Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. W. Solbach
Das Apoptose- und Chemotaxisverhalten von neutrophilen Granulozyten nach Infektion mit Streptococcus pneumoniae
vorgelegt von Elisabeth Maniak aus Braunschweig
Lübeck 2006
1. Berichterstatter: Prof. Dr. univ. (Univ. Budapest) Tamàs Laskay 2. Berichterstatterin: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Silvia Bulfone-Paus
Tag der mündlichen Prüfung: 25.06.2007 Zum Druck genehmigt. Lübeck den 25.06.2007
Gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach - Dekan der Medizinischen Fakultät-
Für meine Familie
Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung………...7
1.1 Homöostase und Immunsystem……….7-8 1.2 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten………....8-9 1.3 Streptococcus pneumoniae………...9-10 1.4 Apoptose und Nekrose………...10-13 1.5 Chemotaxis………...13-14 1.6 Fragestellung/Zielsetzung……….14-15 II. Material………..………. ………16
2.1 Instrumente………16-17 2.2 Laborbedarf………17
2.3 Medien und Puffer……….17-18 2.4 Zytokine, Enzyme und Farbstoffe………….……….………...18
2.5 Chemikalien……….. 18-19 2.6 Software……… 19-20 2.7 Statistik………. 20
III. Methoden………. …….. ..21
3.1 Isolation und Kultivierung von humanen polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN)……….21
3.2 Kultivierung und Aufbereitung von Streptococcus pneumoniae………..22
3.3 PMN: Apoptoseinduktion……….22
3.4 PMN/Streptococcus pneumoniae-Koinkubation……….. 23
3.5 Giemsa-Färbung………. ..23
3.6 Live-Dead-Färbung………...23
3.7 Markierung mit Annexin V/Propidiumiodid……….24
3.8 IL-8-ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay)………...24
3.9 Chemotaxisassay………...24-25 3.10 Glucuronidaseassay……….25
3.11 Lipidisolierung………26
IV. Ergebnisse………..27 4.1 Spontanapoptose der PMN………27-28 4.2 Induzierte Apoptose der PMN………...29-30 4.3 Apoptoseinduktion bei PMN durch Infektion bzw. Koinkubation mit
Streptococcus pneumoniae………..30-33 4.4 Ermittelung der Apoptoserate von PMN infiziert bzw. koinkubiert mit
Pc w durch FACS-Analyse……….34-38 4.5 Apoptoseinduktion bei PMN durch Infektion mit Streptococcus
pneumoniae-Mutanten……….38-40 4.6 Hemmung der apoptoseinduzierenden Faktoren Pneumolysin
und H2O2………...40-42
4.7 Untersuchung der Fähigkeit zur Rekrutierung von Phagozyten
durch PMN………42-44 4.8 Chemotaxisassays von PMN
(Spontanapoptose versus Apoptoseinduktion)………..44-45 4.9 Chemotaxisassays mit Zelllinien………46-47 4.10 Einfluss von Streptococcus pneumoniae auf Chemotaxis………....…47-49 4.11 Blockierung des IL-8-Pathways………...……50-53 4.12 Blockierung des fMLP-Pathways……….54-57 4.13 Chemotaxisassay der Lipid- und Proteinfraktion von
Überständen infizierter PMN……….………....57-58 4.14 Vergleich des chemotaktischen Index von abgekochten versus
nativen Überständenen………...58-59
V. Diskussion………....60-68 VI. Zusammenfassung……….69 VII. Referenzen………....70-75 VIII. Danksagung……….76 IX. Curriculum vitae………77
Abkürzungen:
Abb. Abbildung ANV Annexin-V-Fluos
BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) CI Chemotaktischer Index
ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay FACS fluorescence-activated cell sorter FCS fetal calf serum (fetales Kälberserum) fMLP N-Formyl-Methionin-Leucyl-Phenylalanin h hour (Stunde)
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-2- Ethansulfonsäure
IL Interleukin
LPC Lysophosphatidylcholin min. Minuten
NAC N-Acetyl-Cystein
OR Odds ratio (Verhältnis von x zu y) PBS phosphate buffered saline
Pc Streptococcus pneumoniae, Pneumokokken Pc w Streptococcus pneumoniae Wildtyp
PI Propidiumiodid
PMN polymorphkerniger neutrophiler Granulozyt PS Phosphatidylserin
PSR Phosphatidylserinrezeptor RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur
SB SB 203580 (p38 MAP Kinaseinhibitor) SD Standardabweichung
St Staurosporin UV Ultraviolett
I. Einleitung
1.1 Homöostase und Immunsystem
Die Fähigkeit einer Zelle sich einer verändernden physiologischen Umgebung anzupassen, ist eine wichtige Vorraussetzung für die Homöostase von Geweben und Organen und damit für das Überleben von mehrzelligen Organismen. Zur Aufrechterhaltung dieser Homöostase, also dem Gleichgewicht des Körpers, sind verschiedenste Mechanismen nötig. Eine kontrollierte Interaktion der unterschiedlichen Zellen und Systeme des Organismus sind dabei essentiell.
