert und die DNA an-schließend erneut gefällt.

Anschließend wurden die Cystein-Linker zur Einklonierung in die fUSE-5 Phagen-DNA an die cDNA-Fragmente angefügt. Die zwei Oligonucleotide wurden bei 95°C für 5-10min verschmolzen und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die so vorbereiteten linker wur-den an die cDNA-Fragmente ligiert. Das Ligationsprodukt wurde auf einem 10%igen Po-lyacrylamidgel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht und die Fragmente mit einer Größe zwischen 100 und 300bp ausgeschnitten. Die Gelstücke wurden in Dialyse-schläuche (Zellu Trans 6.0, Roth, Karlsruhe) gefüllt, ca. 1,5ml TBE-Puffer (89mM Tris Base, 89mM Borsäure, 20mM EDTA pH 8.0) zugegeben und bei 20V für ca. 2h eluiert.

Die Eluate werden erneut Phenol/Chloroform extrahiert, gefällt und in 14µl TE-Puffer auf-genommen.

Material und Methoden

Oligonukleotidprimer Sequenz

FUS-5C1 5’-CTGGCTGCG-3’

FUS-5C2 5’-CGCAGCCAGCGT-3’

FUS-3C1 5’-TGCGGTCCAGCTG-3’

FUS-3C2 5’-CTGGACCGCA-3’

Tab. 2.1.: FUSE-5 Oligonukleotide (Blüthner et al. 1996)

2.4.4. Herstellung der Phagen Bank

Die gereinigten MMP-19 cDNA Fragmente wurden bei 15°C über Nacht in ca. 1µg mit SfiI geschnittene fUSE5-DNA ligiert. Die Phagen-DNA wurde dann wie zuvor beschrie-ben extrahiert und präzipitiert. Elektrokompetente E.coli MC1061 wurden bei 2,5kV mit 5µl des Ligationsprodukts elektroporiert. Die elektroporierten Bakterien wurden eine Stunde bei 37°C in 2ml SOC-Medium (100µg/ml Strep, 0,2µg/ml Tet) und nach Zugabe von 50ml LB-Medium (100µg/ml Strep, 15µg/ml Tet) über Nacht inkubiert.

Parallel wurden unterschiedliche Aliquote des Ansatzes auf Agarplatten (Strep/Tet) plat-tiert und ebenfalls über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Anzahl der Kolonien ergibt die An-zahl der Transformanden, die „Transforming units“ (tfu’s), nicht die AnAn-zahl der infektiö-sen Phagen, welche ein cDNA-Fragment im richtigen Leseraster mit dem Gen, welches das PIII Protein des Phagen kodiert, enthalten.

Gewinnung von Phagen Partikeln

50ml Bakterienkultur wurde bei 4°C und 5000rpm 10min zentrifugiert. Der Überstand wurde nochmals für weitere 10min bei 8000rpm (4°C) zentrifugiert. Zum Überstand wurde 0,15 Volumen einer eiskalten PEG/NaCl Lösung (100g PEG600, 116,9g NaCl, 475ml DDW), gegeben und durch mehrmalige Invertionen gemischt. Diese Mischung wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die präzipitierten Phagen durch Zentrifuga-tion 4°C und bei 8000rpm für 45min pelletiert, der Überstand vorsichtig verworfen und die Phagen in 250µl PBS pro 50ml Bakterienkultur resuspendiert.

Titration der Phagenbank

Je 10µl von verschiedenen Verdünnungen der Phagen-Präparation in PBS wurden mit je 10µl der Pilus tragenden Zellen gemischt und für 10min bei Raumtemperatur inkubiert.

Dann wurde 200µl LB-Medium (100µg/ml Kan / 0,2µg/ml Tet) zugegeben, für weitere 40min bei 37°C inkubiert und anschließend auf Agarplatten (100µg/ml Kan / 15µg/ml Tet)

Material und Methoden

ausplattiert. Anhand der Anzahl der Kolonien lässt sich der Titer der Phagen-Bank berech-nen.

