Chemikalien

Chemikalie Hersteller, Ort

2-Mercaptoethanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe 3,3‘,

5,5‘-Tetramethyl-[1,1’-diphenyl]-4,4’-diamin

Merck KGaA, Darmstadt Accutase®-Lösung, steril filtiert Merck KGaA, Darmstadt AG490, Januskinase-2-Inhibitor Invivogen, Toulouse

Bovine IL-1 ELISA Reagent Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, MA Bovine TNF- DuoSet^® ELISA R&D Systems Inc., Minneapolis, MN Bovines Serumalbumin (Fraktion V) Merck KGaA, Darmstadt

Concanavalin A Invivogen, Toulouse

Cytochrom c aus bovinem Herzen Sigma-Aldrich, Steinheim Dihydrorhodamine 123 (DHR) Biomol GmbH, Hamburg

Dimethylsulfoxid (DMSO) Fisher Scienific, New Hampshire (USA) Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Carl Roth GmbH & Co. KG

Diphenyleneiodoniumchlorid Sigma-Aldrich, Steinheim Dulbecco’s PBS (1*) powder Capricorn Scientific GmbH,

Ebsdorfergrund Dulbeccos’s Phosphate buffered saline,

Endotoxin-frei

Maerck KGaA, Darmstadt

Essigsäure 0,1 % AppliCem GmbH, Darmstadt

Ethanol 641, absolut, vergällt CG Chemikalien, Laatzen

Ethylendiamintetraessigsäure Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Fetales Kälberserum (FCS), Virus-,

Leukotrien B4 Biomol, Hamburg

Lipopolysaccharid von Escherichia coli Serotyp O111:B4, 1 mg/ml

Merck KGaA, Darmstadt Lymphocytes separation media

®

(spezifisches Gewicht: 1,077 g/ml), steril filtiert

Capricorn Scientific GmbH, Ebsdorfergrund

Natriumchlorid (NaCl) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

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Natriumhydrogenkarbonat (NaHCO3) Merck KGaA, Darmstadt Natriumhydroxid-Plätzchen Merck KGaA, Darmstadt Natriumkarbonat (Na2CO3) Merck KGaA, Darmstadt

Natriumpyruvat Sigma-Aldrich, Steinheim

Paraformaldehyd Merck KGaA, Darmstadt

Penicillin-Streptomycin, liquid (100x)

steril filtiert Merck KGaA, Darmstadt

Percoll^TM , isoton

(spezifisches Gewicht: 1,130 g/ml)

GE Healthcare, Uppsala (Schweden) Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) Biomol GmbH, Hamburg

Pictilisib (GDC-0941) MedChemExpress, Monmouth Junction.

NJ 08852, USA

Poly(I:C) (HMW) Invivogen, Toulouse

Propidiumiodid (Calbiochem

®

) Merck KGaA, Darmstadt Rekombinantes bovines CXCL8 Biomol GmbH, Hamburg Rekombinantes bovines GM-CSF Biomol GmbH, Hamburg Rekombinantes bovines IL-6 Biomol GmbH, Hamburg Rekombinantes bovines TNF- Biomol GmbH, Hamburg RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin und

Natriumcarbonat, steril filtriert Merck KGaA, Darmstadt

Saccharose Merck KGaA, Darmstadt

Saponin Merck KGaA, Darmstadt

SB 225002 Biomol, Hamburg

Superoxiddismutase Sigma-Aldrich, Steinheim

Tris-HCl Merck KgAa, Darmstadt

Triton^® X-100 Sigma-Aldrich, Steinheim

Tween^® 20 Merck KGaA, Darmstadt

Wasserstoffperoxid VWR International GmbH, Darmstadt Zitronensäure Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe 3.3.4 VERWENDETE MEDIEN,ANTIBIOTIKA UND ZUSÄTZE

Verwendete Medien, Antibiotika und Zusätze

Hersteller, Ort

Amphotericin B (250 µg/ml) PAA, Laboratories GmbH, Pasching Fetales Kälberserum (Superior; FKS) Biochrom AG, Berlin

