Funktionelle Charakterisierung der Interaktion zwischen bakteriellen Superantigenen und
bovinen neutrophilen Granulozyten
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Corinna Krüger
aus Hannover
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
1. Gutachter: PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. P. Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2001
Meinen Eltern in Liebe und Dankbarkeit
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ... 8
1 Einleitung und Zielsetzung ... 13
2 Literaturübersicht... 15
2.1 Bakterielle Superantigene...15
2.1.1 Klassifikation und Struktur ... 16
2.1.2 Bindungsmechanismen an Immunzellen... 18
2.1.3 Konsequenzen der Superantigenbindung an MHC-Klasse-II-Moleküle und den T-Zellrezeptor... 19
2.1.4 Superantigene bei Staphylokokken-Infektionen der Haustiere ... 21
2.2 Weitere zytotoxische Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus ...24
2.3 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten...25
2.3.1 Morphologische und phänotypische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten ... 25
2.3.2 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr... 27
2.4 Apoptose...30
2.4.1 Zellmorphologie und zeitliche Abfolge der Apoptose ... 32
2.4.2 Regulation der Apoptose ... 35
2.4.3 Apoptose bei neutrophilen Granulozyten... 37
2.4.4 Caspasen und Caspase-Inhibitoren... 39
3 Geräte, Material und Methoden... 42
3.1 Geräte ...42
3.2 Material...43
3.2.1 Verbrauchsmaterialien... 43
3.2.2 Reagenzien ... 44
3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien ... 45
3.2.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ... 47
3.2.5 Staphylococcus aureus Isolate... 53
3.2.6 Tiere und humane Probanden... 54
gerinnungsgehemmtem Blut ...54
3.3.2 Vitalitätsbestimmung von Zellen...58
3.3.3 Durchflußzytometrie ...59
3.3.4 Zellkultivierungen in vitro ...65
3.3.5 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) ...67
3.3.6 Statistische Verfahren ...69
4 Ergebnisse ...70
4.1 Charakteristika des Absterbens boviner neutrophiler Granulozyten in vitro...70
4.1.1 Einfluß von Superantigenen auf reine PMN...70
4.1.2 Einfluß von Superantigenen auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen von PMN und MNC...72
4.1.3 Einfluß von Kulturüberständen Superantigen-stimulierter mononukleärer Zellen auf neutrophile Granulozyten ...78
4.1.4 Der Einfluß mononukleärer Mediatoren auf die Regulation der in vitro Reaktionen boviner Zellen auf bakterielle Superantigene ...80
4.2 Untersuchungen zur modulatorischen Bedeutung von Caspasen ...87
4.2.1 Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Vitalität reiner neutrophiler Granulozyten in vitro ...87
4.2.2 Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten in Kokultur mit mononukleären Zellen...88
4.2.3 Einfluß von Caspase-Inhibitoren auf die Superantigen-induzierte Proliferation boviner mononukleärer Zellen...91
4.3 Untersuchungen über die Häufigkeit des Auftretens Superantigen- bzw. Leukotoxin-produzierender Staphylococcus aureus Stämme ...94
4.3.1 Unterschiede zwischen Leukotoxin- und Superantigen-produzierenden Staphylococcus aureus Isolaten ...94
4.3.2 Frequenz und Eigenschaften von Leukotoxin-enthaltenden Kulturüberständen von Staphylococcus aureus ...96
4.3.3 Frequenz und Eigenschaften von Superantigen-enthaltenden Kulturüberständen von Staphylococcus aureus ...97
5 Diskussion... 105
5.1.1 Methodischer Ansatz... 105
5.1.2 Die Interaktion zwischen Superantigenen und neutrophilen Granulozyten... 107
5.1.3 Die modulatorische Bedeutung von Caspase-Inhibitoren ... 111
5.1.4 Charakterisierung von Staphylococcus aureus Isolaten ... 115
6 Zusammenfassung... 119
7 Summary ... 122
8 Literaturverzeichnis... 125
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Abb. Abbildung
Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser)
BoCD bovine cluster of differentiation, Bezeichnung für bovine Homologe zu humanen Differenzierungsantigenen mit CD-Nomenklatur
BoLA bovine cluster of differentiation, Bezeichnung für den Haupthistokompatibilitätskomplex des Rindes
BSA bovines Serumalbumin
bspw. beispielsweise bzw. beziehungsweise
c1 Caspase-1-Inhibitor (Z-VAD-FMK)
c2 Caspase-2-Inhibitor (Ac-VDVAD-CHO)
c8 Caspase-8-Inhibitor (Z-IETD-FMK)
C5a aktiviertes Fragment der Komplementkomponente C5 ca. zirka
CD Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungs- antigenen)
CD4+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD4 an der Oberfläche exprimieren CD8+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD8 an der Oberfläche exprimieren cMed Überstände mononukleärer Zellen, die für 24h in Medium inkubiert wurden CR complement receptor (Komplementrezeptor)
cSEA Überstände mononukleärer Zellen, die für 24h mit SEA (1 ng/ml) stimuliert wurden
d dies (lateinisch: Tag); d0 = Ausgangsmessung vor einem Versuch, d5, d6 = 5 bzw. 6 Tage nach Versuchsbeginn
DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGZ Eosinophile Granulozyten
FACScan® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmeßgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg)
FADD Fas-associated death domain protein (Fas-assoziiertes Protein, das eine Todesdomäne enthält)
FasL Fas-Ligand
FCM Flow Cytometer (Durchflußzytometer) FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) fg Femtogramm (x 10-15)
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FL1, 2, 3 Meßkanäle des Durchflußzytometers für emittierte Fluoreszenz
FL1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm;
FL3 = Rotfluoreszenz, >650 nm)
FMLP N-Formyl-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht), Meßparameter des FACScan® g Gramm
G-CSF granulocyte-colony stimulating factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (Granulozyten-
Makrophagen-Wachstumsfaktor) h hora (lateinisch: Stunde)
IAP inhibitor of apoptosis (Apoptose-hemmende Proteinfamilie) ICAM intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) ICE Interleukin-1 β-converting enzyme
i.d.R. in der Regel
I10F Iscové-Medium mit 10% FCS IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin kD Kilodalton (x 103 Dalton) l Liter
LFA-1 Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1 LPS Lipopolysaccharid
LTB4 Leukotrien B4
LT-SN(s) Leukotoxin-enthaltende Überstände von S. aureus Isolaten von Kühen mit Mastitis
µ mikro (x 10-6) m milli (x 10-3)
mAK monoklonale(r) Antikörper MAM Mykoplasma arthritidis Mitogen MAS Mykoplasma arthritidis Superantigen
MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz
min Minute(n)
MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes) MMTV Mouse Mammary Tumor Virus
MW arithmetischer Mittelwert
n bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen NaCl Natriumchlorid
n.d. not done (nicht durchgeführt) ng Nanogramm (x 10-9)
NMLA NG-Monomethyl-L-Arginin NO nitric oxide (Stickstoffmonoxid)
Nr. Nummer
p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen PAF platelet-activating factor (Thrombozyten-aktivierender Faktor)
PARP Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase
PCD programmierter Zelltod
pg Picogramm (x 10-12)
PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PECAM platelet endothelial cell adhesion molecule
Pellet Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen
PGE2 Prostaglandin E2
PI Propidiumiodid
PMN Polymorphonuclear leukocytes (Granulozyten) PS Phosphatidylserin
r Korrelationskoeffizient
rhTNF-α rekombinantes humanes TNF-α
RIP receptor interacting protein (interagiert mit dem Rezeptor: TNF-R1) RAIDD RIP-associated ICH-1/Ced-3 homologous death domain protein (mit RIP
assoziiertes Protein, das eine Todesdomäne enthält) RT Raumtemperatur
s Standardabweichung
s. siehe
s.S. siehe Seite
S. aureus Staphylococcus aureus
SAg-SN(s) Superantigen-enthaltende Überstände von S. aureus Isolaten von Kühen mit Mastitis
Sc. Streptococcus
SDCC Superantigen Dependent Cellular Cytotoxicity (Superantigen-abhängige zelluläre Zytotoxizität)
SE Staphylokokken-Enterotoxine SEA, B, ... Staphylococcus aureus Enterotoxin A, B, … sek Sekunde(n)
sog. sogenannte(r)
SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Meßparameter des FACScan® Tab. Tabelle
TCR T cell receptor (T-Zellrezeptor) TNF Tumornekrosefaktor
TRADD TNF receptor-associated death domain protein (mit dem TNF-Rezeptor assoziiertes Protein, das eine Todesdomäne enthält)
TSST-1 Toxic Shock Syndrome Toxin 1 (toxischer Schock-Toxin-1)
u.a. unter anderem
vgl. vergleiche
xg multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
1 Einleitung und Zielsetzung
Bakterielle Superantigene sind Proteine, die in typischer Weise mit Zellen des Immunsystems interagieren. Sie können T-Zellen unabhängig von ihrer Antigen- spezifität durch Bindung an MHC-Klasse-II-Produkte antigenpräsentierender Zellen einerseits und den T-Zellrezeptor andererseits polyklonal stimulieren. In Folge der Aktivierung der verschiedenen Zellarten kommt es zu einer massiven Ausschüttung unterschiedlicher Mediatoren, die wiederum zur Aktivierung, zur Ausdifferenzierung und zum Absterben funktionell unterschiedlicher Zellsubpopulationen beitragen können. Auf diese Weise kann eine fein regulierte Immunantwort empfindlich gestört werden. Aus dieser Dysregulation der Immunantwort ergibt sich die pathogenetische Bedeutung der Superantigene. Dies gilt sowohl für Infektionserkrankungen, an denen Superantigen-Bildner beteiligt sind als auch für Autoimmunerkrankungen, die durch Superantigene induziert oder in ihrem Verlauf beeinflußt werden können.
