PCBUS-Kultur-Überstände als Chemotaktikum

5.5.1.1 Überstände von PCBUS sind chemotaktisch aktiv

Um das Sekretom von PCBUS daraufhin zu untersuchen, wie es die Migration neutrophiler Granulozyten beeinflusst, wurden die PCBUS-Kulturüberstände zunächst auf ihre chemotaktische Potenz analysiert. Dazu wurden neutrophile Granulozyten eines Rindes und die Überstände der PCBUS aus sechs Eutern verwendet, die zwischen 1:2 und 1:32 verdünnt eingesetzt wurden (4.4.4.5 A).

Sowohl die Überstände nicht-stimulierter als auch die Überstände LPS-stimulierter PCBUS führten in einer Konzentration von 1:2 und 1:4 zu einer gegenüber der Mediumkontrolle verstärkten Migration boviner neutrophiler Granulozyten. Unterschiede zwischen nicht-stimulierten und LPS-stimulierten PCBUS-Überständen wurden in den Verdünnungen 1:2 und 1:4 nachgewiesen (Abbildung 20).

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Abbildung 20: PCBUS-Überstand-induzierte Migration im Rahmen einer Verdünnungsreihe Im unteren well einer Transwell-Platte wurden 235 µl des verdünnten PCBUS-Überstandes (n = 6) vorgelegt. In das obere well wurden 600.000 bovine neutrophile Granulozyten (von einer Kuh) gegeben. Dargestellt sind Minimum bis Maximum der Migrationsrate mit dem Median und Interquartilsabstand. Unterschiede zwischen stimulierten und nicht stimulierten Überständen wurden mithilfe eines Vorzeichen-Rang-Tests auf Signifikanz geprüft und sind mit Sternchen über den Klammern dargestellt. Unterschiede zwischen der Überstand-stimulierten Migrationsrate und der jeweiligen Mediumkontrolle wurden mithilfe eines Friedman-Tests und eines Permutationstests auf Signifikanz geprüft (** 0,01 ≥ p > 0,001; *** p ≤ 0,001). LPS = Lipopolysaccharid, PCBUS = precision cut bovine udder slices, R0 = RPMI-1640 Zellkulturmedium ohne Zusätze.

Im Folgenden wurde eine PCBUS-Überstand-Verdünnung von 1:3 eingesetzt, um die migrationsfördernde Wirkung der PCBUS-Überstände der sechs verschiedenen Euter für neutrophile Granulozyten von sechs Kühen zu untersuchen und dabei einen sichtbaren Unterschied zwischen den Migrationsraten LPS-stimulierter und unstimulierter PCBUS-Überstände erkennen zu können.

Eine Verdünnung des Überstandes von 1:3 führte zu einer hochgradig signifikant stärkeren Migration induziert durch die LPS-stimulierten Überstände im Vergleich zu den Überständen nicht-stimulierter PCBUS (Abbildung 21, A). Im Rahmen dieses Versuches reagierten die PMN des Tieres 623 mit einer 40- bis 70-prozentigen Migrationsrate (Abbildung 21, B) deutlich weniger stark migratorisch aktiv als die PMN der übrigen untersuchten Tiere. Anhand dieses Tieres 623 wurde jedoch, wie in Abbildung 20 dargestellt, die Titration der PCBUS-Überstände durchgeführt und die Verdünnung ausgewählt, sodass die Migrationsrate der übrigen PMN-Spendertiere deutlich höher lag.

Migr atio n sr at e (%)

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Abbildung 21: PCBUS-induzierte Migration boviner nPMN und Einfluss des Einzeltieres

Im unteren well einer Transwell-Platte sind 235 µl des 1:3 verdünnten PCBUS-Überstandes (n = 6 Euter) vorgelegt. Als Negativkontrolle dienten R0 und R0 mit 25 ng/ml LPS. Als Positivkontrolle dienten 100 ng/ml CXCL8 und 20 ng/ml GM-CSF.In das obere well wurden 600.000 bovine neutrophile Granulozyten (von n = 6 Kühen) gegeben. Dargestellt sind Minimum bis Maximum der Migrationsrate mit dem Median und Interquartilsabstand. Unterschiede zwischen den Stichproben wurden mithilfe eines t-Tests auf Signifikanz geprüft (** 0,01 ≥ p > 0,001; *** p ≤ 0,001) A) Darstellung in Abhängigkeit vom Chemotaktikum B) Darstellung in Abhängigkeit vom PMN-Spendertier. IL-8 = Interleukin-8, GM-CSF = granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, LPS = Lipopolysaccharid, PCBUS = precision cut bovine udder slices, R0 = RPMI-1640 Zellkulturmedium ohne Zusätze.