Eine zentrale Figur hat hierbei das Immunsystem. Dieses komplexe Kontroll- und Abwehrsystem des Menschen besteht aus zellulären und humoralen Komponenten. Seine Aufgabe ist es, den eigenen Organismus vor körperfremden Substanzen, wie Toxinen und infektiösen Krankheitserregern, wie Bakterien, Protozoen, Pilzen, Viren und Parasiten, zu schützen. Die Immunologie unterscheidet konzeptionell und mechanistisch zwischen angeborener und erworbener Immunität. Beide Systeme verfügen sowohl über zelluläre als auch über humorale Elemente, die miteinander interagieren und ergänzend zusammenwirken (Hahn et al., 2004).
Die angeborene, unspezifische Immunität stellt den phylogenetisch älteren Teil des Immunsystems dar. Die Induktion der unspezifischen Immunität, die gegen mikrobielle Erreger und deren Bestandteile gerichtet ist, verläuft sehr schnell, ist jedoch unangepasst und unabhängig von einem früheren Erregerkontakt. Zelluläre Vertreter der angeborenen Immunität sind basophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, Mastzellen, phagozytierende, polymorphkernige, neutrophile Granulozyten und Monozyten, sowie Makrophagen und natürliche Killerzellen. Neutrophile Granulozyten bilden dabei die erste Verteidigungslinie gegen eine Vielzahl von pathogenen Erregern (Gasperini et al. 1999).
Humorale Bestandteile der angeborenen Immunität sind Akute-Phase-Proteine, Enzyme (z.B. Lysozyme) und das Komplementsystem. Deren Funktion besteht in der Agglutinierung oder Opsonisierung von Fremdkörpern und in der Rekrutierung von Monozyten, Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und von Zellen der spezifischen Immunität zum Ort der Infektion.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der Homöostase und Gesundheit des Gesamtorganismus Gefahr von gleich mehreren Seiten droht. Eine große Gefahr stellen dabei Infektionen durch mikrobielle Erreger wie z.B. durch Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken, Pc) dar. Auf der anderen Seite besteht aber auch durch sterbende körpereigene Zellen, welche nicht zügig und kontrolliert abgebaut werden eine potentielle Gefahr (Haslett 1997).
Das Immunsystem nutzt sein Netzwerk von Zellen wie Peripheren neutrophilen Granulozyten (PMN, s.u.) und Makrophagen um diese Gefahren zu beseitigen. Der Vorgang der Bereitstellung von Makrophagen wie z.B. Dendritischen Zellen ist vergleichsweise langsam, aber recht gut erforscht, ebenso wie ihre Interaktion mit Erregern wie beispielsweise Streptococcus pneumoniae (Colino und Snapper, 2003).
PMN sind als erste Linie der Abwehr bekannt (Gasperini et al. 1999), aber ihre Rekrutierung und ihr Umgang mit infizierten und/oder sterbenden Zellen ist wenig erforscht.
1.2 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) repräsentieren mit einem Anteil von 50-60% der Gesamtzahl aller Blutleukozyten über die Hälfte der sich im Blut befindenden sogenannten weißen Blutzellen. Ihre Entwicklung im Knochenmark hat eine Zeitdauer von ungefähr zwei Wochen, während der die Zellen über sechs verschiedene morphologische Stufen: Myeloblast, Promyeloblast, Myelocyt, Metamyelocyt, nicht-segmentierter (bandförmiger) Neutrophiler, segmentierter Neutrophiler proliferieren und differenzieren.
Das Knochenmark eines gesunden Erwachsenen produziert durchschnittlich mehr als 1011PMN pro Tag und mehr als 1012 bei einer akuten Entzündung. Als enddiffernzierte Effektorzellen stellen sie die erste Abwehrlinie gegen pathogene Erreger und ein wichtiges Bindeglied zwischen der angeborenen und adaptiven Immunität dar (Iking-Konert et al.