Während den klassischen Wirkungen von Superantigenen auf humane und murine B-Zellen und T-Zellen sehr viel Aufmerksamkeit geschenkt wurde, fanden mögliche Effekte auf andere Zelltypen bisher eher wenig Beachtung. Zudem sind die Kenntnisse über die Wirkungsweisen von Superantigenen auf Immunzellen veterinärmedizinisch relevanter Spezies noch relativ begrenzt. Wichtig wären solche Informationen bspw. für den Hund, wo der Superantigen-Bildner Staphylococcus intermedius ursächlich für z.T.
schwer therapierbare Pyodermien ist. Beim Rind verursacht der Superantigen-Bildner Staphylococcus aureus klinisch sehr variable Formen der Mastitis.
Hieraus ergaben sich für die vorgestellte Arbeit verschiedene Fragenkomplexe. Zum einen sollte geprüft werden, ob bakterielle Superantigene einen direkten oder indirekten Einfluß auf bovine neutrophile Granulozyten nehmen. Grundlage für diese Hypothese waren Studien, die eine Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen auf aktivierten humanen eosinophilen und neutrophilen Granulozyten zeigten (GOSSELIN et al. 1993, WELLER et al. 1993, GUIDA et al. 1994). Mithin sind Granulozyten prinzipiell in der Lage, den Liganden für Superantigene auszuprägen und sie zu binden. Überdies wäre eine Beeinflussung von neutrophilen Granulozyten in der Frühphase einer Infektion aus Sicht des Erregers durchaus sinnvoll.
Zum anderen fokussieren sich die in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen auf die Superantigen-vermittelte Modulation der Vitalität boviner Granulozyten. Besondere Aufmerksamkeit wird der Charakterisierung der beteiligten Mechanismen gewidmet:
Es soll geprüft werden, welche Relevanz bestimmten Mediatoren, Zytokinen, Zell- Zellinteraktionen oder intrazellulären Vermittlern des induzierten Zelltodes (der Apoptose) bei den beobachteten Phänomenen zukommt. Grundlage für diese Studien sind durchflußzytometrische Verfahren zur qualitativen und quantitativen Zellanalyse.
Es wird gezeigt werden, daß Superantigene von Staphylococcus aureus bovine neutrophile Granulozyten in charakteristischer Weise negativ in ihrer Vitalität beeinflussen. Der Mechanismus des leukozytotoxischen Effektes von Superantigenen unterscheidet sich deutlich von dem, der durch andere Virulenzfaktoren von S. aureus, den sog. „Leukotoxinen“ (oder „Leukozidinen“), vermittelt wird. Beiden Faktoren- gruppen wird in der Pathogenese der bovinen Mastitis eine tragende Rolle zugemessen (LOEFFLER et al. 1988, FERENS et al. 1998).
Der in dieser Arbeit entwickelte durchflußzytometrische Ansatz, Superantigene und Leukotoxine auf Grund ihres charakteristischen granulozytotoxischen Verhaltens zu identifizieren, wird im zweiten Teil der Arbeit daher auf die Frage angewendet, ob und in welcher Häufigkeit S. aureus Isolate von subklinisch und klinisch an Mastitis erkrankten Rindern Leukotoxine, Superantigene oder beide Faktorengruppen gleich- zeitig produzieren.
2 Literaturübersicht
S. aureus ist ein weitverbreiteter Erreger, der in vielen verschiedenen Wirten unterschiedliche Krankheiten hervorruft. Die Fähigkeit dieses Bakteriums, in Wirtsorganismen häufig persistieren zu können, beruht hauptsächlich auf einer hohen Anzahl von Virulenzfaktoren. Diese vermitteln u.a. die Adhäsion an Wirtsgewebe, den Erwerb von Nährstoffen und den Schutz vor der immunologischen Abwehrreaktion des Wirtes (MONDAY & BOHACH 1999a). Besondere Aufmerksamkeit haben in den letzten Jahren die von S. aureus produzierten Enterotoxine (oder Superantigene) erregt (s. 2.1), da sie an Zelloberflächenstrukturen binden, die bei der normalen Antigenpräsentation und -erkennung an zentraler Stelle stehen. Andere Virulenzfaktoren, die Immunzellen direkt beeinflussen, sind schon länger bekannt.
Einige von ihnen, die Leukotoxine, töten direkt polymorphkernige Granulozyten (s. 2.2).
Eine Beeinflussung dieser Zellen des Antigen-unspezifischen Immunsystems (s. 2.3) scheint aus Sicht des Erregers ein sinnvolles und wichtiges Ereignis zu sein. Dies war mit einer der Gründe, in dieser Arbeit nach der Regulation der Apoptose (s. 2.4) polymorphkerniger Granulozyten durch Superantigene zu fahnden.
2.1 Bakterielle Superantigene
Der Begriff „Superantigene“ bezeichnet eine heterogene Gruppe von Proteinmolekülen, die mit Antigen-präsentierenden Zellen und T-Lymphozyten interagieren. Hierzu ist nicht die intrazelluläre Prozessierung, die üblicherweise für ein Antigen typisch ist, erforderlich (FLEISCHER & SCHREZENMEIER 1988), sondern die Aktivierung erfolgt nach Assoziation mit dem MHC-Klasse-II-Molekül der Antigen-präsentierenden Zelle und der Vβ-Region des T-Zellrezeptors von T-Lymphozyten (GASCOIGNE 1993). Durch diese Interaktion sind Superantigene in der Lage, eine deutlich höhere Prozentzahl des T-Zellreservoirs des Wirtes zu aktivieren als durch die Präsentation eines, auf herkömmliche Weise prozessierten, Antigens erfolgt. In Abhängigkeit vom jeweiligen Superantigen und der Frequenz von „passenden“ variablen Rezeptorsegmenten führt diese Interaktion zur initialen Proliferation von bis zu 25% des individuellen T-Zellrepertoires, während die Reaktionshäufigkeit bei der normalen Antigenpräsentation unter 0,1% der Zellen liegt (IRWIN & GASCOIGNE 1993).
Die Konsequenzen dieser Art von Interaktion sind vielfältig. Auf der Seite der T-Zellen kann dies zu polyklonaler Proliferation, zur Induktion von Apoptose und/oder Anergie der Zellen führen (HERMAN et al. 1991, HUANG & CRISPE 1993). Ähnliche Beobachtungen konnten auch bei Superantigen-präsentierenden Zellen (MHC-Klasse- II-positiven Makrophagen und deren Varianten; B-Zellen) gemacht werden (AOUDJIT et al. 1995): Auch diese Zellen können nach Superantigenkontakt aktiviert oder getötet werden.
2.1.1 Klassifikation und Struktur
Superantigene sind Proteine viralen, vor allem aber bakteriellen Ursprungs. Zwei Kategorien von Superantigenen wurden bislang beschrieben (Übersicht bei SCHERER et al. 1993). Die löslichen Exotoxine grampositiver Bakterien (S. aureus, Sc. pyogenes) sind typisch für die Gruppe der bakteriellen Superantigene. Die Prototypen der viralen Superantigene sind Produkte endogener Retroviren der Maus (Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV). Zu den viralen Superantigenen gehören außer den Produkten des MMTV potentielle Superantigene von dem Cytomegalievirus (CMV) und dem Epstein- Barr Virus (EBV) (FRASER et al. 2000). Des weiteren sind zu der Gruppe der Superantigene das von Mycoplasma arthritidis produzierte Superantigen MAS (Mycoplasma arthritidis superantigen) zu rechnen, ebenso wie ein von Yersinia pseudotuberculosis produziertes Superantigen, das YPM (Yersinia pseudotuberculosis- derived mitogen) (CARNOY et al. 2000).
Zur Zeit sind 20 bakterielle Superantigene, die von Staphylokokken und Streptokokken produziert werden, bekannt. Superantigene von S. aureus sind dessen pyrogene Exotoxine (Staphylokokken-Enterotoxine (s.u.), Toxic-Shock-Syndrome- Toxin-1, TSST-1). Zu den Superantigenen, die von Sc. pyogenes produziert werden, zählen die pyrogenen (erythrogenen) Exotoxine SPEA, SPEB, SPEC, SPEG, SPEH und SPEJ (BOHACH et al. 1990, PROFT et al. 1999), das sog. Streptokokken-Superantigen (SSA) und die zwei zur Zeit bekannten mitogenen Exotoxine Z (SMEZ, SMEZ-2, streptococcal mitogenic exotoxin z) (ARCUS et al. 2000).
Die Staphylokokken-Enterotoxine (SE) umfassen eine Gruppe sehr hitzebeständiger, nicht glykosylierter, globulärer Proteine mit einer Größe von 228 bis 239 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 26,4 bis 28,4 kD. Sie bestehen alle aus einer einfachen Polypeptidkette, die eine einzelne Disulfid-Schleife enthält. Sie lassen sich
serologisch differenzieren. Bis vor kurzem waren neun verschiedene Hauptantigentypen von SEs bekannt (SEA, SEB, SEC1-3, SED, SEE, SEG, SEH, SEI und SEJ) (MONDAY
& BOHACH 1999b), inzwischen wurde ein weiteres Superantigen (SEK) identifiziert (ORWIN et al. 2001).
