Extrazelluläre Bildung reaktiver Sauerstoffspezies

Zur Erfassung der Bildung extrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies wurden Granulozyten aus bovinem, heparinisierten Vollblut gewonnen und auf eine Zellzahl von 1,2 * 10⁷ neutrophile Granulozyten pro Mililiter Hank´s Balanced Salt Solution (HBSS) eingestellt. In eine 96-well-Flachbodenplatte wurden 25 µl Stimulus, 25 µl Zellkulturüberstand oder 25 µl Zellkulturmedium vorgelegt und 20 µl Zellsuspension zugegeben, sodass pro well 2,4 * 10⁵ neutrophile Granulozyten eingesät wurden. Es folgte eine Inkubation für 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2. Anschließend wurden 20 µl HBSS, 25 µl PMA in den Konzentrationen 0, 600 und 6000 nmol/l (finale Konzentration 0, 100, 1000 nmol/l) und 10 µl Cytochrom c (1 mM gelöst in PBS) zugegeben. Als Kontrollen dienten wells ohne Zugabe von Zellsuspension. Die optische Dichte wurde ab dem Zeitpunkt 0 über einen Zeitraum von 60 bis 90 Minuten im Abstand von 10 Minuten erfasst. In der Zeit zwischen den Messungen erfolgte eine Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2. Die Messung erfolgte im Mikrotiterplatten-Filterphotometer Infinite® M1000 bei einer Messwellenlänge von 550 nm und einer Referenzwellenlänge von 670 nm. Im Rahmen der Auswertung wurde die optische Dichte der entsprechenden Leerprobe, von der optischen Dichte jeder Probe subtrahiert und das Resultat mit 1000 multipliziert zur Angabe der mOD.

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4.4.3.1 Hemmung der PMA-Induzierten Cytochrom c-Reduktion

Zur Hemmung der ROS-Bildung wurde den Zellen innerhalb der ersten Inkubationsphase nach 20 Minuten 20 µl Diphenyleneiodoniumchlorid (80 µM in HBSS) oder 20 µl Superoxiddismutase in HBSS (100 U/ml) zugegeben, woraufhin weitere 10 Minuten Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 folgten. Anschließend wurden 25 µl einer 6-fach-konzentrierten PMA-Lösung in PBS (final 0, 100, 1000 nmol/l) sowie 10 µl Cytochrom c (1 mM gelöst in PBS) zugegeben. Die optische Dichte wurde ab dem Zeitpunkt 0 über einen Zeitraum von 60 bis 90 Minuten im Abstand von 10 Minuten erfasst.

4.4.3.2 Einfluss von PCBUS-Kulturüberständen auf die Bildung extrazellulärer ROS Um zu untersuchen, welchen Einfluss nicht-stimulierte und LPS-stimulierte PCBUS-Kulturüberstände (4.1.4) auf die extrazelluläre ROS-Bildung haben, wurden bovine PMN mittels Dichtegradientenseparation aus heparinisiertem Vollblut gewonnen und auf eine Zellzahl von 1,2 * 10⁷ neutrophile Granulozyten pro ml HBSS eingestellt. Von dieser Zellsuspension wurden 20 µl in einer 96-well-Flachbodenplatte ausgesät und 25 µl PCBUS-Überstand wurden zugegeben. Als Kontrolle dienten Zellen, die in R0 oder 100 ng/ml LPS in R0 vorlagen. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C und 5 % CO2 wurden 25 µl PMA (600nmol/l) und 10 µl Cytochrom c zugegeben. Ab diesem Zeitpunkt 0 wurde die optische Dichte über 60 Minuten alle 10 Minuten erfasst.

4.4.3.3 Einfluss von TNF- auf die Bildung extrazellulärer ROS

Zur Überprüfung des Einflusses von TNF- auf die extazelluläre ROS-Bildung wurden bovine neutrophile Granulozyten vergleichend mit und ohne 20 ng/ml bovinem, rekombinantem TNF- gelöst in HBSS, für 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Darauffolgend wurde die ROS-Bildung durch Zugabe von 25 µl PMA in der Konzentration 600 oder 6000 nmol/l (final 100 oder 1000 nmol/) oder PBS als Negativkontrolle induziert. Direkt im Anschluss wurden10 µl Cytochrom c (1 mM gelöst in PBS) zugegeben. Die optische Dichte wurde ab dem Zeitpunkt 0 über einen Zeitraum von 60 bis 90 Minuten im Abstand von 10 Minuten erfasst.