Gentamicin (10 mg/ml) PAA Laboratories GmbH, Pasching Penicillin/Streptomycin (10 mg/ml) Merck Biochrom GmbH, Berlin

RPMI-1640 Medium Merck Biochrom GmbH, Berlin

PBS; sterilisiert 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l NaPO4, 0,2 g/l KH2PO4

→ in Aqua bidest., pH 7,4 mit HCl/

NaOH

Haltungsmedium RPMI-1640 Medium + 1 %

Amphotericin B + 1 %

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Penicillin/Streptomycin + 15 µg/ml Gentamicin

Nährmedium RPMI-1640 Medium

Tyrode-Lösung 8 g/L NaCl, 200 mg/L KCl,

265 mg/L CaC12 · 2H2O, 213

Nach Abwiegen wurden die Chemikalien in Aqua dest. gelöst und mit 1 N NaOH

Nach Abwiegen wurden die Chemikalien in Aqua dest. gelöst und mit 1 N NaOH oder 3 N HCl auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt.

vor Verwendung 1 zu 10 in Aqua dest.

verdünnen

C-Puffer 6,398 g Zitronensäure, 0*H2O

11,866 g Na2HPO4, 2*H2O ad 1000 ml Aqua dest.

Nach Abwiegen wurden die Chemikalien in Aqua dest. gelöst und mit 1 N NaOH

Nach Lösen der Chemikalien in PBS wurde die Lösung mit einem 0,2 µm Filter steril filtriert.

Reagenz-Verdünnungslösung IL-1-ELISA und IL-6-IL-1-ELISA

2 g bovines Serumalbumin, Fraktion V

38

ad 50 ml PBS

Nach Lösen der Chemikalien in PBS wurde die Lösung mit einem 0,2 µm Filter steril filtriert.

Hemm-Puffer IL-1-ELISA und IL-6-ELISA

2 g bovines Serumalbumin, Fraktion V

2,5 g Saccharose ad 50 ml PBS

Nach Lösen der Chemikalien in PBS wurde die Lösung mit einem 0,2 µm Filter steril filtriert

Substrat TNF--ELISA und IL-8-ELISA 40 µl H2O2 3%

1 ml 3,3’,

5,5’-Tetramethyl[1,1’-diphenyl]-4,4’-diamin 10 ml C-Puffer

Bovine IL-1 ELISA Reagent Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, MA Bovine TNF- DuoSet^® ELISA R&D Systems Inc., Minneapolis, MN Bovine IL-6 ELISA Reagent Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, MA Fischhaut-Gelatine vom Kaltwasserfisch Sigma-Aldrich, Steinheim

Normal mouse serum ThermoFisher Scientific, Waltham, MA IL-8 (CXCL8) Monoclonal Antibody Rabbit Anti Sheep Interleukin-8 Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen

3.3.6 VITALITÄTSTEST

Chemikalie Hersteller, Ort

Ameisensäure-Propanol-Lösung 5 % Ameisensäure, 95 % Propanol MTT-Lösung (50 mg MTT) 14 mg

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-terazolium Bromid in 2 ml TKM-Puffer lösen

→in 18 ml Haltungsmedium überführen

TKM-Puffer 6,08 g/l TRIS-HCl,

85,576 g/l Saccharose, 1,86 g/l KCl, 1,018 g/l MgCl2 *6H2O

→in Aqua bidest., pH 7,6 mit NaOH

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4. M

ETHODEN

4.1 P

RECISION CUT BOVINE UDDER SLICES 4.1.1 HERKUNFT DES PROBENMATERIALS

Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Euter stammten von Schlachtkühen aus dem Fleischcenter Lübbecke der Firma Westfleisch SCEmbH. Es wurden klinisch gesunde Kühe ausgewählt, die sich in Alter und Laktationsstadium unterschieden. Ein Euter wurde dem Schlachtkörper nur entnommen, wenn weder Euter noch Schlachtkörper sichtbare Veränderungen aufwiesen. Euter mit vergrößerten oder atrophierten, geröteten oder verletzten Eutervierteln wurden nicht verwendet. Nach adspektorischer Einschätzung wurde das gesamte Euter abgetrennt und daraufhin mit heparinisierter Tyrode-Lösung (3.3.4) gespült.

