Molekularbiologischer Teil

Zur Manipulation und Analyse von DNA und Escherichia coli (E.coli) wurden Standard-techniken wie sie in Maniatis et al. (1982) und den „Current Protocols of Molecularbiolo-gy“ beschrieben sind. Im Folgenden sind lediglich Techniken ausführlicher beschrieben, welche abgewandelt wurden.

Material und Methoden

2.2.1. Polymerasenkettenreaktion (PCR)

DNA-Fragmente können mit Hilfe der Polymerasenkettenreaktion (PCR) spezifisch ampli-fiziert werden. Das Prinzip dieser Methode ist unter Saiki et al. (1988) beschrieben.

2.2.1.1. Standard-PCR

Rekombinante Plasmide wurden durch eine qualitative PCR auf die Anwesenheit und die korrekte Größe von einklonierten Insertionen überprüft. Es wurde nach folgendem Sta n-dardprotokoll vorgegangen: Die Reaktionspuffer der Polymerase wurden entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet. Weiterhin je 0,5nM der beiden Oligonukleotidprimer, je 0,2nM der vier dNTPs, und 0,1-5Units/100µl der thermostabilen Polymerase, im Regel-fall Taq-DNA-Polymerase. Die Reaktion wurde mit einem 2minütigen Denaturierungs-schritt bei 94°C begonnen. Danach wurden 28 bis 30 Zyklen nach folgendem Schema durchgeführt: 30sek Denaturierung bei 94°C, 30sek Primeranlagerung, 1min30sek Strang-verlängerung bei 72°C. Abschließend erfolgte ein 7minütige StrangStrang-verlängerung bei 72°C.

Zur Durchführung der Reaktionen wurde ein Prem Thermocycler (LEP Scientific) oder ein PCR System 9700 (Perkin Elmer) verwendet.

Die optimalen Primeranlagerungstemperaturen wurden mit folgender Gleichung berechnet:

TM = 81,5 + 16,6 x lg[J⁺] + 0,41 x (%G+C) – (500/L) – 0,63 x (%FA)

[J⁺] = Konzentration der monovalenten Kationen in der PCR; L = Länge des Oligonukleo-tid-primers; (%G+C) = G-C-Gehalt des Oligonukleotidprimers; (%FA) = Formamidanteil in der PCR.

Eine Standard-PCR wurde auch verwendet, um ausgehend von der berechneten, die opti-male Primeranlagerungstemperatur experimentell zu bestimmen.

2.2.1.2. Kolonie-PCR

Eine analytische Kolonie-PCR wurde durchgeführt, um die Anwesenheit und die korrekte Größe von einklonierten Insertionen schon in E.coli Einzelkolonien zu testen. Mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Pipettenspitze wurde eine Bakterienkolonie aufgenommen und in ein Reaktionsgefäß, welches bereits 30µl DDW enthielt, überführt. Zur Vermehrung der Kolonie wurde sie anschließend mit dem selbem Zahnstocher, bzw. derselben Pipetten-spitze auf einer Wachstumsplatte ausgestrichen. Zu dem Reaktionsgefäß, das die bakteri-elle Kolonie enthielt, wurden 20µl eines vollständigen PCR-Reaktionsgemisches

hinzuge-Material und Methoden

geben. Die PCR-Reaktion wurde nach dem in 2.2.1.2. beschriebenem Standardprotokoll durchgeführt.

2.2.1.3. Klonierungs-PCR

Subklonierungen des offenen Leserasters der MMP-19 cDNA, oder auch von MMP-19 Teilsequenzen wurden durch PCR durchgeführt. Indem in die Oligonukleotidprimer ent-sprechende Sequenzen integriert wurden, konnten benötigte Restriktionsschnittstellen ein-gefügt werden, oder auch die gewünschte Insertion ins Leseraster des Vektors gebracht werden.

Die ansonsten verwendete Taq-DNA-Polymersase wurde hierfür durch Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) ersetzt. Diese besitzt eine inhärente 3’-5’-Exonukleaseaktivität und überprüft und korrigiert während der Strangverlängerung die synthetisierte DNA. So konnte die Fehlerquote der PCR-Produkte sehr gering gehalten werden.

Um einen vorzeitigen Abbau der Oligonukleotide durch die 3’-5’-Exonukleaseaktivität der Pfu-DNA-Polymerase zu vermeiden, wurde sie erst bei einer Temperatur von 82-85°C zum PCR-Reaktionsgemisch gegeben. Die Strangverlängerungszeit wurde bei diesen PCRs auf 3min verlängert.