2001). Die PMN bewirken eine Verteidigung des Organismus gegen extrazelluläre Mikroorganismen durch das Freisetzen einer Vielzahl von Proteasen, reaktiven Oxygenintermediaten und Arachidonsäuremetaboliten (Smith 1994).
Mit einer mittleren Verweildauer von 5 bis 10 Stunden im peripheren Blut wandern die Zellen nach einer Infektion, durch Chemotaxis (s.u.) gelenkt, ins Gewebe ein. Dort phagozytieren sie freie oder opsonisierte bakterielle Krankheitserreger in den lokalen Gebieten einer Entzündung und töten diese sowohl intra- als auch extrazellulär ab.
Der Mechanismus ihrer Rekrutierung geht im Vergleich zu den Makrophagen schnell vonstatten, ist dabei jedoch noch nicht gut verstanden, wie auch die Wechselwirkung zwischen PMN und einem Erreger wie Streptococcus pneumoniae.
Nach vollbrachter Leistung gehen die Granulozyten zugrunde.
1.3 Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken, Pc) bilden eine alpha-hämolysierende Spezies innerhalb der Gattung Streptococcus. Pneumokokken kommen sowohl beim Menschen als auch bei Affen, Ratten und Meerschweinchen vor. Unbekapselte (d.h., nicht virulente) Stämme kolonisieren bei 40-70% aller gesunden Personen die Rachenschleimhaut und kommen ebenfalls in der Konjunktiva ohne Krankheitswert vor.
Bei Erwachsenen stehen Pneumokokken als Erreger der eitrigen Meningitis an erster Stelle. Nach Übertragung kolonisieren Pneumokokken zunächst den oberen Respirationstrakt mittels bisher nur unzureichend beschriebenen Klinik: es werden beobachtet: Lobärpneumonie, Bronchopneumonie, Otitis media und Ulcus serpens corneae (Hahn et al., 2004).
Die Zellwand der Pneumokokken enthält Peptidoglykan und Teichonsäure. Letztere wird auch als C-Substanz bezeichnet und ist ein Antigen. Frisch isolierte Pneumokokkenstämme tragen eine Kapsel aus Polysaccharid, von der mehr als 80 verschiedene Serotypen bekannt sind. Die Kolonien der Bekapselten zeigen einen schleimigen Glanz und werden als S- Formen (s = smooth) bezeichnet.
Die Kapseln erschweren die Phagozytose der Pneumokokken: nur S-Formen sind virulent.
Dabei ist die Virulenz der Dicke der Kapsel proportional. Schwere Pneumokokkenerkrankungen werden durch Kapseltypen ausgelöst, die Komplement nicht über den alternativen Weg aktivieren. Somit entgehen sie der komplementvermittelten Phagozytose, was sich besonders nachteilig in der Frühphase der Infektion, das heißt vor der Antikörperbildung, auswirkt.
Zu den extrazellulären Virulenzfaktoren gehört das Pneumolysin: ein Zytolysin, das sich an Cholesterol von Zellmembranen bindet, sich in diese inseriert und durch Oligomerisierung von 20-80 Molekülen eine transmembranöse Pore bildet, was zum
Ca2+-Einstrom und zum Zelltod führt. Pneumolysin ist ein Toxin, welches den respiratory- burst der neutrophilen Granulozyten inhibiert (Paton et al. 1983).
In sublytischen Dosen hemmt Pneumolysin die Funktion von Phagozyten und Lymphozyten. Darüber hinaus aktiviert Pneumolysin das Komplementsystem über den klassischen Weg, indem es sich an die Fc-Region von IgG bindet; aus Monozyten kann es IL-1-beta und TNF-alpha freisetzen.
Der durch Pneumolysin induzierte Zelltod lässt sich durch das sogenannte SB 203580 (SB) hemmen. SB ist ein potenter und selektiver p38 MAP Kinaseinhibitor (Stringaris et al.
2002).
Pneumokokken können des Weiteren auch H2O2 sezernieren. H2O2 ist ebenso wie Pneumolysin ein Neurotoxin (Braun et al. 2001). Dieses bewirkt über eine toxische Schädigung der Zellstruktur den Zelltod. Des Weiteren induzieren beide einen Anstieg des intrazellulären Kalziums (Ca2+) und triggern somit die Freisetzung vom so genannten Apoptosis-inducing-factor (AIF) aus den Mitochondrien. Das chelatierende Ca2+ blockiert effizient die AIF-Freisetzung und somit den Zelltod (Braun et al. 2002).
