Induktion relevanter Immunmechanismen in bovinen Eutergewebspräzisionsschnitten

Tierärztliche Hochschule Hannover

Induktion relevanter Immunmechanismen in bovinen Eutergewebspräzisionsschnitten

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Eileen Schultz

Buxtehude

Hannover 2021

Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth Institut für Immunologie

1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth

2. Gutachter: Prof. Dr. Maren von Köckritz-Blickwede

Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2021

I

1. EINLEITUNG ... 9

2. LITERATUR ... 11

2.1 Mastitis des Rindes ... 11

2.2 Modelle zur Untersuchung boviner Mastitiden ... 13

2.2.1 In-vivo-Modelle ... 13

2.2.2 Das 3R-Konzept ... 14

2.2.3 Ex-vivo- und In-vitro-Modelle ... 14

2.3 Neutrophile Granulozyten ... 19

2.3.1 Priming von neutrophilen Granulozyten ... 22

2.3.2 Migration ... 24

2.3.3 Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies ... 29

3. MATERIAL ... 32

3.1 Laborgeräte ... 32

3.2 Verwendete Software ... 33

3.3 Labormaterial ... 33

3.3.1 Klinikbedarf ... 33

3.3.2 Laborbedarf ... 34

3.3.3 Chemikalien ... 35

3.3.4 Verwendete Medien, Antibiotika und Zusätze ... 36

3.3.5 ELISA ... 37

3.3.6 Vitalitätstest ... 38

4. METHODEN ... 39

4.1 Precision cut bovine udder slices ... 39

4.1.1 Herkunft des Probenmaterials ... 39

4.1.2 Gewinnung von precision cut bovine udder slices ... 39

4.1.3 MTT-Vitalitätstest ... 40

4.1.4 Stimulationsansätze für PCBUS ... 41

4.2 Enzyme linked immunosorbent assay ... 42

4.3 Bovine neutrophile Granulozyten ... 45

4.3.1 Versuchstiere für die Separation von Leukozyten ... 45

4.3.2 Blutentnahme ... 45

4.3.3 Separation neutrophiler Granulozyten ... 45

4.4 Durchflusszytometrie ... 46

4.4.1 Bestimmung von Zellzahl und Vitalität ... 47

4.4.2 Intrazelluläre Bildung reaktiver Sauerstoffspezies ... 49

4.4.3 Extrazelluläre Bildung reaktiver Sauerstoffspezies ... 52

4.4.4 Transmigration boviner neutrophiler Granulozyten ... 55

4.5 Statistische Auswertung ... 59

5. ERGEBNISSE ... 61

5.1 Sinkende Vitalität von PCBUS bei steigender LPS-Konzentration ... 61

5.2 Die LPS-Stimulation führt zu Veränderungen des Sekretoms von PCBUS ... 62

5.3 Intrazelluläre Bildung reaktiver Sauerstoffspezies ... 64

5.3.1 fMLP induziert in bovinen neutrophilen Granulozyten keine intrazelluläre ROS-Bildung ... 64

5.3.2 Steigerung der Komplexität von bovinen PMN durch Ko-Inkubation mit PCBUS-Kultur-Überständen ... 65

5.3.3 Induktion der intrazellulären ROS-Bildung durch Vorinkubation mit PCBUS-Kultur-Überständen ... 68

5.3.4 Priming von bovinen neutrophilen Granulozyten durch TNF-, GM-CSF und IL-6 ... 69

5.3.5 TNF- fördert das Priming neutrophiler Granulozyten durch hitzeinaktivierte, opsonisierte Bakterien ... 73

5.4 Extrazelluläre Bildung reaktiver Sauerstoffspezies ... 79

5.4.1 PCBUS-Kultur-Überstände verstärken die extrazelluläre ROS-Bildung . 81 5.4.2 TNF- führt nicht zum Priming der extrazellulären ROS-Bildung durch bovine neutrophile Granulozyten ... 82

5.4.3 Keine Induktion der extrazellulären ROS-Bildung durch E. coli ... 87

5.5 Migration ... 89

5.5.1 PCBUS-Kultur-Überstände als Chemotaktikum ... 89

5.5.2 GM-CSF als Chemotaktikum ... 99

5.5.3 Überadditiver Effekt durch Zugabe von CXCL8 zu PCBUS-Kultur-Überständen ... 101

5.5.4 Kein Überadditiver Effekt durch GM-CSF und CXCL8 ... 102

6. DISKUSSION ... 105

6.1 Die Vitalität von PCBUS sinkt mit steigender LPS-Konzentration ... 105

6.2 LPS-Stimulation führt zu Veränderungen des Sekretoms von PCBUS ... 107

6.3 Die ROS-Bildung wird durch PCBUS-Überstände verstärkt ... 111

6.4 PCBUS-Überstände induzieren die Migration neutrophiler Granulozyten ... 117

6.5 Ausblick ... 128

7. ZUSAMMENFASSUNG ... 130

8. SUMMARY... 133

9. LITERATURVERZEICHNIS ... 136

10. ANHANG ... 171

10.1 Stimulation von PCBUS im Kurzzeitmodell ... 171

10.2 Kultur von PCBUS unter Zusatz von FKS ... 173

10.3 Abbildungsverzeichnis ... 175

10.4 Tabellenverzeichnis ... 176

DANKSAGUNG ... 177

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

µm Micrometer

3R reduce, refine, replace CO2 Kohlenstoffdioxid

CXCL8 CXC-Motiv-Chemokin-8, auch Interleukin-8

DAMPS damage associated molecular patterns, Gefahrensignale

DAS-ELISA double antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay DHR Dihydrorhodamin 123

DNA desoxyribonucleic acid, Desoxyribonucleinsäure E. coli Escherichia coli

ELISA enzyme linked immunosorbent assay et al. et alii, und andere

FKS fetales Kälberserum FL3 Floureszenzkanal 3

fMLP N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin FSC forward scatter, Streulicht in gerader Richtung

G-CSF granulocyte-colony-stimulating factor, Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor

GDP Guanosindiphosphat

GM-CSF granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor,

Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor HBSS Hank´s Balanced Salt Solution

HRP horseradish peroxidase, Meerrettich-Peroxidase ICAM1 intercellular adhesion molecule 1

IL-1 Interleukin-1-beta IL-6 Interleukin-6 IL-8 Interleukin-8 JAK2 Janus-Kinase 2

JAM junctional adhesion molecule

LFA1 lymphocyte function-associated antigen 1 LPS Lipopolysaccharid

LTB4 Leukotrien B4

Mac-1 macrophage-1 antigen

MAPK mitogen-aktivierte Proteinkinase MCLA Methyl-Cypridin-Luceferin-Analogon

MOI multiplicity of infection, Multiplizität der Infektion

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid NADPH-Oxidase Nicotinamidadenindinucleotidphosphat-Oxidase

NET neutrophil extracellular traps

ng Nanogramm

p.i. post infectionem, nach der Infektion

PAF platelet activating factor, Plättchen-aktivierender Faktor Pam3CSK4 Pam3CysSerLys4

PAMPS pathogen associated molecular patterns, Pathogenassoziierte molekulare Muster

pbMEC primary bovine mammary ephithelial cells, primäre, bovine Euterepithelzellen

PBS phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Salzlösung PCBUS precision cut bovine udder slices, bovine Euterpräzisionsschnitte PCTS precision cut tissue slices, Gewebepräzisionsschnitte

PECAM1 platelet/ endothelial cell adhesion molecule 1

PI Propidiumiodid

PI3K Phosphoinositid-3-Kinase, Phosphoinositid-3-Kinase PMA Phorbolmyristatacetat

PMN polymorphonuclear cells, polymorphkernige Zellen

Poly(I:C) Polyinosinsäure:Polycytidylsäure, genauer Poly[(2R,3S,4R,5R)-5-(4- amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl- dihydrogenphosphat

PRR pattern recognition receptors, Mustererkennungsrezeptoren R0 Siehe RPMI-Medium 1640 ohne jegliche Zusätze

ROS reactive oxygen species, reaktive Sauerstoffspezies

RPMI++++ Roswell Park Memorial Institute, Zellkulturmedium mit dem Zusatz von fetalem Kälberserum, Penicillin, Streptomycin, Gentamycin und Amphotericin B

RPMI-Medium Roswell Park Memorial Institute-Medium, Zellkulturmedium RT-qPCR real-time reverse transcription-quantitative PCR

S. aureus Staphylococcus aureus

SB 225002 N-(2-Hydroxy-4-nitrophenyl)-N'-(2-bromophenyl)urea

SOD Superoxiddismutase

SSC side scatter, Streulicht in seitlicher Richtung STAT signal transducer and activator of transcription

TKM-Puffer Pufferlösung bestehend aus Tris-Hydrochlorid, Saccharose, Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid

TLR toll-like-Rezeptoren TNF- Tumornekrosefaktor-alpha VLA-4 very late antigen-4

9

1. E

Die Mastitis ist eine der wirtschaftlich bedeutendsten Erkrankungen des Rindes. Dabei spielen nicht nur die verminderte Milchleistung und Behandlungskosten eine Rolle, sondern auch eine erhöhte Prädisposition für Folgeerkrankungen und chronische Gewebeschädigungen, die eine häufige Abgangsursache von Kühen aus dem Betrieb darstellen (SORDILLO et al. 1992;

HALASA et al. 2007; POL u. RUEGG 2007). Nicht zu vernachlässigen sind die Schmerzen, Leiden und Schäden, welche die Tiere im Verlauf einer Euterentzündung erleben (ZHAO u.