Die gereinigten PCR-Produkte wurden zunächst in Vektoren ligiert, welche eine Amplifi-kation der cDNA durch AmplifiAmplifi-kation des rekombinanten Vektors ermöglichen. Durch den Einsatz eines Restriktionsverdaus konnte dann die cDNA in den gewünschten Vektor sub-kloniert werden. Als Amplifikations- bzw. Klonierungsvektoren wurden der pCR-Script^TM Amp SK+Vektor, der TopoTA-Cloning, oder der TA-Cloning Vektor verwendet und nach Angaben des Herstellers (Stratagene) vorgegangen.

Wurde der pCR-ScriptVektor verwendet, war es notwendig methylierte dNTPs (methyla-tion dNTP mix, Novagen) zu verwenden. Die pCR-Script Klonierung benötigt die Anw e-senheit der SrfI-Restriktionsendonuklease während der Ligationsreaktion, um eine Re-Ligation der „glatten Enden“ des Vektors ohne Insertion zu verhindern. MMP-19 besitzt eine interne SfiI-Schnittstelle, welche durch 5methyl-dCTP maskiert wurde.

Die Verwendung der methylierten dNTPs führte dazu, dass die Schmelztemperatur der PCR-Produkte stark erhöht wurde. Daher war es erforderlich, dass die Denaturierungste m-peratur auf 100°C erhöht und der Denaturierungsschritt auf 1min verlängert wurde.

Material und Methoden

2.2.2. Reinigung von PCR-Produkten

PCR-Produkte, die für Klonierungen weiter verwendet wurden, wurden direkt im An-schluss an die PCR-Reaktion von den verbliebenen Oligonukleotiden, dNTPs und weiteren Reaktionsprodukten abgetrennt. Es wurden 1/10 Volumen STE-Puffer (1M NaCl, 200mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM EDTA), 1 Volumen 5M Ammonium-Acetat und 2,5 Volumen 100%igen Ethanol zum PCR-Reaktionsgemisch gegeben und 20min mit 10000xg zentrifu-giert. Das Pellet wurde mit 200µl 70%igem Ethanol gewaschen und nochmals mit 10000xg für 10min zentrifugiert. Das Pellet wurde getrocknet und in DDW oder TE-Puffer aufge-nommen.

2.2.3. Präparation von Plasmid-DNA

In E.coli propagierte Plasmide wurden nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (Birnboim 1979, Birnboim et al. 1983) isoliert. Das Prinzip dieser Methode ist die selektive alkalische Denaturierung von hochmolekularer chromosomaler DNA , während geschlossene, zirku-läre DNA doppelsträngig bleibt. Nach Neutralisierung renaturiert die chromosomale DNA und wird unlöslich, wohingegen die lösliche Plasmid-DNA im Überstand verbleibt.

Die Plasmidminipräparationen wurden nach geringen Modifikationen der TENS-Methode (Zhou, 1994) durchgeführt.

Für den Erhalt besonders reiner DNA, z.B. für die Verwendung in einer in vitro Transkrip-tion/Translation, wurde die RNAseA noch vor der Phenol-Chloroform Extraktion durch den Einsatz von ProteinaseK abgebaut. Um eventuelle Rückstände von Phenol, die in wei-teren Anwendungen kontraindiziert sein könnten, auszuschließen, wurde vor der Ethanol-Fällung eine zusätzliche Diethylether-Extraktion vorgenommen. In manchen Fällen, z.B.

zur Verwendung in Sequenzierreaktionen, wurde die Plasmid-DNA auch unter Verwen-dung des GFX^TM Micro Plasmidpräparationskits von Pharmacia-Amersham isoliert.

2.2.4. Restriktionsverdau

Bis zu 5µg Plasmid-DNA wurde in 20µl Ansätzen verdaut. Zur Plasmid-DNA wurden 1-5 Units der beiden Restriktionsenzyme, Reaktionspuffer wie vom Hersteller angegeben, und bei Bedarf Rinderserumalbumin (BSA) in einer Endkonzentration von 100µg/ml, zugefügt.

Der Reaktionsansatz wurde bei 37°C für 2h inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von

Material und Methoden

0,2µl 500mM EDTA, pH8.0 gestoppt. Der Restriktionsansatz wurde anschließend auf ei-nem Agarose-Gel aufgetrennt und analysiert.