H2O2 lässt sich durch das Antioxidans N-Acetyl-Cystein (NAC) oder Katalase inaktivieren (Braun et al. 2001).
Zusammengefasst lässt sich feststellen, dass Streptococcus pneumoniae in der Lage ist den Zelltod zu modulieren.
1.4 Apoptose und Nekrose
Es gibt zwei Hauptformen des Zelluntergangs: die Apoptose und die Nekrose. Während der Zelltod durch Nekrose als von außen erzwungen charakterisiert werden kann, ist die Apoptose ein endogener Prozeß, der im Zellinneren eingeleitet wird.
Die Nekrose ist gekennzeichnet durch die irreversibel gesteigerte Permeabilität des Membransystems und den konsekutiven Zusammenbruch des intrazellulären Ionenmilieus.
Die Mitochondrien schwellen, es kommt zur Cristolyse und zum Schwund der Ribosomen.
Lichtmikroskopisch erscheint ein Zellhydrops, und unter prinzipiellem Erhalt des Zellaufbaus finden schließlich Lyse und anschließend Phagozytose der inerten Zellreste statt. Typisch dabei ist die Schädigung des umliegenden Gewebes (Biorama 2005).
Daneben existiert ein physiologischer Modus des Zelltods, der gezielte programmierte Zelltod: die Apoptose. Apoptose ist ein genetisch regulierter aktiver Prozess, der für Wachstum, Differenzierung und Aufrechterhaltung der Homöostase des Immunsystems
essentiell ist. Dabei findet im Gegensatz zur Nekrose keine Entzündungsreaktion des umliegenden Gewebes statt (Biorama 2005).
Der Begriff „Apoptose“ wurde erstmals von Kerr, Wylli und Curri geprägt, die Veränderungen in der Morphologie von Lebergeweben nach Eliminierung lebensnotwendiger Wachstumsfaktoren beobachten (Kerr et al., 1972).
Die Apoptose lässt sich an diversen morphologischen und biochemischen Merkmalen festmachen. Sie lässt sich in verschiedene Phasen einteilen: in der Frühphase wird Phosphatidylserin (PS) auf der Oberfläche exprimiert. Dieser Vorgang wird als Membran Flip-Flop bezeichnet (Homburg et al. 1995).
Alle (bislang bekannten) Wege der Apoptoseinduktion führen zu der Aktivierung einer Serie von Kaspasen (Caspase= Cysteinyl aspartic acid-protease) (Janeway et al. 2001).
In der sogenannten Effektorphase verursachen Kaspasen hochspezifische proteolytische Spaltprozesse in sterbenden Zellen, welche sich in ihrer Gesamtheit als apoptotischer Phänotyp der Zelle darstellt (Nicholson et al. 1997). Für die Induktion des apoptotischen Pathways der Neutrophilen sind die Kaspasen-1, -3, -4 und -8 maßgeblich beteiligt (Santos-Beneit und Mollinedo, 2000; Yamashita et al., 1999).
Neben der spontanen Apoptose von PMN lässt sich Apoptose auch induzieren. Als Beispiele seien hier die Bestrahlung durch UV-Licht und die Gabe von Staurosporin, einem Proteinkinaseinhibitor, genannt (Bahlis et al., 2005). Des Weiteren lässt sich die Apoptose der PMN durch Infektion modifizieren. Sie lässt sich durch Erreger wie dem intrazellulären Leishmania major (Aga, E. et al. 2002) verzögern und durch extrazelluläre wie z.B. E.coli (Yagi, Y. et al. 2002) induzieren. Wir wählten Streptococcus pneumoniae als extrazellulären, apoptoseinduzierenden Erreger.
Die Besonderheit bei der Apoptoseinduktion durch Streptococcus pneumoniae besteht darin, dass hier neben dem klassischen Kaspase-abhängigen Weg ein Kaspase- unabhängiger Weg der Apoptoseinduktion diskutiert wird: H2O2 und Pneumolysin aktivieren den sogenannten apoptosis-inducing.factor (AIF), welcher dann die Apoptose auslöst. Bisher ist dieser alternative Weg jedoch nur für dendritische Zellen (Colino und Snapper, 2003) und Gliazellen (Braun et al. 2002) beschrieben.
In der Endphase der Apoptose lassen sich eine Kernpyknose und –prominenz, Chromatinkondensation und –aggregation, eine Zellschrumpfung, Verlust der multilobulären Kernstruktur (Payne et al., 1994), zytoplasmatische Vakuolisierung, Trypanblau-Ausschluß in den ersten Stunden und der Zerfall in membranumgebene Apoptosekörper feststellen (Savill, Wyllie et al. 1989).