LACASSE 2008; LESLIE u. PETERSSON-WOLFE 2012; PETERS et al. 2015; DE BOYER DES ROCHES et al. 2017; GIOVANNINI et al. 2017). Klinische Mastitiden mit schweren Krankheitsverläufen werden oft durch gramnegative Bakterien, beispielsweise Escherichia coli (E. coli), verursacht (BANNERMAN et al. 2004). Hier ist der Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid (LPS) gramnegativer Bakterien von zentraler Bedeutung für die Pathogenese (BURVENICH et al. 2003). Der Verlauf und Schweregrad solcher Mastitiden ist abhängig von kuhassoziierten Faktoren wie der Konstitution und der Abwehrbereitschaft des Immunsystems (BURVENICH et al. 2003).

Untersuchungen bezüglich der Immunreaktion im Rahmen einer Mastitis finden häufig in vivo statt, da die Reaktion des Gesamtorganismus von Bedeutung ist (BANNERMAN et al. 2004;

VANGROENWEGHE et al. 2004; WHELEHAN et al. 2011; POMEROY et al. 2016). Um valide, auswertbare Ergebnisse zu erhalten, sind Tierzahlen nötig, welche aufgrund der verhältnismäßig aufwändigen Haltung zu hohen Kosten führen. Wegen dieser Einschränkungen bei In-vivo-Studien wurden In-vitro-Modelle mit immortalisierten Euterepithelzellen (MAC-T) (MCCLENAHAN et al. 2005; C. YU et al. 2010) oder primären bovinen mammären Epithelzellen (pbMEC) (EBNER et al. 1961; SORG et al. 2012; GÜNTHER et al. 2016) etabliert. Hier liegen die entsprechenden Zellen jedoch isoliert vom Gesamtorganismus und ohne Beteiligung jeglicher übriger gewebetypischer Zellen vor. Daher wird in neuerer Zeit vermehrt auf die Untersuchung von Gewebe im Zellverbund gesetzt. In Bezug auf die Mastitisforschung sind sowohl precision cut slices als auch sogenannte Explants bereits in Erprobung (RABOT et al. 2007; LIND 2011; FILOR 2019). RABOT et al. (2007) untersuchten Explants aus dem Euterparenchym, LIND (2011) verwendetete Explants aus der Zitze und FILOR (2019) erprobte precision cut bovine udder slices (PCBUS). Explants stellen dabei

10

dickere dreidimensionale Gewebestücke mit relativ undefinierter Größe dar, wohingegen precision cut slices Gewebeschnitte definierter Schichtdicke bezeichnen. Diese Methoden bergen ein Potenzial zur Untersuchung wissenschaftlicher Fragestellungen im Kontext des 3R-Konzeptes, da Experimente an Eutergewebe von Schlachtkörpern vorgenommen werden können.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Methode der precision cut bovine udder slices in Hinblick auf die Induktion relevanter Immunmechanismen untersucht. Dabei wurden PCBUS mit dem bakteriellen Zellwandbestandteil LPS stimuliert und daraufhin die Vitalität des Gewebes sowie die Veränderungen des Sekretoms betrachtet. Ein weiterer Fokus lag zudem auf der Überprüfung einer möglichen funktionsmodulierenden Wirkung der Kulturüberstände auf bovine neutrophile Granulozyten, die aus dem Blut von heterologen Kühen gewonnen wurden.

11

2. L

2.1 M

R

Als Mastitis bezeichnet man eine Entzündung des Euters, die für das Tier mit Schmerzen, Leiden und Schäden einhergeht und somit nach §1 des Tierschutzgesetzes relevant ist.

Aufgrund der Behandlungskosten, des Pflegeaufwandes, der verminderten Milchproduktion und der Anfälligkeit für Folgeerkrankungen ist die Mastitis zudem eine der wirtschaftlich bedeutendsten Erkrankungen in der Milchkuhhaltung (HALASA et al. 2007; POL u. RUEGG 2007). Man unterscheidet Mastitiden des Rindes nach ihrer Zeitdauer und dem Erscheinungsbild in akute und chronische sowie klinische und subklinische Mastitiden, wobei verschiedene Erreger spezifische Verlaufsformen verursachen können. Bei den akuten Mastitiden haben PINZÓN-SÁNCHEZ u. RUEGG (2011) eine Unterscheidung nach dem Schweregrad der Euterentzündung vorgenommen. Dabei geht eine leichte Mastitis mit Veränderungen der Milch einher, eine moderate Mastitis mit Entzündungssymptomen des Euterviertels wie Rötung, Schwellung und Schmerzen und eine schwere Mastitis mit einem gestörten Allgemeinbefinden der Kuh, welches sich beispielsweise durch Fieber, verminderte Futteraufnahme oder Festliegen äußern kann (WENZ et al. 2006; PINZÓN-SÁNCHEZ u.

RUEGG 2011).

Die erste strukturelle Barriere gegenüber Mastitiserregern stellt der Zitzenkanal dar. Dieser wird durch einen zirkulären Strang aus glatter Muskulatur, dem Musculus sphincter papillae,

verschlossen und ist mit einem mehrschichtigen Plattenepithel ausgekleidet. Das Epithel begünstigt mit seiner porösen Struktur die Adsorption von Mikroorganismen, sodass diese nicht weiter in die Milchdrüse eindringen können. Zwischen den Phasen der Milchabgabe wird physiologischerweise ein Verschluss aus Keratin gebildet (HAUSMANN 1991). Neben dem mechanischen Verschluss beinhaltet die Keratinschicht verschiedene antibakterielle Substanzen wie freie Fettsäuren, kationische Proteine und Phospholipide sowie Xanthinoxidase (ADAMS u. RICKARD 1963; TREECE et al. 1966; HIBBITT et al. 1969). Dringen bakterielle Erreger nach Überwindung des Zitzenkanals in die Milchdrüse ein, so bilden das mammäre Epithel und residente Makrophagen die nächste Stufe der Abwehr.

Euterentzündungen werden meist durch eine bakterielle Infektion verursacht. Da in dieser Arbeit ausschließlich mit LPS als Auslöser einer mammären Entzündung gearbeitet wurde, soll

12

im Folgenden besonders auf Mastitiden, die durch Escherichia coli (E. coli) bedingt sind, eingegangen werden. BURVENICH et al. (2003) zeigten, dass E. coli bei Rindern vermehrt zu akuten klinischen Mastitiden führen. Besonders im peripartalen Zeitraum kommen auch schwerwiegende bis tödliche Verläufe vor (BURVENICH et al. 2003). Die häufigste Ursache für schwere und fatale Mastitiden sind E. coli-Infektionen (MENZIES et al. 1995). Dabei spielen weniger die Pathogenitätsfaktoren des Erregers und mehr die Konstitution und Abwehrbereitschaft der Kuh und ihres Immunsystems eine Rolle (BURVENICH et al. 2003).

E. coli als ubiquitärer Erreger besiedelt den Darm und wird konsekutiv hochgradig mit dem Kot ausgeschieden. Serotypen, die in der Milch aus erkrankten Eutervierteln isoliert werden, sind identisch mit denen, die aus dem Kot gesunder Kühe isoliert werden können (BURVENICH et al. 2003; WENZ et al. 2006). Um also das Auftreten von Mastitiden durch diesen Erreger zu reduzieren, sollte besonderer Wert auf die Liegeflächenhygiene gelegt werden, um den Kontakt zwischen dem Strichkanal als Eintrittspforte und dem Erreger zu verringern.

Besonders anfällig für eine starke Vermehrung von E. coli in der Euterzisterne sind Milchkühe im Zeitraum um die Kalbung und in der frühen Laktation (BROOKER et al. 1981;

HEYNEMAN et al. 1990; VANDEPUTTE-VAN MESSOM et al. 1993). Hierbei scheiden ältere Kühe größere Mengen an E. coli mit der Milch aus und der Schweregrad der Mastitis korreliert positiv mit der Anzahl Kolonie-bildender Einheiten (SHUSTER et al. 1996;

PYÖRÄLÄ u. PYÖRÄLÄ 1998). Bei einer adäquaten Entzündungsreaktion des Euters wird das bakterielle Wachstum durch schnell einwandernde neutrophile Granulozyten stark eingeschränkt und nur geringe Mengen des toxischen Bakterienwandbestandteils Lipopolysaccharid (LPS) werden freigesetzt (VANDEPUTTE-VAN MESSOM et al. 1993), wohingegen eine langsame Migration neutrophiler Granulozyten eher mit einem schweren Verlauf einhergeht. Dies wird auf das schnelle, ungehinderte Bakterienwachstum zurückgeführt (KEHRLI u. HARP 2001). Die Geschwindigkeit bei der Einwanderung der neutrophilen Granulozyten hängt dabei einerseits davon ab, wie schnell und wie stark die Euterepithelzellen auf den Erregerkontakt reagieren (GUNTHER et al. 2012). Andererseits sind der Zustand und die Rezeptorausstattung der neutrophilen Granulozyten relevant für deren Migration (ATKINSON et al. 1988; AL-SHAMI et al. 1997; EL-BENNA et al. 2008). Beim Rind wird beispielsweise zwischen zwei Genotypen bezogen auf den CXCR2-Rezeptor (2.3.2)

13

unterschieden, der mitverantwortlich für die Migration von neutrophilen Granulozyten ist (YOUNGERMAN et al. 2004). Auch der metabolische Zustand der Kuh post partum spielt eine Rolle: Kühe in der frühen Laktation, die metabolischem Stress ausgesetzt sind, zeigen eine herabgesetzte Expression von Genen, die für die Rekrutierung von Granulozyten verantwortlich sind (CROOKENDEN et al. 2019). In Kapitel 2.3.2 wird auf die Migration neutrophiler Granulozyten näher eingegangen.