Unterschiede von nur drei Aminosäuren erlauben eine Unterteilung von SEC in die Subtypen SEC1, SEC2 und SEC3, des weiteren lassen sich SECbovine und SECovine
unterscheiden. Die beiden letzteren werden ebenso wie TSSTovine von S. aureus speziesabhängig exprimiert (MURRAY et al. 1994, SU & WONG 1995, MUNSON et al. 1998, ZHANG et al. 1998, MONDAY & BOHACH 1999b). Die Subtypen werden auf der Basis von geringen antigenen Differenzen und dem Wirtstier klassifiziert (MARR et al. 1993). Die Sequenzhomologien der Toxine untereinander sowie die Expressionscharakteristika legen eine Gruppierung der Staphylokokken-Superantigene in SEA, SED, SEE, SEH einerseits und SEB, SEC1-3, SEG andererseits nahe. Innerhalb der Gruppen besteht eine Homologie von 71-92%, zwischen den Gruppen eine von maximal 59%. Die Mitglieder der ersten Gruppe werden während der logarithmischen Wachstumsphase der Bakterien in relativ kleinen Mengen produziert, während die der zweiten Gruppe beim Übergang in die stationäre Phase in größeren Mengen produziert werden (MICUSAN & THIBODEAU 1993). Das TSST-1 ist ein ca. 22 kD Protein mit einer geringen Homologie zu den SEs, dem zudem die charakteristische Disulfid- Schleife und die emetischen Eigenschaften fehlen. Viele der diese Toxine kodierenden Gene befinden sich auf mobilen genetischen Elementen. Dies begründet möglicherweise ihre Präsenz in zwei verschiedenen grampositiven Bakterienspezies.
Manche Streptokokken-Superantigene sind den Staphylokokken-Enterotoxinen tatsächlich näher verwandt als diese untereinander (MICUSAN & THIBODEAU 1993).
In den letzten Jahren wurden immer wieder weitere dieser Superantigene entdeckt, und es ist wahrscheinlich, daß noch mehr Mitglieder dieser Gruppe in Zukunft entdeckt werden (MONDAY & BOHACH 1999b).
2.1.2 Bindungsmechanismen an Immunzellen
Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle
Die Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle ist unabdingbar für Superantigen-induzierte zelluläre Reaktionen. Untersuchungen mit Staphylokokken-Superantigenen konnten die direkte Bindung an Regionen des Klasse-II-Moleküls außerhalb der Antigenbindungs- stelle demonstrieren (DELLABONA et al. 1990). Im Gegensatz zu konventionellen Antigenen müssen Superantigene nicht erst prozessiert werden, um über MHC-Klasse- II-Moleküle den T-Zellen präsentiert werden zu können (FLEISCHER &
SCHREZENMEIER 1988). Die Bindung der Superantigene an Regionen außerhalb der Antigenbindungsstelle ermöglicht zudem ein breites Spektrum an Bindungsspezifität für verschiedene allele Formen von MHC-Klasse-II-Molekülen, da sich die variablen Sequenzen der MHC-Klasse-II-Allele vorwiegend im Bereich der Antigenbindungs- grube finden.
In Abhängigkeit von der Art des Toxins werden unterschiedliche Bindungsstellen besetzt. Während z.B. SEA und SEE zwei unterschiedliche Bindungsstellen auf dem Klasse-II-Molekül aufweisen, existiert für SEB und TSST-1 nur je eine Stelle, die im ersten Fall auf eine Domäne der α-Kette beschränkt ist, sich im zweiten Fall jedoch über beide Ketten des MHC-Klasse-II-Moleküls erstreckt. Verschiedene Superantigene unterscheiden sich zudem in ihrer Affinität, an MHC-Klasse-II-Moleküle zu binden (CHINTAGUMPALA et al. 1991, LABREQUE et al. 1993).
Bindung an den T-Zellrezeptor
Strukturell liegen der Antigenspezifität eines αβT-Zellrezeptors drei hypervariable Regionen innerhalb der variablen Elemente von α- und β-Kette zugrunde.
Superantigene binden außerhalb der Antigenbindungsstelle an polymorphe Sequenzen der β-Kette (Vβ-Regionen). Damit überwinden Superantigene die Antigenspezifität der verschiedenen T-Zellrezeptoren, indem sie an eine exponierte und nicht direkt an der Antigenerkennung beteiligte Stelle im variablen Bereich der β-Kette des Rezeptors binden.
2.1.3 Konsequenzen der Superantigenbindung an MHC-Klasse-II- Moleküle und den T-Zellrezeptor
Im physiologischen Fall werden durch konventionelle Antigene zwischen 0,001% und 0,01% der T-Zellen aktiviert. Superantigene hingegen stimulieren bis zu 25% aller T-Zellen (HERMAN et al. 1991). Die Frequenz Superantigen-reaktiver T-Zellen hängt von der Vβ-Spezifität des jeweiligen Superantigens und von dessen Konzentration ab (FLEISCHER et al. 1991, MOLLICK et al. 1991, IRWIN & GASCOIGNE 1993, SCHUBERTH 1997). Die in vivo Wirkungen von Superantigenen wurden im wesentlichen - anhand von Injektionen unterschiedlicher Dosen von Superantigenen - in Mäusen untersucht. Dabei stellte die Modulation bestimmter Zelloberflächenantigene, wie L-Selektin, IL-2- und Transferrin-Rezeptoren, die zuerst erkennbare Veränderung der reaktiven T-Zellfraktion dar (MIETHKE et al. 1993).
Die Aktivierung führt in vivo und in vitro zunächst zu einer Expansion reaktiver T-Zellen. Aktivierte T-Zellen können anergisch werden (Reaktionslosigkeit nach erneutem Antigenkontakt) oder eliminiert werden (Induktion von Apoptose) (HERMAN et al. 1991, HUANG & CRISPE 1993). Eine polyklonale Aktivierung vieler Vβ-reaktiver T-Zellen durch Superantigene führt unter Umständen zur Expansion autoreaktiver T-Zellklone. Ein begrenztes Vβ-Spektrum autoreaktiver T-Zellen bzw.
eine selektive Expansion bestimmter T-Zellen wurde in der Tat bei einigen Autoaggressionserkrankungen (z.B. der Rheumatoiden Arthritis und dem Typ I Diabetes mellitus) beobachtet (CONARD et al. 1994, GORONZY et al. 1994). Dies läßt die Beteiligung von Superantigenen in der Pathogenese solcher Erkrankungen zumindest nicht unwahrscheinlich erscheinen.
In Folge der T-Zellaktivierung kommt es zur Produktion und Freisetzung einer Reihe von Zytokinen, die wiederum kaskadenartig zur Aktiverung und Ausdifferenzierung funktionell unterschiedlicher Zellsubpopulationen beitragen. So können bspw.
zytotoxische T-Zellen ausdifferenzieren, die in der Lage sind, MHC-Klasse-II-positive Zielzellen in Anwesenheit von Superantigenen zu töten. Diese sehr potente Superantigen-abhängige zelluläre Zytotoxizität (SDCC) wird von einem großen Teil CD4+ und CD8+ T-Zellen ausgeübt. Die bereits von ruhenden T-Zellen ausgeführte Zytotoxizität, läßt sich durch Vorinkubation mit Superantigenen noch potenzieren und erstreckt sich u.a. auch auf autologe B-Zellen, Monozyten und aktivierte MHC-Klasse- II-positive T-Lymphozyten (HEDLUND et al. 1990).
Bei B-Lymphozyten kann die durch Superantigen-vermittelte Interaktion mit T-Zellen zu Proliferation und Differenzierung in Immunglobulin-sezernierende Zellen, aber auch zum Tod führen (MOURAD et al. 1989). HENDRICKS (1998) fand diese dichotome Reaktionsweise ebenfalls bei bovinen B-Zellen; entscheidend für das Schicksal der B-Zellen war dabei die eingesetzte Konzentration der Superantigene, wobei interessanterweise keine lineare Dosisabhängigkeit bestand.
Die Zytokin-induzierende Potenz verschiedener Superantigene, sowie das Spektrum induzierter Zytokine in vivo und in vitro, wurde von verschiedener Seite für Mensch und Maus gezeigt. Allerdings sind die Berichte schwer vergleichbar und kaum zu generalisieren. Zum Teil wurden die Daten nach systemischer Verabreichung von Superantigenen in vivo gewonnen (BETTE et al. 1993, LITTON et al. 1994) oder die Daten beziehen sich selektiv auf einzelne Antigen-präsentierende Zellen (PALKAMA
& HURME 1993, CHAPES et al. 1994) oder T-Zellen (KRISTENSON et al. 1992, DAMLE et al. 1993, LAGOO et al. 1994).