Anschließend wurde es in das Labor des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht. Dort wurde aus jedem Euterviertel Milch ermolken und adspektorisch auf das Vorhandensein von Flocken überprüft, nach Farbe und Milchcharakter beurteilt und ein semiquantitativer Zellzahltest durchgeführt.

Euterviertel, deren Milch verändert oder deren somatische Zellzahl erhöht war, wurden verworfen. Von der Schlachtung des Tieres bis zur Probenentnahme vergingen maximal 5 Stunden.

4.1.2 GEWINNUNG VON PRECISION CUT BOVINE UDDER SLICES

Bei der Gewinnung der Eutergewebspräzisionsschnitte wurde nach der Methode verfahren, die FILOR (2019) im Rahmen einer Doktorarbeit etablierte. An dem ausgewählten Euterviertel wurden 10 cm * 10 cm * 3 cm große Gewebescheiben mit einem Skalpell entnommen. Dabei wurde darauf geachtet, dass die Schnittkanten glatt und gleichmäßig waren. Für die Gewinnung der precision cut bovine udder slices (PCBUS) wurden Gewebeanteile ausgewählt, die möglichst wenige Milchgänge und Blutgefäße enthielten.

Das Dermatom, eingestellt auf eine Schnittdicke von 250 µm, wurde mit mäßigem Druck über das Eutergewebe geführt, das mittels chirurgischer Pinzette auf einer dafür vorgesehen Schneideplatte fixiert wurde. Die entstandenen Eutergewebsschnitte wurden mithilfe einer atraumatischen Pinzette in ein Zentrifugenröhrchen überführt, das mit 20 ml steriler

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phosthatgepufferter Salzlösung (PBS, pH=7,4) gefüllt war und unter eine sterile Werkbank verbracht.

Dort wurden die Schnitte in drei aufeinander folgenden Schritten in Petrischalen, gefüllt mit PBS, durch vorsichtiges Schwenken gewaschen und dann mithilfe von Biopsiestanzen (6 mm) in gleichgroße Proben aufgeteilt. Die Stanzbiopsien wurden in 24-well-Flachbodenplatten überführt, die 500 µl Antibiotika-Waschlösung pro Vertiefung (well) enthielten. Darin wurden die PCBUS für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Orbitalschüttler bei 130 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Der Überstand wurde abgenommen und der Waschschritt wiederholt. Anschließend erfolgten zwei Waschschritte für jeweils 10 Minuten auf dem Orbitalschüttler in antibiotischem Haltungsmedium (RPMI++++), das aus RPMI-Medium mit dem Zusatz von Penicillin, Streptomycin, Gentamycin und Amphotericin B bestand. Final wurden die PCBUS in neue 24-well-Flachbodenplatten überführt, die mit 1 ml antibiotischem Haltungsmedium gefüllt waren, und bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert.

4.1.3 MTT-VITALITÄTSTEST

Um die Vitalität der Euterpräzisionsschnitte zu beurteilen, wurden ab dem Tag der Probennahme alle 24 bis 48 Stunden mindestens vier PCBUS für den Vitalitätstest entnommen.

Dabei wurde ein MTT-Vitalitätstest nach FILOR (2019) durchgeführt. Es wurden 7 mg MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid) in 1 ml TKM-Puffer (3.3.6) gelöst und diese MTT-Lösung in einem Verhältnis von 1 zu 10 im jeweiligen Medium verdünnt.

Die zu untersuchenden PCBUS wurden in 1 ml vorgewärmte MTT-Medium-Lösung in eine 24-well-Flachbodenplatte überführt. Darin inkubierten sie lichtgeschützt für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Orbitalschüttler bei 130 Umdrehungen pro Minute. In lebenden Zellen wird das gelbe Tetrazoliumbromid durch mitochondriale Reduktasen zu blauem Formazan reduziert. Sind die Gewebeproben nicht vital, erfolgt kein Farbumschlag.

