10. A NHANG
10.2 Kultur von PCBUS unter Zusatz von FKS
Um den Einfluss von FKS im Kulturmedium von PCBUS auf die Vitalität nach LPS-Stimulation zu untersuchen, wurden PCBUS unter Zusatz von 10 % fetalem Kälberserum zu RPMI-1640-Medium kultiviert und mit 10 oder 100 ng/ml LPS stimuliert. Anschließend wurde ein MTT-Test durchgeführt (4.1.3).
Dabei konnte kein signifikanter Einfluss der LPS-Stimulation auf die Vitalität der PCBUS in R10F-Medium festgestellt werden.
OD
570 nmLPS (ng/ml) 100
Triton X 10
0 0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
174
Abbildung 34:Einfluss der LPS-Stimulation auf die Vitalität von PCBUS unter Zusatz von FKS Je 5 PCBUS von 6 Eutern wurden für 24 Stunden mit 10 oder 100 ng/ml LPS in R10F stimuliert. Als Kontrolle dienten PCBUS, die in R10F ohne Zusatz von LPS vorlagen. Die Überstände wurden entfernt und die Vitalität der PCBUS mittels MTT-Test (3.1.3) bestimmt. Als Negativkontrolle dienten PCBUS, die 30 Minuten in Triton® X-100 inkubierten. Dargestellt sind Minimum bis Maximum mit Median und Interquartilsabstand der optischen Dichte gemessen bei 570 nm. Unterschiede zwischen den Stichproben wurden mithilfe eines Friedman-Tests auf Signifikanz geprüft. LPS = Lipopolysaccharid, OD = optische Dichte, PCBUS = precision cut bovine udder slices, MTT = 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, R10F = RPMI-Medium mit Zusatz von 10 % fetalem Kälberserum, FKS = fetales Kälberserum.
175
10.3 A
BBILDUNGSVERZEICHNISAbbildung 1: Zeitverlauf der PCBUS-Stimulation im Langzeitmodell ... 42
Abbildung 2: Zeitverlauf der PCBUS-Stimulation im Kurzzeitmodell ... 42
Abbildung 3: Gatingstrategie für bovine neutrophile Granulozyten ... 48
Abbildung 4: Gatingstrategie für die Messung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies ... 50
Abbildung 5: Einfluss der Stimulation mit LPS auf die Vitalität von PCBUS gemessen als optische Dichte (OD) ... 61
Abbildung 6: Einfluss der LPS-Stimulation auf das Sekretom von PCBUS ... 63
Abbildung 7: fMLP induziert in bovinen neutrophilen Granulozyten keine intrazelluläre ROS-Bildung ... 65
Abbildung 8: Intrazelluläre ROS-Bildung und morphologische Veränderung bei der Ko-Inkubation mit PCBUS-Überständen ... 68
Abbildung 9: Intrazelluläre ROS-Bildung nach Vorinkubation mit PCBUS-Überständen ... 69
Abbildung 10: Priming von bovinen neutrophilen Granulozyten durch TNF- ... 71
Abbildung 11: Priming von bovinen neutrophilen Granulozyten durch GM-CSF, TNF-, TNF- und IL-6 ... 73
Abbildung 12: Modulation der ROS-Bildung durch TNF- und E. coli ... 76
Abbildung 13: Induktion der ROS-Bildung durch TNF- und S. aureus... 79
Abbildung 14: Einfluss von SOD und DPI auf die Bildung extrazellulärer ROS ... 80
Abbildung 15: Mittelwerte der Differenzen der optischen Dichte - extrazelluläre ROS-Bildung nach Stimulation mit PCBUS-Überständen ... 81
Abbildung 16: Die Bildung extrazellulärer ROS unter Einfluss von TNF- im Zeitverlauf .. 83
Abbildung 17: Einfluss von TNF- auf die Bildung extrazellulärer ROS zum Zeitpunkt 20 Minuten nach Zugabe von Cytochrom c und PMA ... 84
Abbildung 18: Einfluss der Separationsmethode auf die Bildung extrazellulärer ROS ... 87
