Peptid-ELISA

Die synthetischen Peptide MK-P1, MK-P2 und MK–H wurden im ELISA in einer Kon-zentration von 0,05µg pro Vertiefung eingesetzt. Alle sechs anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper wurden auf ihre Reaktivität gegenüber den Peptiden MK-P1 und MK-H unter-sucht. Diejenigen, welche eine deutliche Reaktivität gegenüber MK-P1 zeigten, wurden ebenfalls im ELISA gegen das Partialpeptid von MK-P1, MK-P2, getestet. Alle Antikör-per, mit Ausnahme von CK8/4, wurden im ersten Schritt in einer Verdünnung von 1/500 eingesetzt und dann sechs Mal 1:2 weiterverdünnt. Bei CK8/4 wurde mit einer Verdün-nung von 1/5000 begonnen und 10 Mal 1:2 weiterverdünnt. Es wurden jeweils vierfach Bestimmungen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Titrationen sind in Abbildung 3.14.

gezeigt.

Wie in den Abschnitten 3.4.2 und 3.6.1. bereits erwähnt, waren die Antikörper CK7/5 (Abb. 3.14. A), 8/2 (D), 8/3 (E) und 8/6 (B) sowohl im ELISA, als auch im Dot Blot anti-Pep21 positiv. Hier konnte nun gezeigt werden, dass diese Antikörper auch das neu syn-thetisierte, längere Partialpeptid der Hingeregion von MMP-19, MK-H (in der Graphik blau dargestellt) eindeutig erkennen. Dies korreliert mit den Ergebnissen, die im Immuno-blot und im ELISA mit den pET-Fragmenten erzielt wurden (s. Abschnitt 3.5.5.). Diese Antikörper erkannten diejenigen MMP-19 Fragmente, welche die katalytische Domäne und die Hingeregion enthalten. Ein weiterer Antikörper, der diese Fragmente erkannte ist CK7/4. CK7/4 erkennt als einziger der anti-pET-Fragment 2 positiven Antikörper nicht MK-H, also nicht die Hingeregion (C). Sein Epitop innerhalb dieses pET-Fragments muss daher in der katalytischen Domäne liegen.

Ergebnisse

Abb. 3.14.: ELISA mit den synthetischen Peptiden MK-P1 und MK-H (A,B) bzw. MK-P1, MK-P2 und MK-H (C-F). Monoklonale Antikörper: CK7/4 (C), 7/5 (A), 8/2 (D), 8/3 (E), 8/4 (F) und 8/6 (B). Der jewe i-lige Mittelwert von vierfach Bestimmungen ist dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.

AK-Verdünnung: Antikörper-Verdünnung.

Das Peptid MK-P1, das als Epitopfragment von CK7/5, 8/2 und 8/4 identifiziert wurde (s.

Abschnitt 3.4.2 und 3.6.1.), wurde nicht nur von diesen Antikörpern, sondern auch von CK7/4 und 8/3 erkannt (schwarz dargestellt). CK7/5 zeigt hierbei eine geringere Affinität gegenüber diesem Peptid als die anderen Antikörper. Auch diese Ergebnisse korrelieren mit denen, die mit den pET-Fragmenten (3.5.5.) erzielt wurden. Auch CK8/6 zeigt in der

Ergebnisse

geringsten Verdünnung mit einer Absorption von durchschnittlich 0,19 eine sehr geringe Reaktivität gegenüber MK-P1. Allerdings ist dieser Antikörper anti-pET-Fragment 1 ne-gativ. Das Resultat mit diesem Peptid ist deshalb als unspezifische Erkennung bei einer hohen Antikörperko nzentration zu bewerten.

Die anti-MMP-19 Antikörper CK7/4, 8/2, 8/3 und 8/4 wurden auch auf ihre Reaktivität gegenüber dem Partialpeptid von MK-P1, MK-P2 überprüft. Keiner dieser Antikörper er-kannte dieses Peptid im ELISA (rot dargestellt) und auch nicht im Dot Blot (nicht gezeigt).

Die synthetischen Peptide aus der katalytischen Domäne (s. Abschnitt 3.6.1.) MK-Z1 und dessen Partialpeptid MK-Z2 wurden im ELISA in einer Konzentration von 0,5µg pro Ve r-tiefung eingesetzt. Die anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper CK7/5, 8/2, 8/3, 8/4 und 8/6 wurden im ersten Schritt 1/100 und dann weitere sechs Mal jeweils 1:2 verdünnt. Die Konzentration sowohl an Peptid, als auch an Antikörper ist damit um das 10fache höher, die Konzentration von CK8/4 sogar 100fach. Das Ergebnis dieser Untersuchungen ist in Abbildung 3.15. gezeigt.