In dieser Arbeit sollen die immunologischen Reaktionen von Eutergewebe in seinem Gewebeverband auf LPS in vitro untersucht werden. Dabei werden die Eutergewebsschnitte auf ihr migrations-induzierendes und funktions-modulierendes Potenzial gegenüber bovinen neutrophilen Granulozyten untersucht. Ziel davon ist es, bei guter Abbildung der In-vivo-Verhältnisse zukünftig im Sinne des 3R-Konzeptes die Anzahl von Tierversuchen verringern zu können.

2.2 M

U

M

Im Folgenden werden die verschiedenen, bereits genutzten Modelle erklärt, um das Euterentzündungsgeschehen bei Rindern zu untersuchen. Man unterscheidet zwischen In-vivo-Modellen, die mit lebenden Tieren arbeiten (in vivo, lateinisch im Lebenden), und Ex- vivo-Modellen, die mit Organen von Tieren arbeiten, wobei der Versuch nicht mehr am Tier stattfindet (ex vivo, lateinisch aus dem Lebenden). Des Weiteren gibt es In-vitro-Modelle, die sich auf Experimente in der Zellkultur beschränken (in vitro, lateinisch im Glas).

2.2.1 IN-VIVO-MODELLE

Die kontrollierte Infektion einzelner Euterviertel mit E. coli oder Staphylococcus aureus (S.

aureus) als Modellkeime für eine akute beziehungsweise eine subklinische Mastitis ist bereits etabliert (SCHUKKEN et al. 1999; SHOSHANI et al. 2000; BANNERMAN et al. 2004;

VANGROENWEGHE et al. 2004; WHELEHAN et al. 2011; POMEROY et al. 2016). Bei einer E. coli-Infektion treten die ersten klinischen Symptome innerhalb von 12 Stunden auf (HILL et al. 1979), wohingegen bei einer experimentellen Infektion mit S. aureus nur die somatische Zellzahl innerhalb von 12 bis 60 Stunden ansteigt (PETZL et al. 2008;

WHELEHAN et al. 2011). Die somatische Zellzahl bezeichnet die Anzahl körpereigener Zellen der Kuh in der Milch, hauptsächlich bestehend aus Leukozyten und zu einem geringen Teil aus

14

Epithelzellen. Sie wird als Indikator zur Erkennung von Euterentzündungen genutzt (KEHRLI u. SHUSTER 1994). Per definitionem sollte ein gesundes Euterviertel eine Zellzahl von weniger als 100.000 Zellen pro Milliliter aufweisen (DVG, 1994). Im Rahmen einer Mastitis steigt die Anzahl der mit der Milch ausgeschiedenen Zellen, besonders aufgrund einwandernder neutrophiler Granulozyten, bis auf mehrere Millionen somatische Zellen pro Milliliter Milch an (SAAD u. OSTENSSON 1990; KRÖMKER et al. 2001).

Für In-vivo-Studien werden in der Regel Kühe in einer ausgewählten Laktationsphase verwendet. Diese werden zu einem definierten Zeitpunkt nach der experimentellen Infektion, beispielsweise 24 Stunden post infectionem (p.i.), getötet und Gewebeproben untersucht. Dafür werden außer pathologischen und pathohistologischen Methoden auch mikrobiologische und molekularbiologische Methoden eingesetzt (SCHUKKEN et al. 1999; SHOSHANI et al. 2000;

BANNERMAN et al. 2004; VANGROENWEGHE et al. 2004; WHELEHAN et al. 2011;

POMEROY et al. 2016).

2.2.2 DAS 3R-KONZEPT

Russel und Burch veröffentlichten 1959 das Buch „The Principles of Humane Experimental Technique“ und beschrieben darin erstmals die drei Prinzipien reduce, refine und replace zur wissenschaftlichen Arbeit mit Tieren (RUSSELL u. BURCH 1959). Replace steht dafür, Tierversuche durch Alternativmethoden zu ersetzen, wenn daraus die gleiche wissenschaftliche Erkenntnis gewonnen werden kann. Refine bedeutet, die Belastung für die Tiere durch Schmerzen, Leiden und Schäden so gering wie möglich zu halten. Reduce meint, mit der kleinstmöglichen Anzahl an Tieren den größtmöglichen Erkenntnisgewinn zu generieren (RUSSELL u. BURCH 1959; BALLS 2020).

Dieses Prinzip wurde in der EU-Richtlinie 2010/63/EU gesetzlich anerkannt. Im Jahr 2013 wurde diese Richtlinie in das Tierschutzgesetz und die Tierschutz-Versuchstierverordnung integriert. Ziel dieser Arbeit soll es sein, im Sinne des 3R-Konzeptes eine weitere Methode zur Untersuchung der Immunologie im Rahmen einer Mastitis zu beurteilen.

2.2.3 EX-VIVO- UND IN-VITRO-MODELLE

Da In-vivo-Untersuchungen zur Infektionsimmunologie wie in Kapitel 2.2.1 beschrieben mit teils erheblichen Schmerzen, Leiden und Schäden für die verwendeten Tiere sowie mit hohem

15

finanziellen Aufwand verbunden sind, wurden zur Erforschung der bovinen Milchdrüse bereits zahlreiche In-vitro- und Ex-vivo-Modelle angewendet. Der folgende Abschnitt wird auf die einzelnen Modelle sowie ihre Vor- und Nachteile eingehen.

2.2.3.1 Isoliert perfundierte Organe

Bei einem isoliert perfundierten Organ handelt es sich um ein Ex-vivo-Modell. Das Organ wird von dem frisch toten Tierkörper abgesetzt und für eine begrenzte Zeitdauer kultiviert. Bovine Euter werden dazu von gesunden, laktierenden Tieren nach der Schlachtung entnommen, mit Elektrolyt-Lösung nach Tyrode (8 g/L NaCl, 200 mg/L KCl, 265 mg/L CaC12 · 2H2O, 213 mg/L MgCl2 · 6H2O, 1 g/L NaHCO3, 65 mg/L NaH2PO4, 1,1 g/L Glucose, 5 mg/L Heparin) gespült und für den Versuch in ein Metall-Gestell eingehängt, in dem sie mit Tyrode-Lösung perfundiert werden (KIETZMANN et al. 1993; BÄUMER u. KIETZMANN 2000; EHINGER u. KIETZMANN 2000, 2001; EHINGER et al. 2006).

Anfang der 1940er Jahre wurden an isoliert perfundierten Eutern zunächst Untersuchungen zur Physiologie durchgeführt: PETERSEN et al. (1941) beschrieben die Methode des isoliert perfundierten Euters zur Untersuchung der Milchsekretion. In den folgenden Jahrzehnten wurden Studien zur Milchsynthese an isoliert perfundierten Eutern durchgeführt. COWIE et al.

(1951) untersuchten beispielsweise die Milchfettsynthese, wohingegen WOOD et al. (1957) die Bildung von Laktose betrachteten. TINDAL (1957) untersuchte den Blutfluss im isoliert perfundierten Euter und nahm Verbesserungen am Versuchsaufbau vor. Später wurde das Modell auch für pharmakologische Untersuchungen verwendet. So untersuchten KIETZMANN u. LÖSCHER (1993) die perkutane Aufnahme verschiedener Wirkstoffe über die bovine Euterhaut sowie deren Auswirkungen auf die Hautvitalität. EHNINGER et al.

nutzten dieses Modell zur Untersuchung der Verteilung von verschiedenen systemisch oder intramammär applizierten Antibiotika im Euter (EHINGER u. KIETZMANN 2000, 2001;

EHINGER et al. 2006).

BÄUMER u. KIETZMANN (2000) betrachteten, inwieweit sich das isoliert perfundierte Euter als Entzündungsmodell für die Haut zur Untersuchung der Eikosanoidsynthese eignet. Auch der isoliert perfundierte bovine Uterus wurde von BÄUMER et al. (2002) als Entzündungsmodell etabliert, wobei die Methode analog zum isoliert perfundierten Euter war, die Perfusion jedoch zum Teil mit heparinisiertem Blut von Schlachtkühen durchgeführt wurde.

16

Untersucht wurden die zytotoxische Wirkung von in der Veterinärmedizin zur Behandlung chronischer Endometritiden eingesetzten Antiseptika auf das Uterusepithel, sowie die Prostaglandin E2-(PGE2)-vermittelte Entzündungsreaktion einer durch Arachidonsäure-Injektion ausgelösten Serositis (BÄUMER et al. 2002). PINTO et al. (2017) stellten fest, dass isoliert perfundierte Euter für Genexpressionsstudien geeignet sind. WELLER et al. (2019) nutzten Transkriptomanalysen, um Veränderungen in isoliert perfundierten Eutern durch eine experimentelle Infektion mit Streptococcus agalactiae nachzuweisen. Dabei konnten transkriptionale Veränderungen in vielen Genen, welche die inflammatorische Antwort des angeborenen Immunsystems betreffen, nachgewiesen werden.

Zusammenfassend weisen die beschriebenen Untersuchungen darauf hin, dass sich das isoliert perfundierte Rindereuter nicht nur für physiologische und pharmakologischen Studien, welche die Aufnahme, Verteilung und Metabolisierung von Medikamenten betreffen, sondern auch für die immunologische Grundlagenforschung eignet. Von Vorteil ist, dass sich die verschiedenen im Euter vorkommenden Zelltypen in ihrem ursprünglichen Gewebeverband befinden und die Euter als Schlachtnebenprodukt entstehen, sodass kein Tier durch diese Methode zusätzliche Schmerzen, Leiden oder Schäden im Sinne des §7 des Tierschutzgesetzes erfährt. Nachteilig ist der technische und zeitliche Aufwand, wodurch der Probendurchsatz sehr begrenzt ist. Zudem bilden Schlachtkühe nicht die Population der hochleistenden Milchkuhherden ab, sondern sind in der Regel Kühe, die aufgrund von fehlender Milchleistung, Unfruchtbarkeit, Lahmheit oder chronischer Mastitis selektiert wurden (ANSARI-LARI et al. 2012; EDWARDS-CALLAWAY et al. 2018).