Bei menschlichen Monozyten können Superantigene z.B. die Funktion von LFA-1 (MOURAD et al. 1990) sowie die Produktion verschiedener Monokine, z.B. IL-1β und TNF-α (TREDE et al. 1991) heraufregulieren. Für das Rind gibt es Berichte über die Induktion von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ und TNF-α in Superantigen-stimulierten monoukleären Zellen des Blutes (YOKOMIZO et al. 1995, SCHUBERTH 1997). In anderen Untersuchungen konnte als Folge der Bindung von Superantigenen an MHC- Klasse-II-Moleküle die Synthese von Stickstoffmonoxid (FAST et al. 1991, CUNHA et al. 1993, HAUSCHILDT et al. 1993, HENDRICKS 1998) ebenso wie die Induktion Cyclooxigenase-abhängiger Arachidonsäure-Metaboliten wie PGE2 (MEHINDATE et al. 1995, HENDRICKS 1998) demonstriert werden.
Im Unterschied zu den immunologischen Konsequenzen von systemisch wirkenden Superantigenen, wurden die Effekte nach lokalem Kontakt mit Superantigenen bisher erst wenig untersucht. HERZ et al. (1999) studierten die Wirkung von inhaliertem SEB auf die Atemwegsschleimhaut von Mäusen. Niedrig dosiertes SEB provozierte einen Influx von Lymphozyten, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, sowie meßbare Konzentrationen von IL-4, aber nicht IFN-γ, in der bronchialen Lavageflüssigkeit.
Diese Ergebnisse lassen u.a. vermuten, daß nach lokalem Kontakt der Mukosa mit Superantigenen, eine entzündliche Immunantwort ausgelöst wird, die dem nicht- allergischen Asthma gleicht (HERZ et al. 1999).
2.1.4 Superantigene bei Staphylokokken-Infektionen der Haustiere
S. aureus ist ein wichtiger pathogener Erreger für Rinder. Er ist Ursache für variable Formen der klinischen und subklinischen Mastitis. Bereits frühere Studien deuten auf eine mögliche Rolle von Superantigenen in der Pathogenese der bovinen Mastitis durch S. aureus Infektionen hin. NISKANEN et al. (1978) provozierten durch Injektion von SEA in das Euter gesunder Tiere entzündliche Reaktionen, die denen einer klinischen Mastitis sehr ähnlich waren. Die Bedeutung von TSST-1 und SEC für die Pathogenese der perakut verlaufenden Mastitis diskutierten MATSUNAGA et al. (1993). Die spezifische Art der Interaktion von Superantigenen mit den Zellen des Immunsystems (s. 2.1.2) findet zumindest beim Rind genauso statt wie bei Mensch und Maus (SCHMALTZ et al. 1995, YOKOMIZO et al. 1995, SCHUBERTH et al. 1996, 1998, FERENS et al. 1998, HENDRICKS et al. 2000). Das Rind stellt bisher die einzige Haustierspezies dar, in der grundlegende Superantigen-vermittelte Mechanismen detaillierter untersucht wurden.
FERENS et al. (1998) fanden heraus, daß die Aktivierung boviner Zellen des Blutes mit Staphylococcus Enterotoxin C (SEC) zur Expression eines neu identifizierten Aktivierungsmoleküls (ACT3) auf CD8+ T-Zellen führt. Außerdem konnten sie beobachten, daß vermehrt IL-4 und IL-10 produziert wurde, was wiederum zu einer zeitweiligen Hemmung (Tag 0-4) der proliferativen Antwort der T-Zellen führte, zu sehen anhand der sinkenden Zahl CD4-positiver T-Zellen und der nur leicht ansteigenden Zahl CD8-positiver T-Zellen. Zwischen Tag 4 und 7 kommt es zu einer starken und präferentiellen Proliferation der CD8-positiven T-Zellen. Im bovinen System können Superantigene wahrscheinlich durch Induktion von sog. TH2-Zytokinen (IL-4, IL-10) eine schützende Immunantwort verhindern. Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, daß Superantigene an Immunsuppression und immunmodula- torischen Mechanismen beteiligt sind.
Weitere Studien befassten sich intensiv mit der Frage nach Superantigen-induzierten, immunmodulatorischen Mediatoren auf Seite der Superantigen-präsentierenden Zellen.
SCHUBERTH et al. (1998) und HENDRICKS et al. (2000) zeigten, daß Superantigene die Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2) und Stickstoffmonoxid (NO) in bovinen mononukleären Zellen induzieren. Obgleich NO zytotoxische Eigenschaften aufweist und in anderen Systemen als immunmodulatorisch beschrieben wurde - u.a. die Regulation bestimmter T-Zellfunktionen betreffend - (NATHANS 1992, MARCINKIEWICZ & CHAIN 1993, BARNES & LIEW 1995), wurde festgestellt, daß
Superantigen-induziertes NO das Proliferationsverhalten und vor allem die Zusammensetzung der zellulären Subpopulationen (CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, B-Lymphozyten) unter den bovinen Blasten nicht beeinflußte. Dies steht in großem Gegensatz zum Proliferations-hemmenden Effekt von NO im Nagersystem nach allogener, mitogener und superantigener Stimulation (FAST et al. 1991, CUNHA et al.
1993, HAUSCHILD et al. 1993, UPHAM et al. 1995). Daher scheint die Vermutung nahe zu liegen, daß die NO-Produktion im bovinen System nur ein Phänomen der zellulären Situation darstellt und keine Konsequenzen für die Proliferationsreaktion in vitro oder für die Zelldifferenzierung hat (HENDRICKS 1998).
Prostaglandin E2 (PGE2) ist ein wesentliches Produkt des Arachidonsäure- metabolismus und wird hauptsächlich von aktivierten Monozyten und Makrophagen gebildet. Es ist prinzipiell bekannt, daß die Signaltransduktion über MHC-Klasse-II- Moleküle nach Kreuzvernetzung durch Superantigene zur Induktion Cyclooxigenase- abhängiger Arachidonsäure-Metaboliten wie PGE2 führt (MEHINDATE et al. 1995).
Beim Rind ergab sich eine starke individuelle Heterogenität der durch Superantigene induzierbaren PGE2-Synthese (HENDRICKS 1998). Dies könnte zur individuellen Reaktivität auf Superantigene beitragen, da gezeigt wurde, daß PGE2 die Proliferationsreaktion boviner mononukleärer Zellen in höheren Konzentrationen hemmen kann. Allerdings bezog sich diese Hemmung im wesentlichen auf beide Haupt- T-Zellpopulationen (CD4+, CD8+). HENDRICKS (1998) schloß daraus, daß PGE2 nicht der verantwortliche Mediator für die beim Rind so hervorstechende präferentielle Proliferation von CD8+ T-Zellen nach Superantigenstimulation ist.
Weitere Informationen über die regulative Bedeutung des induzierten PGE2 nach Superantigenstimulation existieren kaum (MEHINDATE et al. 1995) oder nur sehr indirekt (FERNANDEZ et al. 1996). Ob und in welcher Weise die jeweiligen Super- antigene die PGE2-Produktion steuern ist unklar. Denkbar wäre, daß durch die bakteriel- len Superantigene in Abhängigkeit von ihrer Avidität zu den exprimierten allelen MHC- Klasse-II-Produkten jeweils bestimmte Arachidonsäureprodukte oder unterschiedliche Verhältnisse dieser Metaboliten induziert werden. Unterschiedliche Verhältnisse einzel- ner Eicosanoide können insofern von Bedeutung sein, als sie zum Teil gegenläufige immunmodulatorische Wirkungen aufweisen. Dies wurde für LTB4 und PGE2
(ANTONELLI et al. 1990, SNIJDEWINT et al. 1993) oder Thromboxan A2 und PGE2
(GOETZL et al. 1995) beschrieben.
PGE2 besitzt überdies ein eindrucksvolles immunregulatorisches Potential. Es fördert bspw. die Proliferation von Colon-Karzinomzellen (QIAO et al. 1995, HANIF et al.
1996), während die Proliferation von T-Zellen normalerweise gehemmt wird (YU et al.
1993, PICA et al. 1996). In Abhängigkeit vom Thymozyten-Differenzierungsstadium führte dieser Arachidonsäuremetabolit zur Ausdifferenzierung oder zur Apoptose (JUZAN et al. 1992, SAIAGH et al. 1994).
Inwieweit die beschriebenen Mediatoren NO und PGE2 die Apoptose von neutro- philen Granulozyten fördern oder hemmen, wird in der Literatur interessanterweise kontrovers beurteilt (ROSSI et al. 1995, BANNO et al. 1997, KOLLER et al. 1997, WALKER et al. 1997, FORTENBERRY et al. 1998) (s. Tab. 1, s. 2.4.3).
Die Produktion von Superantigenen oder die Anwesenheit von Genen, die für Superantigene kodieren, ist fast immer auf einen Teil aller möglichen Enterotoxine beschränkt (HIROOKA et al. 1988, KANG et al. 1991, MATSUNAGA et al. 1993, BECKER et al. 1998). Dies mag das Fehlen von klaren epidemiologischen Daten be- züglich der Rolle von Superantigenen in der Pathogenese von bestimmten Krankheiten, z.B. der Mastitis der Rinder erklären. Die Frequenz Superantigen-bildender S. aureus Stämme beim Rind reicht je nach Untersuchung und Nachweisverfahren von 0-76%.
Abhängig von der jeweiligen Studie wurden, z. B. in Isolaten von an Mastitis erkrank- ten Rindern, entweder keine Superantigen-produzierenden Stämme gefunden (LEE et al. 1998) oder die Frequenz erreicht 50% (ADESIYUN et al. 1998) oder sogar 76%
(KANG et al. 1991). STEPHAN et al. (1999) stellten bei insgesamt 63 S. aureus Isolaten aus Milchproben von Kühen mit Mastitis in 34 Fällen (54%) eine Produktion von Superantigenen fest. Davon produzierten sieben Stämme jeweils 2 verschiedene Enterotoxine, die meisten jedoch SEC (21 Isolate).