Da eine Verdünnung von 1:3 noch zu sehr hohen Migrationsraten führte, vergleichbar mit der durch 100 ng/ml CXCL8 induzierten Migration, wurde für die folgenden Untersuchungen eine Verdünnung von 1:5 gewählt. Diese Verdünnung führte zu deutlich verringerten Migrationsraten von 41 % mit einem Interquartilsabstand von 35 % bei LPS-stimulierten PCBUS-Überständen und 6,3 % mit einem Interquartilsabstand von 4,9 % bei unstimulierten PCBUS-Überständen (Abbildung 22). Dabei unterschieden sich auch die Migrationraten der nicht stimulierten PCBUS-Überstände noch signifikant von der Mediumkontrolle (p = 0,3125).

6 313 435 480 623 724

B) Darstellung in Abhängigkeit vom PMN-Spendertier

Migr ation sr at e (%)

*** *** *** *** ** ***

A) PCBUS-induzierte Migration

LPS - + - + - + - + - + - +

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Abbildung 22: PCBUS-induzierte Migration bei Verdünnung 1:5 und 1:10

In das obere well einer Transwell-Platte wurden 600.000 bovine neutrophile Granulozyten (von n = 2 Kühen) gegeben. Im unteren well sind 235 µl des verdünnten PCBUS-Überstandes (n = 6) vorgelegt. Als Negativkontrollen dienten R0 und LPS in R0, als Positivkontrolle dienten 100 ng/ml CXCL8 in R0. Dargestellt sind Minimum bis Maximum der Migrationsrate mit dem Median und Interquartilsabstand. Unterschiede zwischen den Stichproben wurden mithilfe eines t-Tests auf Signifikanz geprüft (* 0,05 ≥ p > 0,01; ** 0,01 ≥ p > 0,001;).

LPS = Lipopolysaccharid, PCBUS = precision cut bovine udder slices, R0 = RPMI-1640 Zellkulturmedium ohne Zusätze.

Es wurde gezeigt, dass PCBUS-Überstände sehr stark chemotaktisch aktiv wirken. Worauf diese Wirkung zurückzuführen ist, blieb jedoch unklar. Das bekannteste Chemokin für neutrophile Granulozyten stellt CXCL8 dar. Dieses veranlasst in einer Konzentration von 100 ng/ml etwa 95 % der neutrophilen Granulozyten zur Migration. Deshalb sollte dieses Chemokin zunächst näher untersucht werden.

5.5.1.2 CXCL8 als wirksames Chemotaktikum für bovine PMN

Um der Frage nachzugehen, ob die Migration in Richtung von PCBUS-Überständen auf CXCL8 zurückzuführen ist, wurde versucht, dessen chemotaktische Wirkung zu blockieren.

Dazu wurden Antikörper gegen bovines CXCL8, SB225002 als ein Antagonist des CXCR2-Rezeptors und Pictilisib, das die Signalweiterleitung durch die PI3-Kinase hemmt, verwendet.

Zunächst wurde eine Titration der CXCL8-Kozentration von 3,125 bis 100 ng/ml vorgenommen. Die Migrationsrate steigt dosisabhängig mit sigmoidalem Kurvenverlauf an und erreich bei 100 ng/ml CXCL8 maximale Werte von 90 bis 95 % (Abbildung 23).

1:5 1:10

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Abbildung 23: Transmigration boviner nPMN mit CXCL8 als Chemotaktikum

In das untere well einer Transwell-Platte wurde CXCL8 in R0 vorgelegt. In das obere well wurden 600.000 bovine neutrophile Granulozyten (von n = 4 Kühen) zugegeben. Die Inkubation erfolgte über zwei Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 (4.4.4). Dargestellt sind Median und Interquartilsabstand. CXCL8 = CXC-Motiv-Chemokin-8, nPMN = neutrophile Granulozyten, R0 = RPMI-1640-Zellkulturmedium ohne Zusätze.