2.2.3.2 Primäre mammäre Epithelzellen

Eine deutlich höhere Anzahl an vergleichenden Versuchsansätzen kann mithilfe der Kultur von primären mammären Epithelzellen erreicht werden, da diese kostengünstig und vergleichsweise einfach zu gewinnen sind. Nachteilig ist hingegen, dass die Epithelzellen isoliert vorliegen und so keinen natürlichen Kontakt zu anderen, gewebetypischen Zellarten besitzen.

Die erste Kultivierung boviner mammärer Epihelzellen wurde von EBNER et al. (1961) durchgeführt. Dabei wurden Euter von Schlachtkühen mit unterschiedlichem Reproduktionsstatus verwendet und Kollagenasen eingesetzt, um die umgebenden kollagenen Fasern zu entfernen. Es resultierten Ko-Kulturen von Epithelzellen und Fibroblasten.

17

Primäre bovine Euterepithelzellen (pbMEC, primary bovine mammary ephithelial cells) können entweder aus Eutergewebe, beispielsweise nach der Schlachtung, oder aus der Milch isoliert werden (BUEHRING 1990; HILLREINER et al. 2017). Dabei ist die Isolierung aus der Milch eine nicht-invasive Methode und die Kontamination mit Fibroblasten wird reduziert. Es können Epithelzellen von einer Kuh über die Dauer der Laktation gewonnen werden, ohne dass die Kuh in ihrer täglichen Routine Stresssituationen vergleichbar mit der Schlachtung ausgesetzt wird (SORG et al. 2012; SORG et al. 2013b; HILLREINER et al. 2017). SORG et al. (2012) verglichen die Kultur von aus Milch stammenden pbMEC mit solchen, die aus Eutergewebe isoliert wurden und kamen zu dem Ergebnis, dass pbMEC aus der Milch eine Alternative vergleichbarer Qualität darstellen. Daraufhin wurden diese Milch-pbMEC via RT-qPCR auf ihre Genexpression nach Stimulation mit hitzeinaktivierten E. coli und S. aureus untersucht. Die Stimulation mit E. coli führte dabei zu einer Veränderung der Expression von 22 Genen. Unter anderem wurden Komplementfaktoren, Chemokine und proinflammatorische Zytokine verstärkt exprimiert (SORG et al. 2013a). HILLREINER et al. (2017) gelang es mithilfe von primären bovinen Epithelzellen, die aus Milch isoliert wurden, eine 3D-Kultur anzulegen, deren Zellen nicht nur Milchproteine sezernierten, sondern auch Lactoferrin und die CXC-Chemokine 2 und 6. Auf CXC-Chemokine wird im Abschnitt 2.3.2 näher eingegangen.

Bei der Kultur von Euterepithelzellen aus Eutergewebe wird wiederum unterschieden, ob das Gewebe nach der Schlachtung (EBNER et al. 1961; SORG et al. 2012; GÜNTHER et al. 2016) oder als Biopsie am lebenden Tier entnommen wird (BUEHRING 1990). Außerdem können laktierende (EBNER et al. 1961; SORG et al. 2012; GÜNTHER et al. 2016) oder nicht- laktierende Kühe (MCGRATH 1987) zur Probenentnahme verwendet werden.

Auch Euterepithelzellen, die nicht aus der Milch stammen, wurden zur Untersuchung immunologischer Fragestellungen herangezogen. W. YANG et al. (2008) haben anhand von pbMEC, die aus Eutergewebe von frisch geschlachteten Kühen gewonnen wurden, untersucht, inwieweit sich eine Inkubation mit hitzeinaktivierten E. coli und S. aureus auf die Zytokinexpression der pbMEC auswirkt. Die Stimulation mit hitzeinaktivierten E. coli führte zu einer starken Expression von TNF- und CXCL8. Die Stimulation mit hitzeinaktivierten S. aureus führte ebenfalls zu einer verstärkten Expression von TNF- und CXCL8, diese machte jedoch nur etwa 5 % der E. coli-induzierten Expressionssteigerung aus. GÜNTHER et al. (2016) untersuchten die Reaktion von pbMEC und vergleichend dazu primären bovinen

18

mammären Fibroblasten (pbMFC) auf eine Stimulation mit hitzeinaktivierten Partikeln von E. coli. Dabei zeigte sich, dass in pbMEC die Expression von IL-1, IL-6, CCL5 und CCL20 gesteigert war, wohingegen bei pbMFC die Expression von IL-1, IL-6, CXCL8 und CCL20 erhöht war.

Zusammenfassend kann mit der Kultur von primären bovinen Euterepithelzellen vergleichsweise kostengünstig und mit hohem Probendurchsatz gearbeitet werden, die Nachteile der Entnahme von Gewebe bei Schlachtkühen bleiben dabei allerdings bestehen. Bei der Verwendung von pbMEC aus der Milch muss beachtet werden, dass nur Epithelzellen mit der Milch ausgeschieden werden, die vom Alveolarepithel abgeschilfert sind.

2.2.3.3 Precision cut tissue slices

Als precision cut tissue slices (PCTS) bezeichnet man dünne, lebensfähige Gewebeschnitte mit einer definierten, reproduzierbaren Schichtdicke, die als Ex-vivo-Modelle genutzt werden. Sie enthalten alle Zelltypen des jeweiligen Gewebes in ihrem gewebetypischen Kontext, sodass Interaktionen zwischen verschiedenen Zellen sowie zwischen Zellen und der Matrix erhalten bleiben (DE GRAAF et al. 2010). Feste Gewebe können direkt mit speziellen Gewebe-Schneidemaschinen bearbeitet werden (KRUMDIECK et al. 1980; R. J. PRICE et al.

1998; ZIMMERMANN et al. 2009), wohingegen weiche Gewebetypen wie Lunge und Darm zuvor mit Agarose, welche der Gelbildung dient, eingebettet und/oder gefüllt werden müssen (FISHER et al. 1994; DE KANTER et al. 2002). Inzwischen wurden PCTS von diversen Geweben wie Leber, Lunge, Niere, Darm, Milz, Gehirn und Herz von unter anderem Ratte, Hund, Affe und Mensch angefertigt (DE GRAAF et al. 2010). Auch für die Tierart Rind gibt es bereits pharmakologische und mikrobiologische Untersuchungen anhand von PCTS: LAKE et al. (1995) nutzten Leberpräzisionsschnitte von Kälbern, um den Metabolismus von Cumarin vergleichend zu Ratten und Makaken zu untersuchen. SIVAPATHASUNDARAM et al. (2004) untersuchten, inwieweit sich Leberpräzisionsschnitte von Rindern und Hirschen für metabolische Untersuchungen eignen und zeigten eine metabolische Aktivität über 8 bis 10 Stunden. VIVIANI et al. (2018) wiesen Wechselwirkungen des Nematodizids Fenbendazol mit dem Trematodizid Triclabendazol in bovinen Leberpräzisionsschnitten nach. In PCTS der Lunge von Rindern und Ziegen, die mithilfe von Agarose eingebettet und gefüllt wurden, konnten Wirt-Pathogen-Interaktionen mit Mycoplasma mycoides subspecies untersucht

19

werden. Dabei ist die frühe Phase der Infektion im PCTS-Modell mit der Situation in vivo vergleichbar und eine Speziesspezifität einzelner Mykoplasmenstämme nachweisbar (WELDEAREGAY et al. 2019).

PETRY (2017) hat versucht, die PCTS-Methode auf das bovine Euter anzuwenden, indem Eutergewebe mit Agarose befüllt und eingebettet wurden. Anschließend wurde mithilfe zweier verschiedener Gewebeschneidmaschinen erfolglos die Herstellung von PCTS angegangen.

Daraufhin führte PETRY (2017) eine manuelle Schnittmethode mittels Dermatom und Biopsiestanzen ein, welche durch FILOR (2019) zur Generierung von precision cut bovine udder slices (PCBUS) etabliert wurde. Hierzu wurden aus Eutern von frisch geschlachteten Kühen, mittels eines Dermatoms, Schnitte mit einer Schichtdicke von 250 µm angefertigt und durch die Verwendung von Biopsiestanzen einheitliche Durchmesser von 6 mm erreicht. Diese PCBUS konnten über fünf Tage kultiviert werden, wobei die Morphologie und Vitalität erhalten blieben. Anschließend wurde das Modell angewendet, um das frühe Infektionsgeschehen von Euterentzündungen, ausgelöst durch S. aureus und E. coli und dessen pharmakologische Beeinflussung zu untersuchen (FILOR 2019).

Im Rahmen dieser Arbeit wird mit PCBUS nach der Methode von FILOR (2019) gearbeitet, um die Reaktion aller gewebetypischen Zellen der bovinen Milchdrüse im Gewebeverband zu untersuchen. Die PCBUS-Methode bietet außerdem den Vorteil, dass die Zellen vergleichsweise lange vital bleiben und durch die geringe Schichtdicke gut versorgt werden können. Hier soll der Schwerpunkt in der Reaktion des Eutergewebes auf einer Stimulation mit Lipopolysaccharid liegen und anschließend soll die Funktionsmodulation von bovinen neutrophilen Granulozyten durch das Sekretom der PCBUS untersucht werden. Die betrachteten Funktionen sind das Migrationsverhalten sowie die Bildung intrazellulärer und extrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies. Daher werden im folgenden Kapitel zunächst neutrophile Granulozyten im Allgemeinen und dann ihre untersuchten Funktionen im Speziellen beleuchtet.