Lediglich der Antikörper CK7/5 erkennt, im Vergleich zu den anderen Antikörpern, diese beiden Peptide. Die Affinität gegen beide Peptide ist aber sehr gering und gegenüber dem Partialpeptid MK-Z2 noch geringer als gegen MK-Z1. MK-Z1 wurde durch Epitop-Extraktion und -Excision als Epitopfragment von CK7/5 und 8/2 identifiziert. Die ELISA Ergebnisse mit diesem Peptid ergaben, dass MK-Z1 von CK7/5 zwar erkannt wird, aber mit einer deutlich geringeren Affinität als die Peptide MK-H oder auch MK-P1. MK-Z1 ist damit an der Gesamtbindung zwischen dem Antikörper CK7/5 und MMP-19 beteiligt, wenn auch zu einem deutlich geringerem Anteil. MK-Z2 wird mit einer noch geringeren Affinität als MK-Z1 erkannt. Daher ist anzunehmen, dass MK-Z2 lediglich einen Teil des Epitops innerhalb von MK-Z1 darstellt. CK8/2 reagierte im ELISA nicht mit diesem Se-quenzbereich der katalytischen Domäne. Das Peptid MK-Z1 stellt also nicht das Epitop von CK8/2 innerhalb der katalytischen Domäne dar.

Ergebnisse

Abb. 3.15.: ELISA mit den synthetischen Peptiden MK-Z1 (A) und MK-Z2 (B). Der jeweilige Mittel-wert von dreifach Bestimmungen ist dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. AK-Verdünnung: Antikörper-Verdünnung.

In Tabelle 3.6. sind die Ergebnisse der Peptid-ELISAs noch einmal zusammen gefasst. Die in Klammern gesetzten Pluszeichen weisen auf die geringe Affinität von CK7/5 für die Peptide MK-Z1 und MK-Z2 hin.

Peptid CK7/4 CK7/5 CK8/2 CK8/3 CK8/4 CK8/6

MK-P1 + + + + +

-MK-P2 - n.u. - - - n.u.

MK-Z1 n.u. (+) - - -

-MK-Z2 n.u. (+) - - -

-MK-H - + + + - +

Tab. 3.6.: Zusammenfassung der Ergebnisse der Reaktivität der anti-MMP-19 monoklonalen Antikörper gegen die verschiedenen synthetischen MMP-19 Partial-peptide. Plus und Minus stellen die positive oder auch negative Reaktivität der Antikörper dar. +/-: schwächere Affinität; (+): sehr schwache Reaktivität; n.u.: nicht untersucht

3.6.4. Inhibitions-ELISA

Mittels Inhibitions- oder auch Kompetitions-ELISAs (s. Abschnitt 2.10.4., Kapitel Material und Methoden) wurde überprüft, ob sich die Erkennung eines pET-Fragments durch einen für dieses pET-Fragment spezifischen monoklonalen Antikörper durch Inkubation dieses Antikörpers mit einem ebenfalls spezifischen synthetischen Partialpeptid des pET-Fragments hemmen lässt.

Das synthetische Peptid MK-P1 wurde für die Hemmung der Erkennung des pET-Fragments 1 durch CK8/2 und 8/3 (Abb. 3.16. B) und der pET-Fragmente 1 und 4 durch CK8/4 (Abb. 3.16. A) in einem ein bis 20 molaren Überschuss eingesetzt. Das synthetische Peptid MK-H wurde für die Hemmung der Erkennung des pET-Fragments 2 durch CK7/5,

Ergebnisse

8/2, 8/3 und 8/6 (Abb. 3.17.) ebenfalls in einem ein bis 20 molaren Überschuss eingesetzt.

Die Antikörper CK7/5, 8/2, 8/3 und 8/6 wurden in einer Verdünnung von 1/1000, CK8/4 1/10000 verwendet.

Eine 50%ige Hemmung der Erkennung der pET-Fragmente 1 und 4 durch CK8/4 mit MK-P1 erhält man in beiden Fällen bei einem ca. 7,5 molaren Überschuss des Peptids. Dies bestätigt, dass MK-P1 das einzige Epitopfragment von CK8/4 repräsentiert.

Die Erkennung des pET-Fragments 1 durch CK8/2 und 8/3 ließ sich bereits durch einen ca.

drei molaren Überschuss an MK-P1 zu 50% inhibieren. Dies ist ebenfalls ein eindeutiger Hinweis darauf, dass diese beiden Antikörper innerhalb dieses pET-Fragments lediglich dieses Epitop erkennen.

Abb. 3.16.: Inhibitions-ELISA

Hemmung der Erkennung des pET-Fragments 1 und 4 durch den monoklonalen Antikörper CK 8/4 mit dem synthetischen Peptid MK-P1 (A); Hemmung der Erkennung des pET-Fragments 1 durch die monoklonalen Antikörper CK8/2 und 8/3 mit dem synthetischen Peptid MK-P1 (B). Der jeweilige Mittelwert von vierfach Bestimmungen ist dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.

Eine 50%ige Hemmung der Erkennung des pET-Fragments 2 mit MK-H wurde für CK7/5, 8/3 und 8/6 bei einem ca. 2-2,5 und für CK8/2 bei einem ca. vier molaren Überschuss des Peptids erhalten. Auch dies lässt darauf schließen, dass MK-H das alleinige Epitop, im Falle von CK7/5, welcher auch MK-Z1 und MK-Z2 in einem geringen Maß erkennt, das Hauptepitop, innerhalb des pET-Fragments 2 ist.

Ergebnisse

Abb. 3.17.: Inhibitions-ELISA

Hemmung der Erkennung des pET-Fragments 2 durch die monoklonalen Antikörper CK7/5, 8/2, 8/3 und 8/6 mit dem synthetischen Peptide MK-H.

Der jeweilige Mittelwert von vierfach Bestim-mungen ist dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabwe ichung.