5.5.1.3 Hemmung der Migration durch anti-CXCL8

Um zu überprüfen, ob die CXCL8-induzierte In-vitro-Migration durch einen Antikörper gegen eben dieses inhibiert werden kann, wurde in das untere well einer Transwell-Platte neben 12,5 oder 25 ng/ml CXCL8 auch 500 oder 1000 ng/ml mouse-IgG2a-anti-bovine-CXCL8 vorgelegt (4.4.4.2).

Der Antikörper allein führte dazu, dass bovine neutrophile Granulozyten vermehrt wanderten (Abbildung 24, A). Die Migrationsrate stieg gegenüber der Kontrolle 0,86 % (Median) auf 2,29 % (Median) bei Zugabe von 500 ng/ml des Antikörpers an (Abbildung 24, A). Die CXCL8-induzierte Migration wurde durch den Antikörper jedoch dosisabhängig vermindert:

Die durch 12,5 ng/ml CXCL8-induzierte Migrationsrate von 12,6 % sank auf 5,6 % signifikant ab (Abbildung 24, B). Die durch 25 ng/ml CXCL8-induzierte Migrationsrate von 36 % wurde durch die Anwesenheit des CXCL8-spezifischen Antikörpers (500 oder 1000 ng/ml) auf 12-15 % signifikant vermindert (Abbildung 24, C).

Da sich die durch 12,5 und 25 ng/ml CXCL8-induzierte Migration durch den Antikörper teilweise blockieren ließ, wurde dieser Antikörper im Folgenden verwendet, um die

50 100 25

12,5 6,25 3,125 CXCL8

(ng/ml)

Migr ation sr at e (%)

0 20 40 60 80

100 IL-8

0

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PCBUS-Überstand-induzierte Migration auf eine Beteiligung von CXCL8 näher zu untersuchen (5.5.1.6).

Abbildung 24: Einfluss von mouse-IgG2a-anti-bovine-CXCL8 auf die CXCL8-vermittelte Migration boviner neutrophiler Granulozyten

In das untere well einer Transwell-Platte wurden 235 µl CXCL8 mit oder ohne anti-CXCL8 in R0 vorgelegt (A) ohne CXCL8-Zugabe, B) mit 12,5 ng/ml CXCL8, C) mit 25 ng/ml CXCL8). In das obere well wurden 75 µl bovine neutrophile Granulozyten (von n = 6 Kühen, 8*10⁶/ml R0) zugegeben. Als Kontrollen dienten Ansätze, die R0-Medium oder den Antikörper ohne CXCL8 beinhalteten. Die Inkubation erfolgte über zwei Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 (4.4.4). Dargestellt sind Median und 95%-Konfidenzintervall. Unterschiede zwischen den Stichproben wurden mithilfe eines Friedman-Tests und eines Permutationstests auf Signifikanz geprüft (* 0,05 ≥ p > 0,01; ** 0,01 ≥ p > 0,001). CXCL8 = CXC-Motiv-Chemokin-8, nPMN = neutrophile Granulozyten, R0 = RPMI-1640 Zellkulturmedium ohne Zusätze.

A) R0

B) 12,5 ng CXCL8/ml C) 25 ng CXCL8/ml

Anti-CXCL8 (ng/ml)

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5.5.1.4 Keine Hemmung der Migration durch Rezeptorantagonisten SB225002

Ein weiterer Ansatzpunkt, um die CXCL8-induzierte Migration zu hemmen, stellte die Blockade der CXCL8-assoziierten Rezeptoren CXCR1 und CXCR2 dar. Um zu untersuchen, ob der CXCR2-Rezeptorantagonist SB225002 die CXCL8-induzierte Migration wirksam vermindern kann, wurde bovinen neutrophilen Granulozyten 1 µmol/l SB225002 zugegeben:

Anschließend wurde die Zellsuspension in das obere well einer Transwell-Platte gegeben und die CXCL8-induzierte Migration untersucht (4.4.4.3).

Eine signifikante Hemmung der CXCL8-induzierten Migration durch SB225002 konnte nicht festgestellt werden (Abbildung 25). SB225002 wurde daher nicht für weitere Untersuchungen zur PCBUS-Überstand-induzierten Migration verwendet.