2.3 N

G

Neutrophile Granulozyten machen beim Rind im Gegensatz zu vielen anderen Tierarten mit weniger als 50 % einen kleinen Anteil der zirkulierenden Leukozyten aus (N.C. JAIN 1993a;

GEORGE et al. 2010). Sie entwickeln sich postnatal aus pluripotenten Stammzellen des

20

Knochenmarks (WILDE 1964). Diese Granulopoese wird angeregt durch den Granulozyten- Kolonie-stimulierenden Fakor (G-CSF) (CULLOR et al. 1992) und dauert beim Rind 6 Tage, worauf ein weiterer Tag des Zurückhaltens im Knochenmark folgt (VALLI et al. 1971).

Anschließend gelangen die reifen neutrophilen Granulozyten in das zirkulierende Blut, wo sie eine Halbwertszeit von 8,9 Stunden besitzen (CARLSON u. KANEKO 1975). In der Anfangsphase schwerer Entzündungsreaktionen kommt es bei Rindern verstärkt zu einer Neutropenie. Neutrophile Granulozyten wandern schnell aus dem Blut zum Ort der Entzündung. Aus dem Knochenmark werden daraufhin weitere neutrophile Granulozyten ausgeschüttet. Bei Rindern läuft die Granulopoese daraufhin nicht wie bei anderen Tierarten beschleunigt ab – man spricht von einer geringen proliferativen Reserve (VALLI et al. 1971).

Neben zirkulierenden neutrophilen Granulozyten liegt auch beim Rind eine marginale Population in Blutkapillaren vor (N.C. JAIN 1993a). Diese marginale Population besteht aus Zellen, die an der Wand von kleineren Blutgefäßen adhäriert sind und nicht mit dem Blutstrom passiv bewegt werden. Neutrophile Granulozyten sind 10 bis 12 µm groß und besitzen einen segmentierten Kern (GRINDEM 2011), was die englische Bezeichnung polymorphonuclear cells (PMN) begründet. Ihre Oberfläche besitzt viele Pseudopodien, die die Zelloberfläche vergrößern und so die Phagozytose begünstigen (PAAPE et al. 2003). Die Migration neutrophiler Granulozyten in das Gewebe wird durch Chemokine vermittelt, die von Epithelzellen und residenten Makrophagen produziert werden, nachdem diese Zellen Gefahrensignale (DAMPS, damage associated molecular patterns) oder pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPS, pathogen associated molecular patterns) erfasst haben (JANEWAY 1989; N. C. JAIN 1993b; MATZINGER 1994; GEORGE et al. 2010; BASSEL u. CASWELL 2018; BHATTARAI et al. 2018). In der Milchdrüse können neutrophile Granulozyten Effektor- und Regulator-Funktionen wahrnehmen, auf die im Weiteren genauer eingegangen wird. Dazu gehören die Degranulation, die Phagozytose, die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species), sowie die Bildung von NETs (neutrophil extracellular traps) welche dazu dienen, Mikroorganismen extrazellulär über freigesetztes Chromatin zu binden und zu töten (PAAPE et al. 2003; BRINKMANN et al. 2004).

Allerdings sind nicht alle Effektorfunktionen spezifisch gegen Pathogene gerichtet.

Freigesetzte Sauerstoffradikale können beispielsweise auch zu starken Schädigungen des umliegenden Gewebes führen. Die enge Regulation der Neutrophilenfunktionen und ihr

21

kontrollierter Zelltod sind deshalb von enormer Bedeutung für den Verlauf von Entzündung und Resolution. Viele proinflammatorische Zytokine, darunter IL-1 (COLOTTA et al. 1992), IL-6 (BIFFL et al. 1995), CXCL8 (KETTRITZ et al. 1998; LEUENROTH et al. 1998) und GM-CSF (COLOTTA et al. 1992; A. LEE et al. 1993) verlängern das Überleben von PMN. Ein weiteres proinflammatorisches Zytokin, löslicher Tumornekrosefaktor- (TNF-), induziert dagegen die Apoptose von bovinen neutrophilen Granulozyten (VAN OOSTVELDT et al.

2002).

In gesunden Tieren zirkulieren die neutrophilen Granulozyten in einem ruhenden Zustand innerhalb der Blutbahn (EL-BENNA et al. 2016). Im Rahmen einer Infektion produzieren residente Makrophagen, dendritische Zellen, Mastzellen oder Epithelzellen proinflammatorische Mediatoren, die zu Veränderungen am Epithel führen. Daraufhin beginnen neutrophile Granulozyten zu rollen, zu adhärieren und entlang des Konzentrationsgradienten von chemotaktischen Substanzen zu migrieren (WITKO-SARSAT et al. 2000; LEY et al. 2007). Auch neutrophile Granulozyten können Pathogene mithilfe ihrer Mustererkennungsrezeptoren (PRR, pattern recognition receptors) anhand deren PAMPS erkennen. Zu den PRR gehören unter anderem die Toll-like-Rezeptoren (TLR). Bovine neutrophile Granulozyten erkennen beispielsweise E. coli über TLR 4 und CD14, woraufhin der NFB-Signalweg aktiviert wird (SABROE et al. 2002; CONEJEROS et al. 2015). W.

YANG et al. (2008) fanden heraus, dass hingegen bei einer Infektion mit S. aureus der NFB- Signalweg nicht adäquat aktiviert werden kann und die Zytokine TNF- und CXCL8 nicht angemessen induziert werden. Wenn Pathogene über Komplementfaktoren oder Antikörper opsonisiert werden, also für phagozytierende Zellen markiert wurden, bindet der neutrophile Granulozyt über seinen Fc- oder einen Komplementrezeptor und die Phagozytose beginnt (WITKO-SARSAT et al. 2000). Dabei legt sich die Plasmamembran rezeptorvermittelt um den jeweiligen Partikel herum, welcher internalisiert wird. Die abgeschnürte Plasmamembran bildet auf diese Weise ein Phagosom. Neutrophile Granulozyten können ihre Plasmamembran nicht regenerieren, allerdings ermöglichen viele Pseudopodien auf der Zelloberfläche von reifen neutrophilen Granulozyten eine ausgeprägte Kapazität für die Phagozytose (PAAPE et al.

2003). Im Anschluss an die Phagozytose werden antibakterielle Peptide und Enzyme sowie Superoxidanionen in das Phagosom entlassen. Superoxidanionen werden durch das Enzym Nicotinamidadenindinucleotidphosphat-Oxidase (NADPH-Oxidase), auch NOX2 genannt,

22

generiert, indem Elektronen von NADPH auf ein Sauerstoffmolekül übertragen werden. Die NADPH-Oxidase stellt einen Enzymkomplex dar, der aus zwei membrangebundenen (p22phox und gp91phox) und vier löslichen Proteinen (p47phox, p67phox, p40phox, und Rac1/2) besteht.

Dabei steht „phox“ für Phagozytenoxidase und Rac1/2 bezeichnet kleine GTP bindende Proteine. In ruhenden neutrophilen Granulozyten liegen die membrangebundenen und die löslichen Proteine der NOX2 isoliert voneinander vor. P47phox, p67phox und p40phox bilden in diesem Zustand einen Trimerkomplex (LAPOUGE et al. 2002). P47phox kann, solange es nicht phosphoryliert wurde, nicht an das membrangebundene p22phox binden (GROEMPING et al. 2003). Diese erste Phosphorylierung kann entweder beim Priming erfolgen oder bei der direkten Aktivierung durch die Proteinkinase C. Im Zuge der Phosphorylierung ändert sich die Konformation von p47phox von einer geschlossenen zu einer offeneren räumlichen Anordnung, sodass p47phox an p22phox binden kann. Rac2 ist in ruhenden neutrophilen Granulozyten an Guanosindiphosphat (GDP) gebunden und inaktiv (ABO et al. 1994). Die membrangebundenen Komponenten befinden sich in ruhenden Zellen in der Membran von spezifischen Granula und sekretorischen Vesikeln (BORREGAARD et al. 1983). Die von der NADPH-Oxidase gebildeten Superoxidanionen werden anschließend durch die Superoxiddismutase (SOD) zu Wasserstoffperoxid umgewandelt. Durch weitere enzymatisch katalysierte Reaktionen können beispielweise Hydroxylradikale, Hypochlorid und Hypobromid gebildet werden (BOGDAN et al. 2000).

2.3.1 PRIMING VON NEUTROPHILEN GRANULOZYTEN

Man unterscheidet bei den neutrophilen Granulozyten nicht nur zwischen einem ruhenden und einem aktivierten Zustand, sondern es wird ein weiterer Zustand beschrieben, in dem neutrophile Granulozyten vorbereitet oder „geprimed“ sind (EL-BENNA et al. 2008).

Beispielsweise bindet und aktiviert CXCL8 seinen G-Protein-gekoppelten Rezeptor und führt zu einem intrazellulären Calciumanstieg. Es aktiviert allerdings nicht die NADPH-Oxidase, weil nicht alle aktivierenden Signale ausgelöst werden. Laut EL-BENNA et al. (2008) können primende Substanzen über verschiedene Signalwege, die zum Beispiel das Enzym Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) und eine Calciumfreisetzung beinhalten, dazu führen, dass p47phox teilweise phosphoryliert wird und somit auf einen Stimulus schneller reagiert. Priming führt auch dazu, dass die Lokalisation der verschiedenen Bestandteile der NADPH-Oxidase verändert wird, beispielsweise indem exkretorische Vesikel mit der Plasmamembran

23

verschmelzen und Cytochrom b558, bestehend aus NOX2/gp91phox und p22phox, auf diese Weise in die Plasmamembran integriert wird (SHEPPARD et al. 2005). Priming führt somit dazu, dass neutrophile Granulozyten schneller und effizienter gegen Pathogene vorgehen können. RAINARD et al. (2000) zeigten in vitro, dass bovine neutrophile Granulozyten, die mit TNF-, C5a oder der Kombination aus beiden geprimed wurden, S. aureus effizienter töteten. Ein übermäßiges Priming der NADPH-Oxidase kann jedoch auch zu vermehrten Gewebeschäden durch die exzessive extrazelluläre Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führen (BABIOR 2000).