2.2.5. Isolierung von DNA aus präparativen Agarose-Gelen

Die DNA, meist eine Insertion eines rekombinanten Plasmids, welche durch Restriktions-verdau erhalten wurde, wurde durch präparative Agarose-Gele isoliert. Dazu wurde die DNA durch Gelelektrophorese aufgetrennt, mit Ethidiumbromid visualisiert und die ent-sprechende Bande mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Zur Gewinnung der DNA aus dem Agarosestück wurde der Gelextraktionskit Jetsorb der Firma Genomed (Bad Oyn-hausen) verwendet. Es wurde genau nach Anweisung des Herstellers vorgegangen. An-schließend wurde die extrahierte DNA noch einmal mit Na-Acetat präzipitiert.

2.2.6. Ligation

Um rekombinante Plasmide zu erhalten, wurden die Insertionen in den gewünschten Ve k-tor ligiert. Die Doppelstrang-DNA des Vekk-tors wurde durch einen Restriktionsverdau mit geeigneten Restriktionsenzymen geöffnet und der geschnittene Vektor mit einem präpara-tiven Agarosegel gereinigt. Die Insertion wurde ebenfalls durch einen Restriktionsverdau mit denselben Enzymen aus dem rekombinantem Plasmid, meist ein Vektor der zur Ampli-fikation der DNA diente, gewonnen und mit einem präparativen Agarosegel gereinigt. Die gereinigte Insertion wurde, im Überschuß, zusammen mit dem geschnittenen Vektor, 400units T4-Ligase und ihrem Puffer in entsprechender Konzentration über Nacht bei 15°C inkubiert. Die Ligationsprodukte wurden in kompetente Bakterien transformiert und propagiert.

2.2.7. Herstellung CaCl-kompetenter Bakterien

Eine frisch gewachsene Einzelkolonie des entsprechenden E.coli Stamms, welche auf einer Wachstumsplatte ohne Antibiotika angezogen wurde, wurde verwendet, um 100ml SOC-Medium anzuimpfen. Diese Kultur wurde bei 37°C bis zu einer optischen Dichte (λ600nm) von ca. 0,5 wachsen gelassen, und dann durch Zentrifugation mit 4000rpm pel-letiert. Das Pellet wurde in 10ml eiskaltem 50mM CaCl₂ resuspendiert und 30min auf Eis inkubiert. Die so behandelten Bakterien wurden mit 2600xg bei 4°C für 5min zentrifugiert und vorsichtig in 4ml 50mM CaCl₂ aufgenommen. Die CaCl₂-kompetenten Bakterien wurden bei –70°C in Aliquoten aufbewahrt.

Material und Methoden

2.2.8. Hocheffiziente Transformation von E.coli

Zur Transformation wurde ein Aliquot von kompetenten XL1-, XL2-blue MRF’, TOP10, oder BL21(DE3) auf Eis aufgetaut und auf 25mM β-Mercaptoethanol eingestellt. Die kompetenten Bakterien wurden mit 0,1-2,0µl eines Ligationsprodukts oder eines Plasmids versetzt und für 30min auf Eis inkubiert. Darauf erfolgte ein Hitzeschock von exakt 45 Sekunden. Nach 2minütigem Abkühlen auf Eis wurden 250µl SOC-Medium zugegeben und der Transformationsansatz für 30min (Ampicillin-Resistenz) oder 1h (Kanamycin-Resistenz) unter ständigem Vermischen bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden zwi-schen 10 und 200µl des Ansatzes auf Wachstumsplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelkolonien wurden entweder mit einer Kolonie-PCR, oder nach einer Plasmidpräparation mit einer Standard-PCR und / oder einem Restriktionsverdau, analy-siert.

2.2.9. DNA-Sequenzanalyse

DNA-Sequenzierungen wurden nach der Kettenabbruchmethode (Sanger und Coulson, 1975) durchgeführt. Dazu wurde der SequiTherm^TM Sequenzierkit (Epicentre Technolo-gies, Madison, USA) verwendet und nach Angaben des Herstellers vorgegangen. Die Se-quenzreaktionen wurden in einer Macrophore-Elektrophoresekammer (Pharmacia-Amersham) mit Sequagel XR (National Diagnostics) aufgetrennt und durch Auflegen eines Röntgenfilms visualisiert.

Alternativ wurden nicht radioaktive Sequenzierungen von der Firma GATC (Konstanz) durchgeführt und von GATC auch mit einem ABI PRISM^TM 377 HAT DNA Sequencer (PE Applied Biosystems) aufgetrennt.