Abbildung 25: Einfluss von SB225002 auf die CXCL8-induzierte Migration boviner neutrophiler Granulozyten

Nach einer Vorinkubation mit 1 µmol/l SB225002 für 30 Minuten wurden 300.000 bovine neutrophile Granulozyten (von n = 6 Kühen) in das obere well einer Transwell-Platte gegeben. Im unteren well war CXCL8 (0, 5, 10, 20 ng/ml) in R0 vorgelegt. Als Kontrollen dienten Ansätze, die R0-Medium enthielten und nPMN, die mit PBS vorinkubiert wurden. Die Migrationsinkubation erfolgte über zwei Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 (4.4.4.3). Dargestellt sind Minimum bis Maximum mit dem Median und Interquartilsabstand.

Unterschiede zwischen den Stichproben wurden mithilfe eines Friedman-Tests auf Signifikanz geprüft. Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. CXCL8 = CXC-Motiv-Chemokin-8, nPMN = neutrophile Granulozyten, PBS = phosphatgepufferte Salzlösung, R0 = RPMI-1640 Zellkulturmedium ohne Zusätze.

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5.5.1.5 Hemmung der Migration durch PI3K-Inhibitor Pictilisib

Des Weiteren wurde der Einfluss von Pictilisib, auch GDC-0941 genannt, auf die CXCL8-induzierte Migration boviner neutrophiler Granulozyten untersucht. Pictilisib hemmt die PI3-Kinase und könnte auf diesem Weg die Signaltransduktion, die zur Migration führt, beeinflussen. Dazu wurden bovine nPMN über 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 nach Zugabe von 50 nmol/l Pictilisib inkubiert. Anschließend wurde in einer Transwell-Platte der Einfluss auf die CXCL8-induzierte Migration untersucht (4.4.4.3).

Auf die durch 10 ng/ml CXCL8 ausgelöste Migration hatte Pictilisib einen geringgradig signifikanten, hemmenden Einfluss. Die Migrationsrate wurde durch Zugabe von Pictilisib von 9,7 % auf 3,7 % reduziert (p = 0,313). Dieser Effekt konnte bei 5 oder 20 ng/ml CXCL8 nicht festgestellt werden (Abbildung 26).

Abbildung 26: Einfluss von Pictilisib auf die CXCL8-induzierte Migration boviner Granulozyten

Nach einer Vorinkubation mit 50 nmol/l Pictilisib für 30 Minuten wurden je 300.000 bovine neutrophile Granulozyten (von n = 6 Kühen) in das obere well einer Transwell-Platte gegeben. Im unteren well wurde CXCL8 in R0 vorgelegt. Als Kontrollen dienten Ansätze, die R0-Medium enthielten und nPMN, die mit PBS vorinkubiert wurden. Die Migrationsinkubation erfolgte über zwei Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 (4.4.4.3). Dargestellt sind Minimum bis Maximum der Migrationsrate mit dem Median und Interquartilsabstand. Unterschiede zwischen den Stichproben wurden mithilfe eines Friedman-Tests und eines Permutationstests auf Signifikanz geprüft (* 0,05 ≥ p > 0,01). CXCL8 = CXC-Motiv-Chemokin-8, nPMN = neutrophile Granulozyten, R0 = RPMI-1640 Zellkulturmedium ohne Zusätze.

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5.5.1.6 Keine Hemmung der Migration durch Anti-CXCL8

Da in 5.5.1.3 gezeigt wurde, dass ein CXCL8-spezifischer Antikörper die CXCL8-induzierte Migration reduzieren kann, wurde dieser Antikörper im nächsten Schritt verwendet, um der Frage nachzugehen, ob die Migration hin zu LPS-stimulierten PCBUS-Überständen auf CXCL8 als Chemokin zurückzuführen ist. Hierfür wurden die 1:5 verdünnten PCBUS-Überstände zunächst mit 1 µg/ml eines mouse-IgG2a-anti-bovine-CXCL8-Antikörpers inkubiert, um eine Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen (4.4.4.5 C).