Beim Hund produzierten 25-50% der S. intermedius- und der S. aureus Isolate aus infektiösen Erkrankungen Enterotoxine (FUKUDA et al. 1984, ALMAZAN et al. 1987, HIROOKA et al. 1988). Auf die mögliche Beteiligung von Superantigenen bei der caninen juvenilen Polyarthritis und der steril eitrigen Meningitis-Arteriitis weisen TIPOLD et al. (1996 a, b) hin. S. intermedius spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der Pyodermie der Hunde (BURKETT & FRANK 1998).
2.2 Weitere zytotoxische Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus
S. aureus ist in der Lage, eine hohe Zahl an Virulenzfaktoren zu produzieren, deren Anteil an der Pathogenese einer Infektion nicht immer geklärt ist, da sie meist zusammenwirken. Ausnahmen stellen Syndrome oder Erkrankungen dar, die durch ein (Haupt-) Toxin verursacht werden: Lebensmittelvergiftungen durch Enterotoxine; das Toxic Shock Syndrome durch TSST-1; das Scalded Skin Syndrome des Menschen und das nässende Ekzem der Ferkel durch exfoliative Toxine von S. aureus bzw. S. hyicus (FREER 1988).
Die Virulenzfaktoren von Staphylokokken kann man in extrazelluläre und zelluläre Faktoren einteilen. Während zu den zellulären Faktoren u.a. Schleim, der Clumping factor und das Protein A gehören, werden zu den wichtigen extrazellulären Virulenzfaktoren außer den Enterotoxinen u.a. die exfoliativen Toxine, die Hämolysine und die Leukotoxine gezählt (CIBOROWSKI & JELJASZEWICZ 1985). Alpha- Hämolysine werden auf der Oberfläche von Zielzellen von einem wasserlöslichen Monomer zu einem membrangebundenen Heptamer und bilden wassergefüllte Kanäle, die zu Zelltod und Lyse führen (GOUAUX et al. 1997). Die von S. aureus produzierten gamma-Hämolysine sind Zwei-Komponenten-Toxine. Die Komponenten fügen sich nacheinander in die Membranen empfindlicher Zellen ein und bilden dort Poren, wodurch sie die Erythrozyten und die Phagozyten schädigen (FERRERAS et al. 1998, SZMIGIELSKI et al. 1999). Abhängig von der Kombination der Komponenten verursachen diese Toxine z.T. ernste Entzündungsreaktionen durch die massive Ausschüttung von Entzündungsmediatoren (KONIG et al. 1997, SIQUEIRA et al.
1997).
Exfoliative Toxine von S. aureus sind als Virulenzfaktoren entscheidend an der Pathogenese des Staphylococcal Scaled Skin Syndrome (SSSS) des Menschen beteiligt.
Diese generalisierte exfoliative Hauterkrankung betrifft hauptsächlich Kinder. Etwa 6%
der S. aureus Stämme aus klinischem Untersuchungsmaterial unterschiedlicher Herkunft sind Exfoliatin-Bildner. Von diesen Stämmen bilden 88% Exfoliatin A. Der Anteil an exfoliatives-Toxin-bildenden S. aureus Isolaten aus exfoliativen Haut- veränderungen liegt bei 70%. Exfoliatin A allein wird von 46%, Exfoliatin B allein von 16% und Exfoliatin A und B zusammen werden von 38% der Toxinbildner produziert (DE AZAVEDO & ARBUTHNOTT 1981). Der Hund hat sich experimentell als unempfindlich gegenüber dem exfoliativen Toxin von S. aureus (ELIAS et al. 1976)
bzw. S. hyicus (SATO et al. 1991) erwiesen, aber gerade der Vergleich der Exfoliatine dieser beiden Staphylokokken-Spezies hat gezeigt, daß funktionell ähnliche Proteine unterschiedliche Wirtsspezifitäten haben können.
Viele Staphylokokken-Isolate aus nekrotischen Hautläsionen und Furunkeln produzieren Leukotoxine (SZMIGIELSKI et al. 1999). Neben den Superantigenen scheinen die Leukotoxine eine entscheidende Rolle bei dem Beginn und dem Verlauf einer durch S. aureus hervorgerufenen Erkrankung zu spielen. Die in der Literatur berichteten Frequenzen von Leukotoxin-produzierenden S. aureus Isolaten schwanken in weiten Bereichen. LOEFFLER et al. (1988) fanden, daß nur 2 von 27 S. aureus- infizierten Milchproben von Kühen mit chronischer Mastitis Leukotoxine produzierten.
Hingegen stellten SIQUIERA et al. (1997) fest, daß die meisten S. aureus Stämme zwei oder sogar sechs verschiedene Leukotoxine produzierten. Trotz der andauernden Diskussion über die Bedeutung von Superantigenen oder Leukotoxinen für die Pathogenese der bovinen S. aureus-verursachten Mastitis existieren bislang keine Studien über die simultane Expression dieser beiden Virulenzfaktorengruppen bei S. aureus Isolaten.
2.3 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
2.3.1 Morphologische und phänotypische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten
Die Granulozyten erhielten ihre Bezeichnung auf Grund der deutlichen Granula im Zytoplasma; wegen ihres unregelmäßig geformten Zellkerns nennt man sie auch polymorphkernige Granulozyten (PMN). Neben dem mehrfach gelappten Kern zählen die lichtmikroskopisch neutralen (azurophilen, primären) Granula zu den charakteristischen morphologischen Merkmalen ausgereifter neutrophiler Granulozyten.
Ihre primären Granula sind reich an mikrobiziden Enzymen wie Hydrolasen, Lysozym, Myeloperoxidasen, Proteinasen, sauren Hydrolasen, Histaminase und kationischen Proteinen. Sekundäre Granula enthalten zudem noch Lactoferrin und Kollagenasen (GEMSA et al. 1991, KLEIN 1991).
Neutrophile Granulozyten repräsentieren den Hauptanteil der zirkulierenden Granu- lozyten (GEMSA et al. 1991). Mit einem Durchmesser von ca. 10-14 µm bilden sie bei Pferd, Hund und Katze mit 55-70% den größten Anteil der Leukozyten, während bei anderen Tierarten Lymphozyten vorherrschen. Im bovinen Differentialblutbild stellen die neutrophilen Granulozyten mit 25-45%, neben den Lymphozyten mit 45-65%, die zweitstärkste Leukozytenfraktion dar. Der Anteil eosinophiler Granulozyten an den Blutleukozyten liegt bei gesunden Rindern bei 1-10%, die Anteile basophiler Granulo- zyten bei 0-2% und die der stabkernigen neutrophilen Granulozyten bei 0-3%
(HOFMANN 1992).
Bovine neutrophile Granulozyten zeigen einige Besonderheiten. Bemerkenswert ist das Vorhandensein einer dritten Art von Granula im Zytoplasma. Diese Granula sind größer als die anderen Granula und enthalten kationische antibakterielle Proteine, wie z.B. Bactenecin (ROMEO et al. 1988), Indolicin und β-Defensin (SELSTED et al.
1992, 1993). Die kationischen bakteriziden Proteine in den Granula unterscheiden sich von denen, die für andere Spezies beschrieben werden. Sie sind bakterizid nur für bestimmte Bakterien. Für die von SELSTED et al. (1992, 1993) beschriebenen kationischen bakteriziden Proteine wird eine antimikrobielle Wirkung gegenüber S. aureus und E. coli genannt. In den azurophilen und den spezifischen Granula sind viele der Enzyme enthalten, die auch bei humanen Neutrophilen oder denen anderer Spezies gefunden werden. Bemerkenswerterweise fehlt den bovinen Granulozyten das Lysozym, welches eine Hauptkomponente der humanen azurophilen Granula ist (PASTORET et al. 1998).
Im Knochenmark entwickeln sich aus Stammzellen unter der koordinierten Wirkung hämatopoetischer Wachstumsfaktoren (wie Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierender Faktor, GM-CSF, Interleukin-3, IL-3 und Granulozyten-Kolonie- stimulierender Faktor, G-CSF) über mehrere Entwicklungsstufen (Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten) die jugendliche Zellform der stabkernigen neutrophilen Granulozyten. Ihr länglicher Kern ist noch nicht segmentiert.
Erst mit zunehmender Alterung der Zelle zerfällt er in mehrere, über Chromatinstege verbundene, Segmente (LIEBICH 1993).
Nach der Freisetzung aus dem Knochenmark zirkulieren die PMN im Blutstrom, wobei sie besonders im Kapillargebiet engen Kontakt zum Endothel haben. Dieser Kontakt zu Endothelzellen wird über Adhäsionsmoleküle vermittelt.
2.3.2 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr
Granulozyten gehören mit zu den Immunzellen, die als erste am Ort eines Infektionsgeschehens erscheinen. Entzündungsmediatoren (u.a. Interleukin-8, Leuko- trien B4, C5a) wirken zum einen chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten und induzieren zum anderen auf Endothelzellen die Expression von Adhäsionsmolekülen.
Innerhalb weniger Minuten wird das adhäsive P-Selektin exprimiert, ein zweites Selektin, das E-Selektin, erscheint erst einige Stunden nach Aktivierung. Diese Selektine erkennen Kohlenhydratepitope verschiedener Glykoproteine auf Leukozyten.