Anschließend wurde der Überstand abgenommen und pro well 200 µl eines Gemisches aus 5 % Ameisensäure und 95 % Propanol zugegeben. Es folgte eine 40-minütige Inkubation, lichtgeschützt auf dem Orbitalschüttler, um das Formazan aus den PCBUS zu lösen. Von dem entstandenen Überstand wurden 100 µl in eine 96-well-Flachbodenplatte überführt und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 570 nm mithilfe eines Photometers gemessen. Als

41

Negativkontrolle dienten PCBUS, die für mindestens 30 Minuten bei 37 ° C und 5 % CO2 in 1000 µl Triton® X-100 inkubierten, welches zur Lyse von Zellmembranen führt. Nach dem Vitalitätstest wurden die PCBUS auf Filterpapier durch Auspressen getrocknet und deren Gewicht mithilfe einer Feinwaage bestimmt.

4.1.4 STIMULATIONSANSÄTZE FÜR PCBUS

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Stimulationsansätze mit unterschiedlichen Inkubationszeiten hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Vitalität der Eutergewebsschnitte und ihres Sekretoms untersucht (Abbildung 1 und Abbildung 2). Für die weitergehenden Untersuchungen wurden ausschließlich PCBUS-Überstände verwendet, die nach der Methode des Langzeitmodells generiert wurden.

4.1.4.1 Langzeitmodell (96 Stunden)

Nach Gewinnung der PCBUS wurden diese für 48 Stunden in antibiotischem Haltungsmedium (RPMI++++), mit einem Mediumwechsel nach 24 Stunden, bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

Nach 48 Stunden wurden die Schnitte in neue 24-well-Flachbodenplatten überführt, die entweder 1 ml RPMI Medium ohne Zusätze (R0) oder 1 ml RPMI Medium mit Zusatz von 10 % fetalem Kälberserum (FKS) enthielten. Nach weiteren 24 Stunden Verweilzeit wurden die PCBUS mit Lipopolysaccharid (LPS, ultrapure, aus Escherichia coli, O:111 B:5) in den Konzentrationen 10 und 100 ng/ml stimuliert. Wiederum nach 24 Stunden wurden die Überstände entnommen, aliquotiert und anschließend bei - 20 °C gelagert. Alle verwendeten PCBUS wurden nach der Stimulation einem MTT-Vitalitätstest unterzogen (Abbildung 1).

MTT

Inkubation

Entfernen der

Antibiose Überstände gewinnen

0 h 48 h 72 h

Stimulation

96 h 24 h

4 x Waschen

MTT MTT MTT MTT

42

Abbildung 1: Zeitverlauf der PCBUS-Stimulation im Langzeitmodell Zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 96 Stunden wurde ein Vitalitätstest durchgeführt.

4.1.4.2 Kurzzeitmodell (48 Stunden)

Nach Gewinnung der PCBUS wurden diese für 24 Stunden in antibiotischem Haltungsmedium (RPMI++++) bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Gewebeschnitte in neue 24-well-Flachbodenplatten überführt, die 1 ml RPMI-Medium ohne Zusätze (R0) und den jeweiligen Stimulus enthielten. Stimuliert wurden die PCBUS in diesem Ansatz entweder mit 100 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS, ultrapure, aus E. coli, O:111 B:5), mit Poly(I:C) in der Konzentration 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 µg/ml oder 100 µg/ml oder mit Pam3CSK4 in der Konzentration 100 ng/ml, 1 µg/ml oder 10 µg/ml.

Nach weiteren 24 Stunden wurden die Überstände entnommen und aliquotiert, um bei – 20 °C gelagert zu werden. Pro Stimulationsansatz wurde ein PCBUS für 24 Stunden in Formalin nach Lillie fixiert, die übrigen PCBUS wurden nach der Stimulation einem MTT-Vitalitätstest unterzogen (Abbildung 2).