4.4.3.4 Einfluss der Separationsmethode auf die Bildung extrazellulärer ROS

Um herauszufinden, ob die Ficoll-basierte Dichtegradientenseparation boviner Granulozyten einen primenden Einfluss auf die Zellen hat, wurde diese Methode mit der Verwendung von

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Gesamtleukozyten verglichen, die mittels Vollblutlyse gewonnen wurden. Die Ficoll-basierte Dichtegradientenseparation wurde wie in Kapitel 4.3.3 beschrieben durchgeführt. Zur Gewinnung von Gesamtleukozyten wurden 20 ml heparinisiertes Vollblut in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und 30 ml PBS zugegeben, das auf 37°C vorgewärmt wurde. Es folgte eine Zentrifugation bei 1000 * g und 10 °C mit nicht eingelegter Bremse für 10 Minuten.

Anschließend wurde das Plasma abgenommen und verworfen. Es folgte eine erste hypotone Lyse, um die Erythrozyten aus dem Zellgemisch zu entfernen. Dazu wurde das Zellpellet, das Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten enthielt, resuspendiert und 20 ml steriles, vollentsalztes Wasser hinzugegeben, etwa 10 Sekunden geschwenkt und mit 20 ml doppelt konzentriertem PBS isoton ausgeglichen. Nach einem Zentrifugationsschritt bei 500 * g und 4 ° C für 10 Minuten mit eingelegter Bremse wurde der Überstand verworfen, das Zellpellet resuspendiert und eine zweite hypotone Lyse nach dem gleichen Schema durchgeführt und für 10 Minuten bei 250 * g und 4 °C zentrifugiert, um Thrombozyten zu entfernen. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet resuspendiert. Im nächsten Schritt wurden die Zellen in 50 ml PBS gewaschen und wiederum bei 125 * g, 4 °C für 10 Minuten mit eingelegter Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 5 ml HBSS resuspendiert und auf eine Zellzahl von 1,2 * 10⁷ neutrophile Granulozyten pro Mililiter HBSS eingestellt.

Auch in diesem Versuch wurde der Einfluss einer Vorinkubation mit 20 ng/ml TNF- untersucht. Zunächst wurden also in eine 96-well-Flachbodenplatte 25 µl TNF- oder 25 µl HBSS vorgelegt und 20 µl Zellsuspension zugegeben, sodass pro well 2,4 * 10⁵ neutrophile Granulozyten eingesät wurden. Es folgte eine Inkubation für 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2. Anschließend wurden 20 µl HBSS, 25 µl PMA in den Konzentrationen 0, 600 und 6000 nmol/l (finale Konzentration 0, 100, 1000 nmol/l) und 10 µl Cytochrom c (1 mM gelöst in PBS) zugegeben. Die optische Dichte wurde ab dem Zeitpunkt 0 über einen Zeitraum von 60 bis 90 Minuten im Abstand von 10 Minuten erfasst.

4.4.3.5 Einfluss von hitzeinaktivierten E. coli auf die Bildung extrazellulärer ROS Um den Einfluss von hitzeinaktivierten, opsonisierten E. coli auf die extazelluläre ROS-Bildung zu überprüfen, wurden bovine neutrophile Granulozyten vergleichend mit 0, 10 oder 100 MOI hitzeinaktivierten, opsonisierten E. coli für 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2

inkubiert. Dabei steht MOI für die Multiplizität der Infektion, das heißt für das zahlenmäßige Verhältnis zwischen infektiösem Agenz und der Zielzelle. Vergleichend dazu wurden Zellen

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statt mit E. coli mit 6-fach-konzentrierter PMA-Lösung (0, 600 oder 6000 nmol/l) stimuliert.

Auch in diesem Versuch wurde der Einfluss einer Vorinkubation mit 20 ng/ml TNF- untersucht. Zunächst wurden also in eine 96-well-Flachbodenplatte 25 µl TNF- oder 25 µl HBSS vorgelegt und 20 µl Zellsuspension zugegeben, sodass pro well 2,4 * 10⁵ neutrophile Granulozyten eingesät wurden. Es folgte eine Inkubation für 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2. Anschließend wurden 20 µl HBSS, 25 µl hitzeinaktivierte, opsonisierte E. coli (MOI 0, 10 oder 100) oder 25 µl PMA in den Konzentrationen 0, 600 und 6000 nmol/l (finale Konzentration 0, 100, 1000 nmol/l) und 10 µl Cytochrom c (1 mM gelöst in PBS) zugegeben. Die optische Dichte wurde ab dem Zeitpunkt 0 über einen Zeitraum von 60 bis 90 Minuten im Abstand von 10 Minuten erfasst.