Abbildung 19: Vergleich der Wirkung von PMA und hitzeinaktivierten, opsonisierten E. coli auf die extrazelluläre ROS-Bildung boviner PMN ... 89
Abbildung 20: PCBUS-Überstand-induzierte Migration im Rahmen einer Verdünnungsreihe ... 90
Abbildung 21: PCBUS-induzierte Migration boviner nPMN und Einfluss des Einzeltieres .. 91
Abbildung 22: PCBUS-induzierte Migration bei Verdünnung 1:5 und 1:10... 92
Abbildung 23: Transmigration boviner nPMN mit CXCL8 als Chemotaktikum ... 93
Abbildung 24: Einfluss von mouse-IgG2a-anti-bovine-CXCL8 auf die CXCL8-vermittelte Migration boviner neutrophiler Granulozyten ... 94
176
Abbildung 25: Einfluss von SB225002 auf die CXCL8-induzierte Migration boviner
neutrophiler Granulozyten ... 95 Abbildung 26: Einfluss von Pictilisib auf die CXCL8-induzierte Migration boviner
Granulozyten ... 96 Abbildung 27: Einfluss von Anti-CXCL8 auf die PCBUS-Überstand-induzierte
Migration boviner neutrophiler Granulozyten ... 97 Abbildung 28: Einfluss von Pictilisib auf die PCBUS-Überstand-vermittelte Migration
boviner neutrophiler Granulozyten ... 99 Abbildung 29: Einfluss von mouse-IgG1-anti-bovine-GM-CSF auf die
GM-CSF-vermittelte Migration boviner neutrophiler Granulozyten ... 100 Abbildung 30: Einfluss von AG490 auf die GM-CSF-vermittelte Migration boviner
neutrophiler Granulozyten ... 101 Abbildung 31: Einfluss der Zugabe von 10 ng/ml CXCL8 zu nicht-stimulierten und
LPS-stimulierten PCBUS-Überständen ... 102 Abbildung 32: Einfluss der Kombination aus GM-CSF und CXCL8 auf die Migration
boviner PMN ... 104 Abbildung 33: Vitalität und Sekretom von PCBUS nach LPS-Stimulation im
Kurzzeitmodell ... 173 Abbildung 34:Einfluss der LPS-Stimulation auf die Vitalität von PCBUS unter Zusatz
von FKS ... 174
10.4 T
ABELLENVERZEICHNISTabelle 1: detaillierte ELISA-Protokolle nach Zytokin ... 43 Tabelle 2: Einteilung der Signifikanzniveaus ... 60
177
D
ANKSAGUNG„Was du mit Gelde nicht bezahlen kannst, bezahle wenigstens mit Dank.“
An dieser Stelle möchte ich denjenigen Personen danken, ohne die diese Doktorarbeit niemals entstanden wäre:
Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth dafür, dass Sie mir zugetraut haben, diese Arbeit zu schreiben. Für Ihre stets geöffnete Bürotür, Ihre endlosen Ideen und Ihre Geduld. Dafür, dass sie mich ausgebremst haben, wenn ich alles direkt mit meinen Überständen ausprobieren wollte. Dafür, dass ich einen Eindruck bekommen habe, was wissenschaftliches Arbeiten sein kann.
Udo Raabe, der auch auf die 10. Verdünnungsrechnung noch einen geduldigen Blick warf und sogar vor 8 Uhr morgens schon ELISA-Waschmaschinen repariert hat, wo ich doch eigentlich nur den Müllbehälter ausgeleert habe.
Jutta Parker, die für jedes Problem ein offenes Ohr hatte und sogar eine Maske mit Schneemännern für mich besorgt hat.
Herrn Dr. Fritjof Freise für die statistische Beratung als Microsoft-Teams-Konferenz und dafür, dass sie es mir zur Not auch ein drittes Mal erklärt haben.
Prof. Dr. Manfred Kietzmann, der im Rahmen von Eutertreffen viele mögliche und unmögliche Ideen einbrachte und zusammen mit der Firma Simred, Frau Bettina Blume und der Firma Westfleisch SCE mbH dafür gesorgt hat, dass insgesamt 33 Euter den Weg von Minden-Lübbecke nach Hannover gefunden haben.