Abbildung 2: Zeitverlauf der PCBUS-Stimulation im Kurzzeitmodell

Zu den Zeitpunkten 0, 24 und 48 Stunden wurde ein Vitalitätstest durchgeführt, ein Schnitt zur histologischen Untersuchung entnommen und in Formalin nach Lillie fixiert.

4.2 E

NZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY

Um die Sekretion ausgewählter Zytokine durch die PCBUS beurteilen zu können, wurden enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) der PCBUS-Überstände nach 24-stündiger Stimulation durchgeführt. Für alle im Folgenden aufgeführten Protokolle gilt, dass die

4 x Waschen

Inkubation

Entfernen der Antibiose, Stimulation

Überstände gewinnen

0 h 24 h _{48 h}

MTT MTT MTT

43

Komponenten vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt wurden. Alle Verdünnungen wurden am Tag ihrer Verwendung hergestellt und wiederholte Einfrier-Auftau-Zyklen wurden vermieden. Die verwendeten Protokolle für TNF-, IL-1 und IL-6 folgen dem Prinzip eines Sandwich-ELISA. Bei dem für CXCL8 verwendetem Protokoll handelt es sich um einen double antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay (DAS-ELISA), bei dem noch ein dritter, sekundärer Antikörper verwendet wird, der an den Nachweisantikörper bindet. 96-well-Maxisorp-Platten (3.3.2) wurden mit dem primären Antikörper beschichtet.

Eine Inkubation über Nacht diente der Adhärenz des Antikörpers an der Platte. Daraufhin wurde ein blockierender Puffer für 60 Minuten zugegeben, um unspezifische Proteinbindungen zu verhindern. Nach Verwerfen des blockierenden Puffers wurden die Negativ- und Positivkontrollen und die zu testenden Überstände jeweils in Duplikaten zugegeben. Wenn das nachzuweisende Molekül an den primären Antikörper gebunden hat, wurde es durch den folgenden Waschschritt nicht entfernt. Der Nachweisantikörper, ebenfalls ein primärer Antikörper, der für ein anderes Epitop auf dem Antigen spezifisch ist, konnte an das Antigen binden. Dieser Nachweisantikörper kann biotinyliert sein. Es folgte ein weiterer Waschschritt.

Anschließend wurde Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase zugegeben, wobei Streptavidin an das Biotin bindet und die Meerrettich-Peroxidase (HRP, horseradish peroxidase) das im nächsten Schritt zugegebene Substrat umsetzt und eine Farbreaktion auslöst. Diese Reaktion wurde durch Zugabe von Schwefelsäure gestoppt, wodurch ein Farbumschlag von blau zu gelb ausgelöst wurde. Die Messung der optischen Dichte erfolgte im Photometer (3.1) bei einer Messwellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge, die in Tabelle 1 angegeben ist.

Die Standardkurve wurde mithilfe der Software GraphPad Prism 8 (0) erstellt und durch Interpolation wurden die Zytokingehalte der PCBUS-Überstände abgeleitet. Beim CXCL8-ELISA, der nach dem Protokoll von CRONIN et al. (2015) durchgeführt wurde, kam ein dritter Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Antikörper zum Einsatz. Der folgenden Tabelle sind die Unterschiede zwischen den Protokollen zu entnehmen:

Tabelle 1: detaillierte ELISA-Protokolle nach Zytokin

TNF- IL-1 IL-6 CXCL8

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- Inkubationsdauer über Nacht über Nacht über Nacht über Nacht

Waschpuffer B-Puffer (3.3.5) B-Puffer 0,05 % Tween®20

in PBS 0,05 % Tween®20

Proben 120 Minuten 60 Minuten 60 Minuten 90 Minuten

Nachweis-AK

Inkubation 20 Minuten im

Dunkeln 30 Minuten 30 Minuten 60 Minuten im

Dunkeln

Substrat 10 ml C-Puffer 40 µl H2O2 1 ml

TMB im Kit im Kit 10 ml C-Puffer 40

µl H2O2 1 ml TMB

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Inkubation 20 Minuten im Dunkeln