Das auf der Seite der Leukozyten exprimierte L-Selektin unterstützt das „Rollen“ der Zellen entlang der Gefäßwand. Diese Wechselwirkungen führen zu einer reversiblen Anheftung der Neutrophilen an die Gefäßwand. Im Wirkungsgebiet von Entzündungs- mediatoren wird somit die Geschwindigkeit der PMN im Blutstrom bei der Annäherung an aktiviertes Endothel abgebremst (Margination). Diese Form der Adhäsion ermöglicht die folgenden, stärkeren Interaktionen, welche letztlich zur Extravasation der Granulozyten führen. Der Prozeß der Extravasation setzt eine hochkoordinierte und dynamische Interaktion zwischen verschiedenen Adhäsionsmolekülen von PMN und den Zellen des Gefäßendothels voraus (SMITH & ANDERSON 1991). Dieser Schritt ist abhängig von Wechselwirkungen zwischen den Leukozyten-Integrinen LFA-1 (Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1, CD11a/ CD18) und CR3 (Complement- rezeptor-3, CD11b/CD18, auch MAC-1 genannt) und interzellulären Zelladhäsions- molekülen (intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1) auf Endothelzellen. Die Verbindung von LFA-1 und CR3 mit ihren Liganden ist physiologischerweise nur schwach. Das von Endothelzellen und Immunzellen im Entzündungsbereich sezernierte IL-8 bewirkt jedoch auf Leukozyten eine Konformationsänderung des LFA-1 und des CR3, was die Affinität dieser Moleküle für ihre Liganden deutlich erhöht. Als Folge davon werden die Zellen an dieser Stelle des Endothels immobilisiert. Weitere adhäsive Wechselwirkungen werden über das immunglobulinähnliche Molekül CD31 (auch PECAM: platelet endothelial cell adhesion molecule) vermittelt, das sowohl auf Leukozyten als auch an den Verbindungsstellen zwischen den Endothelzellen exprimiert wird (JANEWAY & TRAVERS 1997). Die folgende Transmigration findet bevorzugt zwischen den Kontaktstellen von drei Endothelzellen („tricellular corners“) statt. Tight junctions (zona occludens) scheinen hierbei eine geringere Rolle zu spielen (BURNS et al. 1997). Die PMN durchstoßen die Basalmembran mit Hilfe proteolytischer Enzyme, transmigrieren und gelangen entlang eines Konzentrations- gradienten von Entzündungsmediatoren in das betroffene Gewebe.
Granulozyten phagozytieren Erreger und Zelldetritus abgestorbener Gewebezellen.
Inaktiviert werden Pathogene mit Hilfe reaktiver Sauerstoffmetabolite und bakterizider lysosomaler Enzyme / Polypeptide nach Verschmelzung der Phagosomen mit den Lysosomen zu Phagolysosomen (DJEU & BLANCHARD 1987, JACKSON et al. 1995, CASSATELLA 1996, BELAAOUAJ et al. 1998). Ein namhafter Teil der von Granulozyten gebildeten Metaboliten / Enzyme gelangt durch Exozytose auch in das umliegende Gewebe, wodurch es zur Schädigung der dort gelegenen Zellen kommt.
Abgestorbene Granulozyten werden aus dem Gewebe durch die Phagozytose von residenten Makrophagen entfernt (COX et al. 1995).
Während einer Infektion steigt die tägliche Produktion der Granulozyten im Knochenmark etwa um das zehnfache. Für Granulozyten ist beim Mensch (ZINK 1990) und bei der Ratte (ROITT et al. 1991) nur eine Lebensdauer von 2-3 Tagen beschrieben.
Durch die Wirkung lokal produzierter Zytokine im Entzündungsgebiet verlängert sich die Lebenszeit dieser relativ kurzlebigen Zellen (BLISS et al. 1999). WATSON et al.
(1997) fanden eine verzögerte spontane Apoptose bei Neutrophilen, die durch eine Transmigration in ein Entzündungsgebiet aktiviert wurden.
PMN erweisen sich nicht nur als reine „Entsorger“ von Fremdorganismen. Nach LLOYD & OPPENHEIM (1992) werden PMN durch verschiedene Mediatoren (Lipo- polysaccharide (LPS), IL-1, IL-2, Tumornekrosefaktor (TNF) oder GM-CSF) zur Produktion und Freisetzung von Zytokinen stimuliert. In der Vergangenheit wurde gezeigt, daß Granulozyten eine Vielzahl an Zytokinen und Chemokinen nach Stimu- lation mit mikrobiellen Produkten, wie z.B. dem bakteriellen LPS, produzieren können (CASSATELLA 1995, DUBRAVEC et al. 1990, HAZIOT et al. 1993). Über diese Fähigkeit, aktivierungsabhängig Zytokine und Chemokine zu sezernieren, beeinflussen PMN unmittelbar auch Mechanismen der adaptiven Immunantwort (CASSATELLA 1999).
Interaktion von Superantigenen mit neutrophilen Granulozyten
Berichte über direkte Interaktionen von Superantigenen mit Neutrophilen sind selten.
BERGER et al. (1988) fanden, daß zwar Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1), aber nicht SEA und SEB zu einer Abnahme der bakteriziden Aktivität von humanen Neutrophilen in vitro führen. TSST-1 konnte ebenfalls heat shock proteins (hsp70, hsp72) in isolierten humanen Granulozyten induzieren (HENSLER et al. 1991) und die
FMLP-induzierte LTB4-Bildung von humanen Granulozyten steigern (HENSLER et al.
1993). Zumindest TSST-1 kann die Signaltransduktionswege humaner Granulozyten deutlich beeinflussen. Vor kurzem wurde berichtet, daß SEA, SEB und TSST-1 keinen direkten Effekt auf die Apoptose von humanen Neutrophilen haben (MOULDING et al.
1999).
Beweise für Effekte von Superantigenen auf die Eigenschaften neutrophiler Granulozyten sind meist indirekt. Für TSST-1 wurde ein migrationshemmender Effekt gezeigt, der durch stimulierte mononukleäre Zellen vermittelt wurde (FAST et al.
1988). Auf der anderen Seite wirkte intravenös verabreichtes SEA migrationsfördernd (MILLER et al. 1996). Andere berichten von einer gestiegenen Sensitivität von Granulozyten gegenüber TNF-α-vermittelten Signalen nach systemischen T-Zell- abhängigen Antworten auf SEB oder phasische Veränderungen in der Expression von CD11a und CD11b auf Neutrophilen nach Induktion von letaler Sepsis mit Enterotoxin- produzierenden Staphylokokken (NEUMANN et al. 1997).
Es ist bekannt, daß Neutrophile und Eosinophile MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren können, besonders nach Aktivierung durch IFN-γ, GM-CSF, IL-3 und IL-5 (GOSSELIN et al. 1993, WELLER et al. 1993, GUIDA et al. 1994). Obwohl die Expressionsdichte der MHC-Klasse-II-Moleküle niedrig war, konnte gezeigt werden, daß die Granulozyten in der Lage waren, den T-Zellen Superantigene zu präsentieren, und daß dies zu einer Aktivierung und Proliferation der T-Zellen führt (GASCOIGNE 1993). Die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen auf Granulozyten kann also einen Mechanismus darstellen, durch den Granulozyten und T-Zellen in engen Kontakt treten. Eine Konsequenz dieser Interaktion könnte das beschleunigte Absterben der Granulozyten sein, ein Phänomen, das als SDCC (superantigen-dependent cellular cytotoxicity) bekannt ist und für die Elimination von autologen B-Zellen, Monozyten und aktivierten, MHC-Klasse-II-positiven T-Zellen beschrieben wird (HEDLUND et al.
1990).
2.4 Apoptose
Der Begriff Apoptose kommt aus dem Griechischen und beschreibt eine Blume, die ihre Blütenblätter verliert oder einen Baum, der seine Blätter abwirft. Dies gleicht dem Abschnüren von Membranvesikeln, was bei einer besonderen Form des Zelltodes auftritt; deshalb wurde der Begriff Apoptose für diese Art des Todes übernommen.
Apoptose oder auch programmierter Zelltod ist ein Vorgang, der physiologischerweise im Körper vorkommt.
JACOBSON et al. (1997) teilen die Aufgaben der Apoptose in fünf Gruppen ein:
Erstens das Formen von Gewebsstrukturen, zweitens das Zerstören von nicht benötigten Gewebsstrukturen, drittens die Kontrolle der Zellzahl, viertens die Elimination von nicht normalen, nicht funktionierenden oder potentiell schädlichen Zellen bzw. von Zellen, die am falschen Ort sind und fünftens die Produktion von differenzierten Zellen ohne Organellen (z.B. Kerationzyten, Linsenepithel). Als Beispiel für die vierte Funktion kann die Kontrolle sich entwickelnder T- und B-Lymphozyten dienen, von denen die potentiell gefährlichen (autoreaktiven) eliminiert werden müssen (JACOBSON et al. 1997).
Die Apoptose ist ein fein regulierter, komplizierter Mechanismus, was auf die große Bedeutung dieses Prozesses für den Organismus schließen läßt. Im Rahmen der Apoptose wird - im Gegensatz zur Nekrose - kein Inhalt der sterbenden Zelle freigesetzt, was z.B. bei der Elimination von im Gewebe befindlichen Neutrophilen sehr wichtig ist, damit es durch die Vielzahl der in ihnen enthaltenden Enzyme nicht zu einer unnötigen Schädigung des umliegenden Gewebes kommt (COHEN 1993) (s. 2.3.2).