Priming ist ein reversibler Prozess und kann spontan wieder rückgängig gemacht werden, sodass die Zelle in den ruhenden Zustand zurückkehrt und danach abermals geprimed werden kann (KITCHEN et al. 1996). KITCHEN et al. (1996) untersuchten dieses Depriming anhand von humanen neutrophilen Granulozyten, die mit Plättchen-aktivierendem Faktor (PAF, platelet activating factor) und TNF- geprimed wurden. Dabei war das TNF--induzierte Priming innerhalb von 120 Minuten nicht reversibel. Die neutrophilen Granulozyten, die mit PAF geprimed wurden, fielen jedoch in ihren Ausgangszustand zurück, was nicht nur funktionell, sondern auch morphologisch erkennbar war. Über die Auswirkungen des Depriming auf die intrazellulären Signalwege und die Rezeptorausstattung der neutrophilen Granulozyten ist noch wenig bekannt (VOGT et al. 2018).

In Untersuchungen zum Priming bei humanen neutrophilen Granulozyten wird meistens N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP) zur Aktivierung der NADPH-Oxidase verwendet. Jedoch reagieren bovine neutrophile Granulozyten nicht mit der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies auf eine Stimulation mit fMLP (BROWN u. ROTH 1991), sodass in dieser Arbeit zur Induktion der Bildung reaktiver Sauerstoffspeziese Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) eingesetzt wurde, welches die NADPH-Oxidase über den Proteinkinase-C-Signalweg aktiviert und überwiegend zur Bildung von extrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies führt (WINTERBOURN et al. 2016). MITCHELL et al. (2003) haben untersucht, ob sich neutrophile Granulozyten von zwei bis vier Monate alten Kälbern über eine Inkubation mit CXCL8 und/oder G-CSF über 18 Stunden primen lassen und haben dabei eine verstärkte Phagozytoserate und vermehrte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies nach anschließender Stimulation mit Mannheimia haemolytica festgestellt. Das Priming von neutrophilen Granulozyten bei adulten Rindern wurde bisher nicht untersucht.

24 2.3.2 MIGRATION

Die Migration oder Chemotaxis bezeichnet die gerichtete Bewegung von Zellen entlang eines Gradienten von chemoattraktiven Substanzen. Davon abzugrenzen ist eine ungerichtete, zufällige Bewegung von Zellen, die als Chemokinese bezeichnet wird (CORRIDEN u. INSEL 2012). Die chemoattraktiven Substanzen, die eine gerichtete Migration auslösen, werden im Wesentlichen in vier Gruppen unterteilt: Lipide, N-Formyl-Peptide, Komplementfaktoren und Chemokine (MCDONALD u. KUBES 2011). Dabei ist Leukotrien B4 (LTB4) die stärkste chemoattraktive Substanz unter den Lipiden und kann an die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren BLT1 und BLT2 auf humanen Leukozyten binden (YOKOMIZO et al. 1997;

YOKOMIZO et al. 2000). Ob N-Formyl-Peptide bovine neutrophile Granulozyten zur Chemotaxis veranlassen, ist bisher nicht ausreichend geklärt. Humane neutrophile Granulozyten besitzen die Formyl-Peptid-Rezeptoren FPR1 und FPR2, um N-Formyl-Peptide zu binden und so Migration zu vermitteln (DAHLGREN et al. 2016). Unter den chemotaktisch aktiven Komplementfaktoren ist C5a der potenteste. Humane neutrophile Granulozyten binden C5a über die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren C5aR1 und C5aR2 (R. LI et al. 2013). Auch auf bovinen neutrophilen Granulozyten wurde ein C5a-Rezeptor nachgewiesen, dessen Bindung an C5a Chemotaxis auslöst (NEMALI et al. 2008). Chemokine sind Zytokine, die chemotaktisch aktiv sind. Es gibt verschiedene Gruppen von Chemokinen, die ähnlich aufgebaut sind, jedoch an unterschiedliche G-Protein-gekoppelte Rezeptoren binden. Die Wanderung von neutrophilen Granulozyten wird im Wesentlichen durch sogenannte CXC-Chemokine ausgelöst. Bei dieser Gruppe von Chemokinen werden die beiden Cysteinreste des Moleküls, die bei CC-Chemokinen nebeneinander liegen, durch eine Aminosäure getrennt (BAGGIOLINI 2001). CXC-Chemokine werden durch die Rezeptoren CXCR1 und CXCR2 erkannt, die auf neutrpohilen Granulozyten, Monozyten und Mastzellen vorkommen (LE et al. 2004). Humane Neutrophile können mithilfe ihrer CXC-Rezeptoren folgende sieben CXC-Chemokine binden: CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 und CXCL8. CXCR1 hat eine geringere Affinität zu CXCL8 und bindet deshalb nur bei höheren Konzentrationen. CXCR2 dagegen besitzt eine hohe Affinität zu CXCL8 und detektiert daher auch niedrige Konzentrationen von CXCL8 (STILLIE et al. 2009). Die Aktivierung von CXCR1 führt vermehrt zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und damit gegebenenfalls zu vermehrten Gewebeschäden (STILLIE et al. 2009). Des Weiteren werden

25

chemotaktische Signale priorisiert wahrgenommen: Chemokine und Lipidmediatoren wirken als intermediäre Signale, also solche, die den Zellen den Weg weisen. Dagegen wirken Komplementfaktoren und im humanen Bereich auch N-Formyl-Peptide als Zielsignale (HEIT et al. 2002; HEIT et al. 2008b). Die unterschiedlichen Signaltypen werden intrazellulär auch auf verschiedenen Wegen weitergeleitet: Die intermediären Signale werden über die Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) vermittelt und die Zielsignale aktivieren p38 mitogen- aktivierte Proteinkinase (MAPK), welche den PI3K-Signalweg hemmen kann und so dominant wirkt. Eine Migration findet also präferenziell in Richtung der Zielsignale statt (HEIT et al.

2002; HEIT et al. 2008b).

Bei Rindern wurden einzelne Aspekte der Chemotaxis sowohl in vivo als auch in vitro bereits untersucht: DALEY et al. (1991) zeigten in vivo, dass die intramammäre Infusion von IL-1 und IL-2 zur Einwanderung von PMN in die bovine Milchdrüse führen. SMITS et al. (1996) zeigten in vitro, dass bovine PMN unter Einfluss von C5a vermehrt durch ein Insert-System wandern, in dem eine Membran mit 12 µm großen Poren mit Kollagen und Fibroblasten beschichtet und anschließend so kultiviert wurde, dass sie von einer konfluenten Schicht aus mammären Epithelzellen bedeckt war (SMITS et al. 1996). Die komplexe Steuerung der Chemotaxis durch Zellen innerhalb ihres Gewebeverbandes in Reaktion auf Erregerbestandteile wurde am bovinen Eutergewebe bislang nicht untersucht. Pathogene und ihre Bestandteile können jedoch das Anlocken von neutrophilen Granulozyten beeinflussen, um der Immunabwehr zu entgehen.

Beispielsweise führt LPS dazu, dass die CXCR2-Expression herunterreguliert und so die CXC-vermittelte Migration gehemmt wird (ALVES-FILHO et al. 2010). Alle bei Mensch und Maus beschriebenen CXC-Chemokine wurden auch schon im bovinen System nachgewiesen.

CXCL1 und CXCL2 werden von bovinen, mammären Epithelzellen vermehrt exprimiert, wenn diese mit S. aureus oder E. coli infiziert wurden (LAHOUASSA et al. 2007). CXCL3 wird vom Euterepithel in die Milch sezerniert und stellt das Haupt-Chemokin in der Milch gesunder Euterviertel dar (RAINARD et al. 2008). CXCL5 wird sowohl von LPS-stimulierten mammären Epithelzellen (PAREEK et al. 2005), als auch von entzündetem endometrialen Epithel vermehrt exprimiert (GABLER et al. 2010). Bovines CXCL6 wurde von PROOST et al. (1993) sequenziert und führt in Migrationsstudien zu leichten chemotaktischen Einflüssen auf PMN (C. YU et al. 2010). Für CXCL7 ist bekannt, dass es bei hypocalcämischen Kühen im Plasma gegenüber isocalcämischen Tieren reduziert ist (B. ZHANG et al. 2019). Dass CXCL8

26

zur Migration boviner neutrophiler Granulozyten führt, ist bereits bekannt(PERSSON et al.