Stopp-Lösung 1 N H2SO4

4.3 B

OVINE NEUTROPHILE

G

RANULOZYTEN

4.3.1 VERSUCHSTIERE FÜR DIE SEPARATION VON LEUKOZYTEN

Die Gewinnung boviner neutrophiler Granulozyten erfolgte aus heparinisiertem Vollblut, das bei Rindern der Rasse Deutsch Holstein der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover entnommen wurde (Aktenzeichen 33.19-42502-05-17A176). Es handelte sich um zehn weibliche Tiere, deren durchschnittliches Alter 8,5 Jahre betrug und in einem Bereich zwischen 3 und 14 Jahren streute. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Probenentnahme klinisch gesund, nicht tragend und nicht laktierend. Für jeden Versuchsansatz wurden mindestens sechs verschiedene Tiere verwendet.

4.3.2 BLUTENTNAHME

Zur Blutentnahme wurde das jeweilige Rind im Fanggitter und mittels eines Halfters fixiert und die Vena jugularis externa unter Verwendung einer Staukette nach Witte angestaut. Das Blut wurde über eine sterile Einmalkanüle (1,2 x 40 mm), eine Heidelberger Verlängerung und ein Vaccutainer®-System in Natrium-Heparin-Röhrchen geleitet. Nach der Entnahme von 20 ml bis 100 ml Blut wurden die Röhrchen 8 bis 10-malig geschwenkt und in einem wärmeisolierten Gefäß zum Labor transportiert.

4.3.3 SEPARATION NEUTROPHILER GRANULOZYTEN

Die Separation neutrophiler Granulozyten erfolgte unter einer sterilen Werkbank (3.1). Jeweils 20 ml heparinisiertes Vollblut wurden in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und mit 30 ml PBS vermischt, das auf 37 °C vorgewärmt war. Von diesem Blut-PBS-Gemisch wurden 35 ml mittels 10 ml-Pipette und elektronischer Pipettierhilfe über 15 ml Leukozytenseparationsmedium® (Ficoll 1,077g/ml), das ebenfalls auf 37 °C vorgewärmt wurde, überschichtet und für 30 Minuten bei 1000 * g und 10 °C mit nicht eingelegter Bremse

46

zentrifugiert. Daraufhin wurden die Interphase, vor allem aus mononukleären Zellen bestehend, das Separationsmedium und das darüber liegende Plasma abgenommen und verworfen. Es folgte eine erste hypotone Lyse, um die Erythrozyten aus dem Zellgemisch zu entfernen. Dazu wurde das Zellpellet, das überwiegend Erythrozyten, Thrombozyten und Granulozyten enthielt, resuspendiert und 20 ml steriles, vollentsalztes Wasser hinzugegeben, etwa 10 Sekunden geschwenkt und dann mit 20 ml doppelt konzentriertem PBS isoton ausgeglichen. Nach einem Zentrifugationsschritt bei 500 * g und 4 ° C für 10 Minuten mit eingelegter Bremse wurde der Überstand verworfen, das Zellpellet resuspendiert und eine zweite hypotone Lyse nach dem gleichen Schema durchgeführt und für 10 Minuten bei 250 * g und 4 °C zentrifugiert, um Thrombozyten zu entfernen. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet resuspendiert.

Im nächsten Schritt wurden Zellen in 50 ml PBS gewaschen und wiederum bei 125 * g, 4 °C für 10 Minuten mit eingelegter Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 5 ml Zellkulturmedium (RPMI 1640) resuspendiert. Von dieser Zellsuspension wurden 100 µl mit 100 µl Propidiumiodidlösung vermischt und davon 20 µl im Durchflusszytometer gemessen, um die Zellzahl, Reinheit und Vitalität der neutrophilen Granulozyten zu erfassen.