Der Zelltod ist ein wichtiger Bestandteil in der Entwicklung von Lebewesen. Er tritt in vielen sich entwickelnden Geweben von Invertebraten und Vertebraten auf (Übersicht bei: GLUCKSMANN 1951, CLARKE & CLARKE 1996). Der Begriff
„programmierter Zelltod“ wurde zunächst benutzt, um einen Zelltod zu beschreiben, der an vorhersagbaren Orten und zu vorhersagbaren Zeiten während der Entwicklung auftrat, um zu verdeutlichen, daß der Tod zum programmierten Entwicklungsplan von Organismen gehört (LOCKSHIN & WILLIAMS 1964). Es war ebenfalls bekannt, daß ein Teil dieser Zelltode durch von anderen Geweben produzierte Substanzen verhindert werden kann. Daraus kann man schließen, daß der Tod nicht unabdingbar ist und durch Signale von anderen Zellen unterdrückt werden kann (Übersicht bei: SAUNDERS 1966).
Wenn Zellen während der normalen Entwicklung, der Gewebehomöostase oder in der Peripherie von akuten Läsionen sterben, verkleinern sie sich, kondensieren, und die Organellen und die Plasmamembranen behalten ihre Integrität. Diesen Prozeß betitelten KERR et al. (1972) als Apoptose. Die toten Zellen oder ihre Fragmente werden schnell von residenten Makrophagen phagozytiert, bevor Zellinhalte austreten können. Damit werden Entzündungsreaktionen vermieden. Auf Grund der Tatsache, daß die Morpho- logie apoptotischer Zellen in allen Geweben und bei allen Tieren sehr ähnlich ist, behaupteten KERR et al. (1972), daß dieser Tod das Spiegelbild eines aktiven, intra- zellulären Todesprogramms sei, das durch eine Vielzahl physiologischer oder pathologischer Stimuli induziert oder verhindert werden kann. Heutzutage ist mit dem Begriff Apoptose jeder Zelltod gemeint, der durch ein intrazelluläres „Todesprogramm“
vermittelt wird, unabhängig davon, wodurch der Tod induziert wird und ob alle charak- teristischen Anzeichen der Apoptose gezeigt werden (JACOBSON et al. 1997). Eine Zelle, die dem programmierten Zelltod anheim fällt, wird so schnell entfernt (häufig in einer Stunde oder weniger), daß sogar bei hohen Sterberaten nur wenige tote Zellen zu sehen sind (JACOBSON et al. 1997). Der programmierte Zelltod kann in allen kernhaltigen Zellen ablaufen, beginnend mit der Zygote (WEIL et al. 1996).
Durch genetische Studien, besonders in dem Nematoden Caenorhabditis elegans, kam es zur Identifizierung von Genen, die dem Todesprogramm und seiner Kontrolle gewidmet sind (HORWITZ et al. 1982, ELLIS & HORWITZ 1986), später auch zu der Erkenntnis, daß einige dieser Gene homolog zu denen von Säugetieren sind (YUAN et al. 1993, HENGARTNER & HORWITZ 1994). Das zuerst identifizierte, sog. ced-3 Gen, kodiert für eine Cystein-Protease, die homolog zu dem Interleukin-1β-converting enzyme (ICE) ist (YUAN et al. 1993). Das ICE ist eine Cystein-Protease bei Säugetieren, die aus Vorstufen das proinflammatorische Zytokin IL-1β produziert wird.
Inzwischen sind mehrere dieser Proteasen identifiziert, und sie werden auf Grund ihrer Spaltungsstelle heute einheitlich als Caspasen bezeichnet (s. 2.4.4). Da spezifische Proteine oder Caspase-Inhibitoren die Apoptose verhindern können, scheint klar zu sein, daß Caspasen der zentrale Teil des Todesprogramms sind, obwohl einige von ihnen, so wie der Prototyp dieser Familie, IL-1β-converting enzyme (ICE), auch noch andere Funktionen wahrnehmen (JACOBSON et al. 1997, s. 2.4.4).
2.4.1 Zellmorphologie und zeitliche Abfolge der Apoptose
Apoptotische Zellen zeigen kardinale morphologische Veränderungen: Das sog.
„membrane blebbing“ (Bläschenbildung und Ausstoß von Membranvesikeln bei noch intakter Integrität der Zellmembran), ein Schrumpfen der Zelle, die Kondensation des Chromatins und die Fragmentierung der DNA. Was im Durchflußzytometer an morpho- logischen Veränderungen beurteilt werden kann, tritt in den Stadien der Apoptose erst relativ spät auf. In Abb. 1 wird am Beispiel der - in einer humanen Zellinie durch Fas- Fas-Ligand-Interaktion - induzierten Apoptose der zeitliche Ablauf biochemischer und morphologischer Veränderungen verdeutlicht:
Aktivierung von ICE-Proteasen Æ
PARP-Proteolyse Æ
PS-Externalisierung Æ
DNA-Fragmentierung Æ
morphologische Änderungen Æ
Plasmamembranschädigung Æ
0 2 4 6 8 10 Stunden
Abb. 1 Stadien der Apoptose zu unterschiedlichen Zeiten nach anti-Fas- Induktion in Jurkat-Zellen.
In Jurkat-Zellen (humane T-Leukämiezellen) wurde durch Inkubation mit einem Antikörper gegen das Fas-Molekül die Apoptose induziert. Gezeigt wird die zeitliche Abfolge nachweisbarer biochemischer und morphologischer Veränderungen auf zellulärer Ebene. Die Aktivierung der Caspasen erfolgt in einem Zeitraum zwischen 0-2 Stunden. Diese Aktivierung ist zusammen mit der Proteolyse des Enzyms PARP (Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase) die erste Reaktion der Zelle auf das Todessignal. Erst ca. 2 Stunden später kommt es zur Externalisierung von Phosphatidylserin (PS) an die äußere Zellmembran. Morphologische Änderungen bzw. der Nachweis der Plasmamembranschädigung lassen sich im Fall der verwendeten Zellinie erst relativ spät feststellen. ICE: Interleukin-1 converting enzyme = Caspasen (s.2.4.4); DNA: Desoxyribonukleinsäure.
Apoptotische Zellen im Thymus, der Milz und den Lymphknoten werden von Makrophagen vor Ihrer Lyse internalisiert, was zu der Vermutung veranlaßt, daß Makrophagen eine für den Vorgang der Apoptose spezifische Veränderung der Oberflächenstruktur erkennen. Es ist bekannt, daß die Plasmamembranen von normalen Blutzellen eine signifikante Phospholipidasymmetrie aufweisen, wobei sich Phosphatidylcholin und Sphingomyelin hauptsächlich an der äußeren Seite der Membran und Phosphatidylethanolamin fast ausschließlich auf der Innenseite der Plasmamembran befinden. Das anionische Phospholipid, Phosphatidylserin, ist in normalen Zellen an der Innenseite der Plasmamembran lokalisiert. Es konnte beobachtet werden, daß ein Verlust dieser Plasmamembranasymmetrie zu einer verstärkten Bindung und einem Anstieg der Phagozytose dieser Zellen durch Makrophagen führt (MC EVOY et al. 1986). Die Gruppe um V.A. FADOK (1992) untersuchte, ob ein Verlust der Membranasymmetrie im Verlauf der Apoptose auftritt. Makrophagen könnten dann apoptotische Zellen auf Grund ihrer hydrophoben Oberfläche bzw. ihrer negativen Ladung oder sogar spezifisch Phosphatidylserin erkennen. Sie kommen zu dem Schluß, daß die Externalisierung von Phosphatidylserin eine universelle Veränderung der Oberflächenstruktur ist, die vermutlich allen apoptotischen Zellen, unabhängig von der Herkunft der Zellen bzw. dem „Auslöser“ der Apoptose, eigen ist.
Bei der Induktion von Apoptose haben sog. „Todesrezeptoren“ eine sehr wichtige Funktion. Die Rezeptoren besitzen intrazelluläre Todesdomänen, welche für die Transmission des zytotoxischen Signals erforderlich sind. Zur Zeit sind fünf verschiedene dieser Todesrezeptoren bekannt (Übersicht bei: SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998): der TNF-Rezeptor-1, das TNF-receptor-related-apoptosis-mediating protein (TRAMP), der TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 1, der TNF- related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 2 und das CD95 (alt: Fas oder APO-1).
Viele Zelloberflächen-Rezeptoren sind in der Lage nach Ligation, zytotoxische Signale in das Zytoplasma weiterzugeben. In den meisten Fällen haben sie jedoch noch weitere Funktionen. Ob die Signale nach Rezeptoraktivierung zu Zellaktivierung, Zelldifferenzierung oder Zelltod führen, ist stark abhängig vom Zelltyp und während der Differenzierung streng reguliert (SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998). Die Wege, wie diese Rezeptoren die Apoptose induzieren, sind ziemlich ähnlich. Durch die Bindung des Liganden kommt es zur Oligomerisation des Rezeptors und daraufhin zu der Bindung eines Adapterproteins an die Todesdomäne.