1993; FRANK 2000; EICKHOFF 2018; HARTMANN 2020). Über die chemotaktische Wirkung der übrigen CXC-Chemokine ist im bovinen System wenig bekannt. Es wurden verschiedene Möglichkeiten untersucht, wie die CXCL-8 vermittelte Migration von PMN gehemmt werden kann. WHITE et al. (1998) entdeckten mit SB225002 (N-(2-Hydroxy-4- nitrophenyl)-N'-(2-bromophenyl)urea) einen selektiven CXCR2-Antagonisten der in vitro die CXCL8- und CXCL1-induzierte Chemotaxis von PMN des Menschen und Kaninchen inhibierte. Eine Konzentration von 1 µM SB 225002 verhinderte die Bindung von CXCL8 an CXCR2. Auch in einem Colitis-Modell an der Maus verminderte SB 225002 die Einwanderung neutrophiler Granulozyten (BENTO et al. 2008). An Milchkühen wurde SB 225002 im Zusammenhang mit deren CXCR1-Polymorphismus untersucht. Es wurde gezeigt, dass SB225002 auch bei bovinen neutrophilen Granulozyten als spezifischer CXCR2-Antagonist wirkt. Eine CXCL8-vermittelte Signaltransduktion in Anwesenheit von SB225002 konnte daher auf CXCR1 zurückgeführt werden (RAMBEAUD u. PIGHETTI 2007). Eine weitere Möglichkeit in den Signalweg von CXCL8 einzugreifen, ist die Inhibition der PI3-Kinase. Die Modulation der PI3-Kinase wurde mit GDC-0941, auch Pictilisib genannt, bereits an bovinen neutrophilen Granulozyten im Rahmen ihrer Interaktion mit Spermien untersucht (HONG et al.

2017). Eine dritte Möglichkeit zur Beeinflussung der Migration ist die Verwendung von Antikörpern gegen die entsprechende chemoattraktive Substanz. MACKINTOSH et al. (2013) zeigten, dass eine Blockade der Migration boviner neutrophiler Granulozyten, induziert durch 7,5 ng CXCL8, durch Zugabe von anti-CXCL8 möglich ist.

Neben den genannten „klassischen“ chemoattraktiven Substanzen kann die Wanderung neutrophiler Granulozyten beispielsweise auch durch den Wachstumsfaktor granulocyte- macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF, Granulozyten-Makrophagen Kolonie- stimulierender Faktor) beeinflusst werden. GM-CSF besitzt eine Schlüsselfunktion im Wachstum und der Reifung von granulozytären und monozytären Vorläufer-Zellen (GASSON et al. 1984). Es beeinflusst jedoch auch viele Funktionen von reifen, humanen neutrophilen Granulozyten. Die Aktivierung von PMN durch GM-CSF wird über die Janus-Kinase 2 (JAK2), sowie über signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) und STAT5 vermittelt. Auf diesem Weg führt GM-CSF zum Priming von neutrophilen Granulozyten (AL- SHAMI et al. 1998). Es vermittelt eine vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen, erhöht

27

die Affinität und Anzahl von fMLP-Rezeptoren (ATKINSON et al. 1988) und aktiviert die PI3- Kinase (AL-SHAMI et al. 1997). Auch bei reifen, bovinen neutrophilen Granulozyten sind Effekte durch GM-CSF nachgewiesen. TAO et al. (1995) zeigten einen primenden Effekt von GM-CSF auf die Bildung von ROS. BOUTET et al. (2004) stellten eine verzögerte Apoptose von PMN in Anwesenheit von GM-CSF fest. Im Rahmen dieser Studie konnte eine GM-CSF- abhängige STAT5-Aktivierung über den JAK2-Inhibitor AG490 blockiert werden.

SORDILLO et al. (1992) wiesen eine erhöhte chemotaktische und bakterizide Kapazität von Blut- und Milch-PMN nach. Über die eine direkte chemotaktische Wirkung von GM-CSF auf bovine neutrophile Granulozyten ist bisher nichts bekannt.

Der Extravasationsprozess beginnt mit Veränderungen am Endothel, die entweder durch inflammatorische Signale von residenten Leukozyten im Gewebe oder durch die direkte Aktivierung von Endothelzellen über PRR ausgelöst werden und zu einer vermehrten Expression von Adhäsionsmolekülen führen. Die Adhäsionsmoleküle P- und E-Selektin können an Selektinliganden auf frei zirkulierenden neutrophilen Granulozyten binden und damit das sogenannte tethering (Anbinden) auslösen (LEY et al. 2007). Die PMN werden auf diese Weise von aktivierten Endothelzellen aus dem Blutstrom „heraus gefangen“.

Anschließend rollen sie langsam in Blutflussrichtung über das Endothel, wobei Verbindungen mit Adhäsionsmolekülen schnell gebildet und wieder gelöst werden. Beim rolling (rollen) wirken auch Verbindungen zwischen lymphocyte function–associated antigen 1 (LFA1) (auch

L2-Integrin oder CD11a/CD18 genannt) oder macrophage-1 antigen (Mac-1), auch M2- Integrin oder CD11b/CD18 genannt, und very late antigen-4 (VLA-4 oder 41-Integrin) auf den neutrophilen Granulozyten und intercellular adhesion molecule 1 (ICAM1) und ICAM2 auf dem Endothelium mit (PHILLIPSON et al. 2006; ZARBOCK et al. 2011). Auf diese Weise werden die neutrophilen Granulozyten in ihrem Fluss so verlangsamt, dass sie durch chemoattraktive Substanzen aktiviert werden können, die über Glucosaminoglycane und Heparansulfat an die Membran von Endothelzellen gebunden sind (MIDDLETON et al. 2002).

Sind die migrationsfördernden Stoffe auf diese Weise strukturgebunden, spricht man von Haptotaxis (CARTER 1967). Die Aktivierung der neutrophilen Granulozyten äußert sich in Veränderungen der Expression von Zelloberflächenmolekülen, sodass vermehrt Intergrine exprimiert werden und diese eine höhere Avidität aufweisen (CARMAN u. SPRINGER 2003).

Integrine gehen durch Konformationsänderungen in einen aktivierten Zustand über, sodass ihre

28

Bindungsdomäne in den extrazellulären Raum exponiert wird (HOGG et al. 2011). Das bedeutet, dass aktivierte Integrine zu einer festen Adhäsion der PMN ans Endothel führen (PHILLIPSON et al. 2006). Adhärente PMN kriechen auf der Endotheloberfläche entlang des Chemokingradienten (MASSENA et al. 2010). Während dieses Kriechens bilden die neutrophilen Granulozyten Pseudopodien aus, die wiederholt ausgestülpt und eingezogen werden, bis sie einen durchlässigen Abschnitt im Endothel für die Transmigration erreichen (CINAMON et al. 2004; CARMAN et al. 2007).

Transmigration oder Diapedese bezeichnet den finalen Schritt des Extravasationsprozesses, in dem die neutrophilen Granulozyten aus dem Blutgefäß durch die Endothelzellbarriere in das umliegende Gewebe einwandern (MULLER 2003). Das Endothel kann parazellulär, also zwischen den Endothelzellen, oder transzellulär, durch die Endothelzellen hindurch, überwunden werden (LEY et al. 2007). Im Rahmen der Adhäsion an endotheliale Zellen können diese sogenannte transmigratory cups bilden, die reich an Adhäsionsmolekülen sind (CARMAN u. SPRINGER 2004). ICAM1 kann über Rho-GTPase-Aktivierung dazu führen, dass endotheliale Zell-Zell-Verbindungen gelöst werden (MILLÁN u. RIDLEY 2005).

Neutrophile Granulozyten sezernieren auf ihrem parazellulären Weg lösliche kationische Proteine. Diese führen zu einem Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration, welcher über eine Aktivierung der myosin light chain kinase zur Kontraktion der Endothelzellen führt (MULLER 2003). Einige Moleküle, wie das platelet/endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM1), ICAM1, ICAM2, junctional adhesion molecule (JAM) -A, -B und -C sowie CD99 vermitteln direkt die parazelluläre Migrationsroute (VESTWEBER 2002).

Die transzelluläre Migration wurde erstmals nach fMLP-Injektion bei Meerschweinchen beobachtet (FENG et al. 1998). Dieser Weg durch Endothelzellen hindurch dauert weniger als eine Minute (CINAMON et al. 2004). Die Bindung an ICAM-1 in Bereichen, in denen die ICAM1-Expression besonders hoch ist, kann dazu führen, dass sich aktinreiche Kanäle bilden, durch die Leukozyten wandern können (MILLÁN et al. 2006). Nach der Epithelzellbarriere schließen sich die Basalmembran, welche überwiegend aus Laminin und kollagenen Fasern besteht, und Perizyten an. S. WANG et al. (2006) zeigten, dass es Bereiche der Basalmembran mit verringerter Laminin-Expression gibt, die mit Lücken in den Perizyten assoziiert sind und durch die neutrophile Granuloyzten bevorzugt wandern.

29

Auch wenn der Prozess der neutrophilen Chemotaxis im humanen und murinen Bereich schon intensiv untersucht wurde, fehlen detaillierte Erkenntnisse im Zusammenhang mit der bovinen Mastitis. Im Folgenden sind bisherige Untersuchungen kurz umrissen: CRAVEN (1986) zeigten 1986 in einem Agarose-Migrationsassay, dass bovine PMN in Richtung LTB4 wandern und dass durch S. aureus oder E. coli stimulierte Eutermakrophagen Substanzen sezernieren, die chemoattraktiv auf homologe PMN wirken. J. LEE u. ZHAO (2000) untersuchten die Migration boviner PMN anhand von Inserts mit einer Porengröße von 12 µm, die auf der Oberseite mit Zellen einer bovinen Endothelzelllinie und auf der Unterseite mit Zellen einer bovinen mammären Epithelzelllinie bewachsen waren. Dabei wiesen sie nach, dass humanes rekombinantes CXCL8 die Migration boviner PMN vermittelt, wohingegen humanes rekombinantes Interleukin-1 (IL-1) weder die Migration anregt, noch zu einem Priming der PMN führt. Außerdem wurde die chemotaktische Aktivität von Eutersekret Mastitis-erkrankter Kühe nachgewiesen. Dessen chemotaktische Wirkung konnte anhand von Antikörpern gegen CXCL8 signifikant reduziert werden (BARBER u. YANG 1998).