4.4 D

URCHFLUSSZYTOMETRIE

Die durchflusszytometrische Detektion von Zellen erfolgte mit dem BD Accuri™ C6 Durchflusszytometer und die Darstellung der Daten mit der BD Accuri™ C6 Software. Das Durchflusszytometer kann sowohl Streulicht als auch Fluoreszenzsignale einzelner Partikel analysieren. Es verfügt über zwei Laser, die Anregungswellen mit einer Länge von 488 nm (blaues Licht) und von 640 nm (rotes Licht) emittieren. Mit Hilfe von vier Fluoreszenzdetektoren kann die angeregte Fluoreszenz gemessen werden. Dabei wird der blaue Laser genutzt, um Fluoreszenz in den Kanälen 1 bis 3 zu detektieren und der rote Laser, um die Fluoreszenz im Kanal 4 zu messen. Außerdem wird das Streulicht über zwei Lichtstreuungsdetektoren in gerader (forward scatter, FSC) und seitlicher Richtung (side scatter, SSC) erfasst, wobei das gerade Streulicht ein Maß für die Größe und den Refraktionsindex der Zellen darstellt und das seitliche Streulicht ihre Oberflächenbeschaffenheit und Granularität widerspiegelt. Zur Definition von Zellgruppen können Software-gestützte, elektronische Fenster, sogenannte gates festgelegt und logisch

47

miteinander verknüpft werden. Dies ermöglicht, nur Zellen, die nach bestimmten Kriterien ausgewählt wurden, in eine Analyse einzuschließen. Im Folgenden wird zu jeder durchflusszytometrischen Methode eine kurze Gatingstrategie angegeben.

4.4.1 BESTIMMUNG VON ZELLZAHL UND VITALITÄT

Um nach der Separation von neutrophilen Granulozyten ihre Zellzahl und Vitalität zu bestimmen, wurden 100 µl Zellsuspension mit 100 µl Propidiumiodidlösung (4 µg/ml) vermengt und davon 20 µl im Durchflusszytometer erfasst. Das Fluorochrom Propidiumiodid (PI) passiert die Zellmembran nekrotischer Zellen und interkaliert mit deren DNA, wodurch sich die Fluoreszenzintensität erhöht. Zellen, die eine erhöhte Floureszenzkanal-3-(FL3)-Fluoreszenz aufweisen und als PI-positive Zellen bewertet werden, wurden aus der Auswertung ausgeschlossen. Durch die Darstellung der Fläche des FSC- gegenüber der Höhe des FSC-Signals konnte die Analyse auf einzelne Zellen, sogenannte singlets, die nicht in Aggregaten vorlagen, beschränkt werden. Außerdem wurde zwischen neutrophilen und eosinophilen Granulozyten anhand der eosinophilen Eigenfluoreszenz, die im Fluoreszenzkanal-1 erfasst wurde, unterschieden und die gewünschte Zellzahl eingestellt. Die Gatingstrategie ist in Abbildung 3 dargestellt.

48

Abbildung 3: Gatingstrategie für bovine neutrophile Granulozyten

Bovine PMN wurden mittels Dichtegradientenseparation aus heparinisiertem Vollblut gewonnen und auf eine Zellzahl von 1,2 * 10⁷ neutrophile Granulozyten pro ml RPMI-Zellkulturmedium eingestellt. 25 µl Zellsuspension wurden in einer 96-well-Rundbodenplatte mit 50 µl DHR in 100 % isotonem Percoll markiert. A) Polymorphkernige Leukozyten (Region „PMN“) wurden im FSC-A/SSC-A-Dichteplot identifiziert. B)Gating auf PMN und Darstellung der PMN im FL3-A/SSC-A-Dichteplot und Identifikation von Propidiumiodid-negativen (Region „vital), vitalen Zellen nach Quadranten-Analyse. C Gating auf „PMN“ und „vital“. Darstellung der vitalen PMN im FSC-A/FSC-H-Dichteplot zur Identifikation einzelner Zellen (Region „Singlets“) D) Gating auf

„Singlets“ und „PMN“ und „vital“. Darstellung der PMN im FL1-A/SSC-A-Dichteplot zur Unterscheidung zwischen neutrophilen (nPMN) und eosinophilen (ePMN) polymorphkernigen Leukozyten anhand ihrer Autofluoreszenz im Kanal FL-1. PMN = Polymorphkernige Lymphozyten, DHR = Dihydrorhodamin-123, FSC-A = foreward scatter-area, FSC-H = foreward scatter-height, SSC = side scatter, FL-1 = Fluoreszenzkanal-1.