Präparation elektrokompetenter Bakterien

Eine frisch inocculierte E.coli MC1061 Kultur wurde bei 37°C bis zu einer optischen Dichte (λ600nm) von ca. 0,5 wachsen gelassen und für 30min auf Eis inkubiert. Die Bak-terien wurden mit 4000g bei 4°C für 15min pelletiert, anschließend einmal mit einem äquivalenten Volumen und einmal mit ½ Volumen 1mM HEPES, pH 7.0, und einmal mit 1/50 Volumen 10% Glycerol / 1mM HEPES, pH 7.0, gewaschen. Die elektrokompetenten Bakterien wurden dann 10% Glycerol / LB-Medium resuspendiert und in Aliquoten bei – 70°C aufbewahrt.

Präparation von Pilus tragenden Zellen

Eine frisch inocculierte E.coli K91kan Kultur (50ml) wurde bei 37°C bis zu einer opti-schen Dichte (λ600nm) von ca. 0,45 wachsen gelassen und mit 3000rpm für 10min pelle-tiert und anschließend in 50ml 80mM NaCl resuspendiert. Diese Lösung wurde für weitere 45min bei 37°C mit leichtem Schütteln (ca. 80rpm) inkubiert, was ein Scheren der Pili verhindert. Nach erneuter Zentrifugation mit 3000rpm wurden die Bakterien in 2,5ml NAP-Puffer (80mM NaCl, 50mM NH₄H₂PO₄, pH 7.0) aufgenommn. Die Bakterien wur-den bei 4°C aufbewahrt und konnten maximal 3 Tage verwendet werwur-den.

2.4.5. Biopanning

Kleine Petrischalen wurden mit 10µg Streptavidin, gelöst in 100mM NaHCO₃, pH 9.5, über Nacht bei 4°C beschichtet. Freie Bindungsstellen wurden mit 100mM NaHCO₃, 5mg/ml BSA, 0,1µg/ml Streptavidin ca. 1h bei 4°C geblockt. Nach 6maligem Waschen mit PBS/0,1% Tween-20 wurden die Petrischalen mit 10µg biotinyliertem anti-Maus IgG1 in 1,5ml PBS über Nacht bei 4°C inkubiert und wie zuvor sechs Mal gewaschen.

Unterschiedliche Konzentrationen der monoklonalen Antikörper CK 7/5 und 8/4 wurden mit 500µl der Phagenpräparation in einem Reaktionsgefäß vereinigt und über Nacht bei 4°C rollend inkubiert. Der gesamte Ansatz wurde auf die vorbereiteten Petrischalen gege-ben und wiederum bei 4°C, unter leichtem Schütteln, über Nacht inkubiert. Danach wurde der Überstand abgenommen und die Platten 10mal gewaschen. Die gebundenen Phagen werden zweimal mit Elutionspuffer (0,1N HCl, pH 2,2 mitGlycin eingestellt) eluiert. Das

Material und Methoden

Eluat wurde sofort zu 30µl 1mM Tris pH 9 gegeben, mit 100µl PBS gewaschen und mit Centricon-30 (Ambion) auf ca. 200µl eingeengt.

Abb. 2.2.: Prinzip des Panning Verfahrens nach Blüthner et al. (1996)

Die Hälfte des Konzentrats (100µl) wurde zu 100µl Pilus tragenden Bakterien gegeben, 10min bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurde 1ml LB-Medium (100µg/ml Kan / 0,2µg/ml Tet) zugegeben, für 1h bei 37°C inkubiert. Es wurden dann 20ml LB-Medium (100µg/ml Kan / 15µg/ml Tet) zugegeben, gemischt und 1ml davon auf Wachstumsplatten (Kan / Tet) ausplattiert und die verbleibende Kultur über Nacht bei 37°C wachsen gelas-sen, um die Epitop tragenden Phagen zu amplifizieren. Aus dieser Kultur wurden die Pha-gen wie zuvor beschrieben durch PEG/NaCl Präzipitation gewonnen.

Klone von infizierten K91kan Bakterien wurden amplifiziert, die Phagen daraus gereinigt und durch Dot Blots auf ihre Immunogenizität überprüft.

Material und Methoden