Im Vergleich zu den nicht-stimulierten PCBUS-Überständen führte die LPS-Stimulation zu einer hochgradig signifikanten Steigerung der Migrationsrate boviner nPMN. Ein signifikanter Unterschied zwischen den LPS-stimulierten PCBUS-Überständen und solchen Überständen, die mit dem Anti-CXCL8-Antikörper vorinkubiert wurden, konnte festgestellt werden, dabei steigerte die Zugabe des Antikörpers zu PCBUS-Überständen die Migrationsrate. (Abbildung 27).

Abbildung 27: Einfluss von Anti-CXCL8 auf die PCBUS-Überstand-induzierte Migration boviner neutrophiler Granulozyten

In das untere well einer Transwell-Platte wurde der 1:5-verdünnte PCBUS-Überstand (n = 6 Euter) zusammen mit anti-CXCL8 vorgelegt. In das obere well wurden 300.000 bovine neutrophile Granulozyten (von n = 6 Kühen) gegeben. Als Kontrolle dienten Überstände von nicht stimulierten PCBUS und Überstände, die nicht mit anti-CXCL8 vorinkubiert wurden (4.4.4.5 C). Dargestellt sind Minimum bis Maximum der Migrationsrate mit dem Median, dem Interquartilsabstand und Einzelwerten. Unterschiede zwischen den Stichproben wurden mithilfe eines Vorzeichen-Rang-Test auf Signifikanz geprüft (*** p ≤ 0,001). CXCL8 = CXC-Motiv-Chemokin-8, LPS = Lipopolysaccharid, PCBUS = precision cut bovine udder slices, R0 = RPMI-1640 Zellkulturmedium ohne Zusätze

0 20 40 60 80 100

Migr ation sr at e (%)

LPS

- + +

Anti-CXCL8

- - +

*** ***

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5.5.1.7 Hemmung der PCBUS-Überstand-induzierten Migration durch Pictilisib Pictilisib, auch GDC-0941 genannt, hemmt das Enzym PI3-Kinase. Dieses Enzym ist an der Signaltransduktion von CXCL8 und anderen sogenannten intermediären chemotaktischen Signalen in neutrophilen Granulozyten beteiligt (HONG et al. 2017). Um zu untersuchen, inwieweit solche intermediären Signale für die Migration boviner neutrophiler Granulozyten hin zu PCBUS-Überständen ursächlich sind, wurden die nPMN vor der Migration über 30 Minuten mit 50 nmol/l Pictilisib inkubiert. Anschließend erfolgte die In-vitro-Migration mit 1:5-verdünnten PCBUS-Überständen als Chemotaktikum.

Die Migrationsrate derjenigen bovinen neutrophilen Granulozyten, die mit Pictilisib vorbehandelt waren, ist hochgradig signifikant niedriger als die Migrationsrate der unbehandelten nPMN (Abbildung 28). Pictilisib vermindert die Migrationsrate, induziert durch LPS-stimulierten PCBUS-Überstand, von 27,3 % auf 17,4 %.

Damit wurde gezeigt, dass die Hemmung der PI3-Kinase einen Einfluss auf die PCBUS-Überstand-induzierte Migration boviner neutrophiler Granulozyten hat.

LPS

+ +

Pictilisib

- +

0 20 40 60 80 100

Migr ation sr at e (%)

-*** ***

99

Abbildung 28: Einfluss von Pictilisib auf die PCBUS-Überstand-vermittelte Migration boviner neutrophiler Granulozyten

Nach einer Vorinkubation mit 50 nmol/l Pictilisib für 30 Minuten wurden je 300.000 bovine neutrophile Granulozyten (von n = 6 Kühen) in das obere well einer Transwell-Platte gegeben. In die unteren wells wurde der 1:5-verdünnte PCBUS-Überstand (n = 6 Euter) vorgelegt. Als Kontrolle dienten Zellen, die mit PBS statt Pictilisib vorinkubiert wurden. Dargestellt sind Minimum bis Maximum der Migrationsrate mit dem Median, Interquartilsabstand und Einzelwerten. Unterschiede zwischen den Stichproben wurden mithilfe eines t-Tests auf Signifikanz geprüft (*** p ≤ 0,001). LPS = Lipopolysaccharid, PCBUS = precision cut bovine udder slices, R0 = RPMI-1640 Zellkulturmedium ohne Zusätze.

Im Dokument Induktion relevanter Immunmechanismen in bovinen Eutergewebspräzisionsschnitten (Seite 89-99)