A) B)

C) D)

Propidiumiodid

SSC SSC

FSC

FSC-A

FSC -H

FL-1

SSC

ePMN nPMN

PMN

singlets

vital PI +

49

4.4.2 INTRAZELLULÄRE BILDUNG REAKTIVER SAUERSTOFFSPEZIES

Zur Erfassung der Bildung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies wurden Granulozyten aus bovinem, heparinisierten Vollblut gewonnen und auf eine Zellzahl von 1,2 * 10⁷ neutrophile Granulozyten pro ml Zellkulturmedium eingestellt. In einer 96-well-Rundbodenplatte wurden 25 µl Zellsuspension mit 50 µl Dihydrorhodamin-123 (2,25 µg/ml) in 100 % isotonem Percoll markiert. Als Kontrolle dienten ungefärbte Granulozyten in 100 % isotonem Percoll. Wenn nicht anders benannt, erfolgte eine 30-minütige Inkubation mit 25 µl Stimulus oder Zellkulturüberstand bei 37 °C und 5 % CO2. Zur Induktion der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies wurden anschließend 25 µl PMA-Lösung in PBS zu den Granulozyten gegeben. Die finale PMA-Konzentration betrug 10 oder 100 nmol/l. Als Kontrolle diente die Zugabe von 25 µl PBS. Die durchflusszytometrische Messung erfolgte nach einer weiteren 30-minütigen Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2. Dazu wurden 125 µl Zellsuspension für etwa 30 Sekunden mit 100 µl Propidiumiodid-Lösung auf Eis inkubiert und anschließend 10.000 Zellen im Durchflusszytometer erfasst, die morphologisch als polymorphkernige Zellen klassifiziert wurden. Eine Unterscheidung zwischen neutrophilen und eosinophilen Granulozyten ist aufgrund der Zugabe von Dihydrorhodamin-123 nicht möglich. Ausgewertet wurde die mittlere Floureszenzintensität von Rhodamin-123, erfasst mithilfe des Fluoreszenzkanals-1. Diese stellt ein Maß für die Stärke der ROS-Bildung dar. Anhand der FL1-Floureszenz konnte dargestellt werden, ob DHR123 in das grün-fluoreszierende Rhodamin-123 umgesetzt wurde. Teilweise ist die relative ROS-Bildung dargestellt. Diese ergibt sich aus der Division der mittleren Rhodamin-123-Fluoreszenz durch die mittlere Rhodamin-Fluoreszenz der R0-Kontrolle ohne Zugabe von PMA.

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Abbildung 4: Gatingstrategie für die Messung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies

Bovine PMN wurden mittels Dichtegradientenseparation aus heparinisiertem Vollblut gewonnen und auf eine Zellzahl von 1,2 * 10⁷ neutrophile Granulozyten pro ml RPMI-Zellkulturmedium eingestellt. 25 µl Zellsuspension wurden in einer 96-well-Rundbodenplatte mit 50 µl DHR in 100 % isotonem Percoll markiert. A)

Bovine PMN wurden mittels Dichtegradientenseparation aus heparinisiertem Vollblut gewonnen und auf eine Zellzahl von 1,2 * 10⁷ neutrophile Granulozyten pro ml RPMI-Zellkulturmedium eingestellt. 25 µl Zellsuspension wurden in einer 96-well-Rundbodenplatte mit 50 µl DHR in 100 % isotonem Percoll markiert. A)

Im Dokument Induktion relevanter Immunmechanismen in bovinen Eutergewebspräzisionsschnitten (Seite 35-0)