Prof. Dr. Hewicker-Trautwein und Kerstin Rohn, die viele PCBUS histologisch aufbereitet und untersucht haben.
Viviane Filor, die mir gezeigt hat, wie man Euter am geschicktesten in dünne Scheiben schneidet und am Leben erhält. Die am Samstag den MTT-Test übernommen hat, damit Zena und ich die Hundeschule nicht vernachlässigen und die nach einem kritischen Blick diverse Sätze dieser Arbeit aufgeteilt hat, damit sie lesbar werden.
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Hilke Oltmanns, die die besten Burger-Abende in ganz Hannover ausrichtet, ohne die ich Lillet Wild Berry nie kennengelernt hätte, die immer ein offenes Ohr für Hundegeschichten und Jagderlebnisse und einen Schlafplatz auf ihrem Sofa für mich hatte, während alle anderen die Fernsehsendung verfolgt haben und ohne die ich jede einzelne Abbildung dieser Arbeit nicht halb so oft neu eingefügt hätte.
Lisa-Marie Schünemann, dafür, dass du jede Auswertung mit angemessener Begeisterung bedacht und meine statistischen Berechnungen kritisch überprüft hast. Für unzählige gemeinsame Spaziergänge, Ausflüge zum Baggersee, in die Sauna, zum Poetry Slam und in die Heide. Danke für jedes gemeinsame Abendbrot-Essen und dass du mein Nörgeln über die einzige Staffel von Downton Abbey, die wir auf englisch gesehen haben, ertragen hast und dafür, dass du für jedes geschützte Leerzeichen und jeden geschützten Bindestrich in dieser Abeit gekämpft hast.
Ronja Hartmann, die mir gezeigt hat, wie man Neutrophile isoliert, wie man ROS misst und warum Transmigration in der 10-well-Kammer blöd ist. Danke für deine Geduld mit dem kleinen Hund im Büro und für die liebevolle Unterstützung bei jeder Power-Point-Präsentation.
Alina Kauke, die sogar zwei Tage vor Weihnachten noch eine meiner vielen allerletzten Migrationsversuche mit mir gemessen und keinen gemeinsamen Hundespaziergang bei noch so schlechtem Wetter gescheut hat. Danke, dass du mir gezeigt hast, wieviel Spaß der Anbau von Sojabohnen machen kann und danke für viele gemeinsame Wanderausflüge.
Alexandra Luccassen für die seelische Unterstützung in jeder Lebenslage und den entscheidenden Stups, mein Schicksal selbst in die Hand zu nehmen. Nicht zu vergessen danke für das beste Tomatensoßenrezept der Welt!
Louiza Tiedje für den kulinarischen und kreativen Donnerstagabend-Ausgleich und die sportliche Motivation in jeder Lebenslage – teilweise im Dunkeln und bei Krötenwanderung in der Eilenriede. Danke für die last minute Korrektur der gesamten 180 Seiten und dass du immer ein offenes Ohr für alle doktorarbeitsspezischen und –unabhängigen Sorgen und Probleme hattest.
Danke an Mama und Papa, dass ihr mir ermöglicht habt, zu werden, wer ich bin. Danke für eure Unterstützung.
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Danke an Zena vom Isenseer Kajedeich, die mir Bescheid gesagt hat, wenn es Zeit für Feierabend war; die dafür gesorgt hat, dass nach dem Mittagessen ein Spaziergang unternommen wurde; die mir beigebracht hat, dass man besser nichts Essbares auf dem Schreibtisch zurücklässt und die der perfekte Doktorarbeitsbegleithund war.
Danke an Friedrich Heitmann, der dafür gesorgt hat, dass ich zwischendurch nicht den Mut verloren habe und der mich am Wochenende mit in den Stall genommen hat, damit ich nicht vergesse, wie wichtig der Bezug zum Tier ist. Auch wenn du es nicht glauben wirst, ich habe diese Arbeit nicht aus einer Hängematte heraus geschrieben.