Im Rahmen dieser Arbeit soll anhand von LPS-stimulierten Eutergewebepräzisionsschnitten nachgewiesen werden, ob und inwiefern deren Sekretom sich auf die Transmigration von bovinen neutrophilen Granulozyten in einem Insert-Modell auswirkt. Durch die gezielte Hemmung einzelner Signalwege soll untersucht werden, auf welchem Signalweg diese Migration vermittelt wird. Außerdem wird die Migration von bovinen neutrophilen Granulozyten in Richtung des Wachstumsfaktors GM-CSF untersucht.

2.3.3 DIE BILDUNG REAKTIVER SAUERSTOFFSPEZIES

Als reaktive Sauerstoffspezies (ROS; reactive oxygen species) bezeichnet man die von neutrophilen Granulozyten gebildeten Oxidationsmittel (WINTERBOURN et al. 2016). Der Aufbau der NADPH-Oxidase (NOX2) als dasjenige Enzym, welches für die Bildung von ROS hauptverantwortlich ist, wurde in Kapitel 2.3.1 bereits beschrieben. Die Aktivierung dieses Enzymkomplexes erfolgt durch chemoattraktive Mediatoren wie fMLP, C5a, PAF und Chemokine, über Integrine, phagozytierte Bakterien oder künstliche Stimuli wie PMA oder opsonisiertes Zymosan (DECOURSEY u. LIGETI 2005). Die NADPH-Oxidase wird in neutrophilen Granulozyten durch die Phagozytose stark aktiviert. Während ein Phagosom gebildet wird, setzt sich die NADPH-Oxidase innerhalb von 45 Sekunden zusammen. Sie ist

30

daraufhin in der Phagosomenmembran lokalisiert und die Superoxide werden in das Lumen des Phagosoms freigesetzt (X. J. LI et al. 2009). Durch eine Stimulation von neutrophilen Granulozyten mit PMA, wie sie auch im Rahmen dieser Arbeit genutzt wurde, wird überwiegend NADPH-Oxidase-Aktivität an der Zelloberfläche ausgelöst, es findet allerdings auch eine intrazelluläre Aktivierung statt (LUNDQVIST et al. 1996).

Die aktivierte NADPH-Oxidase reduziert Sauerstoff (O2) zu Superoxidanionen (O2-). Diese können enzymvermittelt über die Superoxiddismutase (SOD) oder durch spontane Dismutation zu Wasserstoffperoxid (H2O2) umgewandelt werden (MCCORD u. FRIDOVICH 1969;

KLEBANOFF 1980). Extrazellulär können unter Einfluss von Eisen aus H2O2 und O2-

Hydroxylradikale (OH·) gebildet werden, die sehr potente Oxidationsmittel darstellen (AMBRUSO u. JOHNSTON 1981). Über das Enzym Myeloperoxidase, das in den azurophilen Granula von neutrophilen Granulozyten gespeichert ist (BAINTON et al. 1971) und über Fusion mit dem Phagosom oder der Plasmamembran freigesetzt wird, werden verschiedene organische Substrate in Radikale umgewandelt. Dasselbe Enzym katalysiert auch die Umwandlung von Halogenen in hypohalogenide Säuren (HARRISON u. SCHULTZ 1976;

HAMPTON et al. 1998). Diese wiederum können mit Aminen reagieren und Chloramine und eine Reihe weiterer ROS bilden (RINALDI et al. 2007).

Der Elektonenfluss in der NADPH-Oxidase findet gerichtet statt, indem die Elektronen von NADPH im Cytosol auf Sauerstoff, der außerhalb der Membran vorliegt, übertragen werden.

Wenn die NADPH-Oxidase in der Zellmembran lokalisiert ist, wird Superoxid in den Extrazellularraum freigesetzt, liegt sie in der Membran eines Phagosoms, gelangt das Superoxid in das Phagosom (WINTERBOURN et al. 2016). Ein Ladungsausgleich geschieht über spannungsgesteuerte Protonenkanäle (DECOURSEY 2010). Im Gegensatz zu Makrophagenphagosomen sinkt der pH-Wert in Phagosomen von neutrophilen Granulozyten nicht in den sauren Bereich, sondern kann sogar basisch werden. LEVINE et al. (2015) haben innerhalb von Phagosomen humaner neutrophiler Granulozyten einen pH-Wert von 9 gemessen.

Reaktive Sauerstoffspezies können intrazellulär oder extrazellulär gebildet und auch nachgewiesen werden (HAMPTON et al. 1998). Dabei wird den intrazellulären ROS eine wichtige Rolle bei der bakteriziden Tätigkeit von neutrophilen Granulozyten zugesprochen,

31

wohingegen bei der Bildung extrazellulärer ROS eher die Schädigung des umliegenden Gewebes im Vordergrund steht. Im Rahmen einer Mastitis führen diese zu direkten Schäden an mammärem Epithel (CAPUCO et al. 1986; BURVENICH et al. 2004). RINALDI et al. (2007) haben verschiedene Methoden zur intra- und extrazellulären Messung reaktiver Sauerstoffspezies von bovinen PMN untersucht, wobei zur Stimulation PMA und opsonisiertes Zymosan verwendet wurden. Die Reduktion von Cytochrom c stellt dieser Studie zufolge eine Möglichkeit zum Nachweis extrazellulärer ROS dar. Sie steigt dosisabhängig mit steigender PMA-Konzentration und lässt sich durch den Radikalfänger Diphenyleniodonium (DPI) und das Enzym SOD inhibieren (RINALDI et al. 2007). Daneben wurden die Messung reaktiver Sauerstoffspezies mithilfe von Luminol, Isoluminol, Amplex Red, MCLA (Methyl-Cypridin-Luceferin-Analog), Dihydroethidium, Dichlorodihydrofluoreszeindiacetat und Dihydrorhodamin-123 (DHR) in Form von Fluoreszenz-Assays untersucht (RINALDI et al. 2007). DHR ist membranpermeabel, überwindet die Zellmembran also passiv und ist somit geeignet für die Messung intrazellulärer ROS. Bei der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies wird das nichtfluoreszeierende Dihydrorhodamin-123 zu Rhodamin-123 oxidiert, welches bei entsprechender Anregung im Bereich 500 bis 530 nm fluoresziert (ROTHE et al. 1988). Auch für DHR wurde anhand boviner PMN gezeigt, dass eine dosisabhängige Steigerung der Fluoreszenz durch Stimulation mit PMA erreicht werden kann. Diese Fluoreszenz kann durch Zugabe von DPI verhindert werden, welches die NADPH-Oxidase hemmt. Die Superoxiddismutase, die extrazellulär als Radikalfänger fungiert (DAHLGREN u.

KARLSSON 1999), zeigt dagegen keine Wirkung. Die extrazelluläre Zugabe von Katalase, welche die Reduktion von H2O2 zu H2O katalysiert, inhibierte die Fluoreszenz teilweise, was ein Hinweis auf eine Beteiligung extrazellulär gebildeter ROS am Messergebnis sein kann (RINALDI et al. 2007). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bildung extrazellulärer ROS photometrisch über die Cytochrom c-Reduktion gemessen. Die Bildung intrazellulärer ROS wurde durchflusszytometrisch anhand von DHR-markierten PMN erfasst.

32

3. M

3.1 L

Gerät Hersteller, Ort

Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr Osmose Anlage Typ „RO 50/14SMB Typ 1“

Wasser- und Regenerierstation Barsbüttel

Autoklav Schlumbohm Medizin-Labor-Technologie

GmbH, Hamburg

Autoklav „VE-75“ Systec GmbH, Linden

BD Accuri® C6 Flow Cytometer Becton, Dickison Biosciences Brutschrank „Hera Cell 150“ Thermo Fisher, Braunschweig Brutschrank mit CO2-Begasung (HERA

Cell 240 und Baureihe 5060)

Heraeus, Hanau

Dermatom Zimmer U.K. Ltd., Swindon, United

Kingdom

Feinwaage Sartorius Lab Instruments GmbH Et.

Co.KG, Göttingen

Gefrierschrank Bauknecht, Stuttgart

„HERA freeze -80 °C“ Gefrierschrank Thermo Electron Corporation, Langenselbold

Invers-Mikroskop „Axiovert 25“ Zeiss, Jena

Kühlschrank Liebherr Comfort, Biberach an der Riß

Kühlschrank mit Gefrierfach (-20 °C) Liebherr/ Privileg, Einzelhandel Laborfeinwaage „BL310“ Sartorius, Göttingen

Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ Knick, Berlin

Magnetrührer „IKAMAG REO“ IKA-Werke, Staufen im Breisgau

Magnetrührer „MR Hei-Standard“ Heidolph Instruments GmbH, Schwabach Magnetrührgerät „MR 3001 k“ OMNILAB, Gehrden

Mikrotiterplatten-Filterphotometer

„infinite M1000“

Tecan trading AG, Schweiz

Orbitalshaker “SO3” Stuart Scientific, Stone, United Kingdom

pH-Meter: „pH 320“ WTW, Weilheim

Photometer „Microplatereader MRX“ Dynatech, Denkendorf Pipetten, einstellbar (0,5-10 µl, 10-100 µl,

100-1000 µl)

Biohit Deutschland GmbH, Rosbach Pipetten, einstellbar (0,5-10 µl, 10-100 µl,

100-1000 µl) Eppendorf, Hamburg

Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl 100-1000 µl)

Gilson, Villers Le Bel (Frankreich) Pipettierhilfe, elektrisch „accujet®-pro“ Brand, Wertheim

Plattenschüttler „Titramax 1000“ Heidolph, Schwabach

Präzisionswaage „TE 131S“ Satorius Stedim Biotech, Göttingen