Das Adapterprotein bindet dann eine proximale (initiierende) Caspase, wodurch das für Apoptose verantwortliche Rezeptorsignal an distale (ausführende) Caspasen weitergegeben wird (vgl. Abb. 1). Es gibt jedoch auch Kreuzvernetzungen zwischen den Kaskaden (NAGATA 1997, MONNEY et al. 1998).
Abb. 2 Vereinfachte schematische Darstellung der Aktivierung der „Todes- rezeptoren“ CD95 und TNF-R1.
Durch die Bindung des Liganden (z.B. Fas-Ligand oder TNF-α) kommt es zur Oligomerisation der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptoren (TNF-RI) oder der FAS-Moleküle, und daraufhin zur Bindung eines Adapterproteins (FADD, TRADD) an die Todesdomäne. Das Adapterprotein bindet dann eine proximale (initiierende) Caspase (TNF-R1: Caspase-2; Fas: Caspase-8), wodurch das für Apoptose verantwortliche Rezeptorsignal an distale (ausführende) Caspasen (u.a. Caspase-3, -6, -7) weitergegeben wird. FADD: Fas-associated death domain protein;
TRADD: TNF receptor-associated death domain protein; RIP: receptor interacting protein;
RAIDD: RIP-associated ICH-1/Ced-3 homologous death domain protein (modifiziert nach Biosource International, Apoptosis Applications & Glossary).
2.4.2 Regulation der Apoptose
Der Vorgang der Apoptose muß streng geregelt sein, weil ansonsten unerwünschte Zellen überleben oder notwendige Zellen sterben würden. Entgleisungen dieses Systems resultieren häufig in der Entstehung von Tumoren, Autoimmunerkrankungen und degenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (THOMPSON 1995). Die Caspasen können durch verschiedene Stimuli aktiviert werden und spielen eine zentrale Rolle in der Ausführung der Apoptose (SALVESEN & DIXIT 1997). Die Aktivität der Caspasen und ihre Gegenregulation durch Apoptose-hemmende Proteine wie die der Bcl-2 Familie und die der Apoptose-hemmenden Proteinfamilie (IAP) sind entscheidend für die molekularen Mechanismen der Apoptose (KOBAYASHI et al.
1999).
Der Begriff des programmierten Zelltodes (PCD) impliziert eine Existenz von Genen, die für eine Kaskade von Proteinen kodieren, die ihrerseits den Untergang der Zelle einleiten können. Für eukaryote Zellsysteme konnten verschiedene Gene identifiziert werden, die direkt oder indirekt an der Induktion der Apoptose beteiligt sind. Als Beispiel für die sog. „death genes“ sei das p53 Gen genannt. Es kodiert für einen multifunktionellen Transkriptionsfaktor, der über die genetische Stabilität der Zelle wacht. Gene, die für die Regulation der Apoptose verantwortlich sind, stehen im Gleichgewicht mit Genen, die für die Zellproliferation bedeutsam sind (GSCHWEND 1996).
Zumindest ein intrazellulärer Mechanismus, der den Zelltod kontrolliert, ist im Laufe der Evolution erhalten geblieben. Das ced-9 Gen, das in dem Nematoden Caenorhabditis elegans den programmierten Zelltod verhindert, ist homolog zu dem bcl-2 Gen, das die Apoptose in Zellen von Säugetieren verhindert (VAUX et al. 1988, Übersicht bei: KORSMEYER 1995). Eine ganze Reihe von Strukturen, die zu dieser Familie gehören, konnte bei Säugetieren identifiziert werden.
Die Bcl-2 Familie setzt sich zusammen aus Inhibitoren des Zelltodes, wie Bcl-2 und Bcl-XL, und Promotoren des Zelltodes, wie Bax und Bak. Die Frage, wie diese Re- gulatoren funktionieren und zusammenspielen, wird immer noch kontrovers diskutiert.
Interessanterweise können Mitglieder dieser Familie Homodimere und Heterodimere formen. Es wurde ursprünglich angenommen, daß Bax und wahr-scheinlich Bak die Todesmaschinerie direkt beeinflussen, wohingegen Bcl-2 und Bcl-XL diese Interaktion nur antagonisieren. Diese Vermutung wird durch die Beobachtung unterstützt, daß
mutante Formen von Bcl-2, die nicht mehr mit Bax und Bak heterodimerisieren können, ihre Fähigkeit, die Apoptose dieser Zellen zu verhindern, einbüßen (Übersicht bei:
CHINNAIYAN & DIXIT 1996). Vor kurzem identifizierten jedoch CHENG et al.
(1996) eine mutante Form von Bcl-XL, die trotz ihrer fehlenden Fähigkeit mit Bax und Bak zu interagieren, immer noch todesverhindernde Aktivität zeigt. Dies spricht für die Existenz eines Bax und Bak unabhängigen Todespfades. Diese neueren Erkenntnisse unterstützen ein Modell, in dem Bax und Bak den Zelltod induzieren, indem sie die Bindung der negativen Regulatoren, Bcl-2 und Bcl-XL, und damit die Inhibition ihrer beabsichtigten Ziele verhindern. Es scheint, daß die Mitglieder der Bcl-2 Familie, anstatt zu heterodimerisieren, kompetitiv um einen gemeinsamen Bindungspartner konkurrieren (SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998).
Andere negative Regulatoren des Zelltodes wurden im Verlauf der Forschung an Viren entdeckt. Dies überrascht nicht, denn es ist plausibel, daß die Viren die Zellen, die für ihre Vermehrung notwendig sind, am Leben erhalten wollen. Das Verhältnis von Aktivatoren zu Inhibitoren bestimmt wahrscheinlich die Tendenz der Zelle apoptotisch zu werden (KORSMEYER 1995), obwohl die Aktivität einiger dieser Proteine auch durch Phosphorylierung geregelt werden kann (Übersicht bei: GAJEWSKI &
THOMPSON 1996). Es ist bisher nicht bekannt, wie diese Proteine funktionieren.
Obwohl die meisten Zellen Signale zum Überleben in Kultur von anderen Zellen bekommen, gibt es auch welche, die diese Signale für sich selber produzieren. Für das lange Überleben in Kultur ist eine Kombination verschiedener Signalmoleküle für die meisten Zellen nötig. Diese Moleküle können löslich, an die Plasmamembran oder an die extrazelluläre Matrix gebunden sein.
CHINNAIYAN & DIXIT (1996) stellten sich die Frage, wo in der Zelle die Caspasekaskade lokalisiert ist. Enukleierte Zellen zeigten nach verschiedenen Todesstimuli morphologische Veränderungen, die mit apoptotischen Veränderungen assoziiert waren. Dies führte zu der Vermutung, daß die Todesmaschinerie außerhalb des Nukleus lokalisiert ist.
2.4.3 Apoptose bei neutrophilen Granulozyten
Durch bestimmte in vivo Mechanismen wird einerseits in einer normalen, nicht pathogenetischen, Situation die Schädigung des Gewebes durch Neutrophile verhindert, andererseits wird die Aktivität der Neutrophilen, in einer Situation, wie einer bakteriellen Infektion, gestärkt (TSUCHIDA et al. 1995). Wenn die Apoptose von Neutrophilen als ein Weg angesehen wird, ungewollte Zellen zu eliminieren, wie im Thymus oder bei der Entwicklung von Nervengewebe, so können Neutrophile auf diesem Weg daran gehindert werden, normalem Gewebe durch die Produktion von aktiven Sauerstoffradikalen und proteolytischen Enzymen zu schaden. Auf der anderen Seite mag es sinnvoll sein, daß Neutrophile bei bakteriellen Infektionen in den Entzündungsbereichen lange genug überleben, um Bakterien zu phagozytieren und zu töten. In der Summe wird mittlerweile die Apoptose als Kontrollmechanismus zur Regulation der Aktivität von neutrophilen Granulozyten angesehen (FANNING et al.
1999).
Zytokine wie das TNF-α induzieren, andere Zytokine (GM-CSF, IL-1, IL-8 und IFN-γ) verhindern in vitro die Apoptose von humanen neutrophilen Granulozyten.
Diese Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß die Apoptose der Neutrophilen zum Großteil über Zytokine und Chemokine gesteuert wird (TSUCHIDA et al. 1995).
Allerdings ist auch ein autokriner Tod der Neutrophilen durch ihre konstitutive Co- Expression von CD95 (Fas) und Fas-Ligand auf ihrer Zelloberfläche beschrieben (LILES et al. 1996). Neutrophile sind hochempfindlich gegenüber einer Induktion einer Fas-vermittelten Apoptose in vitro nach Stimulation mit einem Antikörper gegen Fas.
Allerdings kann die Fas-vermittelte Apoptose auch durch Inkubation mit z.B. G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α oder Dexamethason unterdrückt werden (LILES et al. 1996).
In vitro wurde bei Neutrophilen eine dramatische Hemmung der Apoptose beobachtet, wenn Thrombozyten anwesend waren. Der dafür verantwortliche Mechanismus konnte jedoch nicht definiert werden (ANDONEGUI et al. 1997).
WHYTE et al. (1993) zeigten, daß apoptotische neutrophile Granulozyten eine verminderte Phagozytose, eine verminderte Degranulation und eine Reduktion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies aufwiesen. Da die Abgabe von toxischen Produkten durch aktivierte Neutrophile zu Gewebeschädigung und zu chronischen Entzündungen führen kann, belegen diese Befunde den entzündungshemmenden Effekt einer Apoptoseinduktion in neutrophilen Granulozyten.