Die effiziente Elimination apoptotischer Zellen ist entscheidend für die Homöostase der Gewebe von multizellulären Organismen. Die apoptotischen Zellreste müssen zügig und vollständig abgeräumt werden, um keine Nekrose und Entzündung zu induzieren. Bei unseren durchgeführten Experimenten konnten in den Proben, welche mit Pneumokokken infizierte PMN enthielten, diese sterbenden Zellen nicht aufgeräumt werden. Dadurch gehen die Zellen in die sogenannte apoptotische Nekrose und ergeben eine positive Färbung sowohl für Propidiumiodid als auch für Annexin-V-Fluos (siehe auch FACS- Färbung).
Für den Prozess des Abräumens toter Zellen stellt eine Kaskade von abgesonderten Signalen das zentrale Element dar.
Die eintretende Apoptose führt zu einer Veränderung der Zelloberfläche, welche ihre Bindung und Phagozytose erlaubt (Fadok et al.1992). Die charakteristische Oberflächenveränderung, die mit der einhergehenden Apoptose assoziiert wird, ist der Verlust der Phospholipidsymmetrie und das Hervorbringen von Phosphatidylserin (PS) auf der äußeren Zellmembran als einem sogenannten „eat-me“-Signal, also einem Erkennungsmerkmal für die Phagozyten. Dieses zu den Phosphoglyceriden zählende Membranlipid ist normalerweise auf der Innenseite der Zellmembran zu finden und wird nur beim Eintritt der Apoptose auf die Zelloberfläche gebracht. Aufgrund der Verlässlichkeit dieses Vorgangs wurde PS allgemein als Apoptosemarker genutzt (Hanna et al.2005).
Neben den „eat-me“-Signalen ist auch eine anti-entzündliche Komponente entscheidend.
Das sogenannte „silencing“ ist eine Form der Transkriptionsregulation, bei der bestimmte Regionen des Genoms reversibel inaktiviert werden durch Änderung in der Chromatinstruktur (Bethesda, 2003). Dadurch werden antiinflammatorische Zytokine freigesetzt, die wiederum zu einer Deaktivierung der entsprechenden Immunzellen führen.
Um die phagozytierenden Zellen zum Ort der Apoptose zu locken sind sogenannte „find- me“-Signale, also chemotaktisch wirksame Stoffe essentiell. Ihre Notwendigkeit erklärt sich dadurch, dass die sterbende Zelle und der Phagozyt meist nicht in unmittelbarer Nachbarschaft voneinander sind (Lauber et al. 2004). Der Phagozyt wird also durch die Sekretion löslicher Lockstoffe von der apoptotischen Zelle angezogen und muss seinen Wirkungsort erreichen, bevor die sterbende Zelle in die postapoptotische Nekrose eintritt.
Anhand von in vitro Transmigrationsassays konnte gezeigt werden, dass das chemotaktische Signal auf einem Kaspase-3 abhängigen Weg wirkt (Lauber et al. 2003).
Weitere Studien konnten das Phospholipid Lysophosphatidylcholin (LPC) als einen potentiellen Kandidaten identifizieren, welcher die Anziehung von Phagozyten zu apoptotischen Zellen vermittelt. Es ist jedoch noch nicht bekannt, ob LPC selbst der chemotaktisch aktive Faktor ist, oder ob es erst durch den Phagozyten zu einer aktiven Form metabolisiert werden muss. Es gibt experimentelle Untersuchungen, die sowohl für die erste Variante (Mochizuki et al. 1982) als auch für die Alternative (McMurray et al.
1993) sprechen.
Ob auch mit Streptococcus pneumoniae infizierte Phagozyten ein „find-me-Signal“
freisetzen und was dieses sein könnte, ist bisher nicht bekannt.
1.5 Chemotaxis
Essentiell für die Bekämpfung von Streptococcus pneumoniae ist die Schnelligkeit mit der Phagozyten an den Ort der infizierten Zellen rekrutiert werden. Im Falle der Streptococcus pneumoniae Infektion ist es zusätzlich wesentlich, dass die infizierten und sterbenden Zellen schnellstmöglich aufgeräumt werden.
Diese gerichtete Bewegung von Zellen in Reaktion auf ein Signal wird Chemotaxis genannt. Chemotaxis ist bisher für Phagozyten, Lymphozyten, Fibroblasten, Melanoblasten, menschliche Spermatozoen und Bakterien beschrieben. Nachdem die Zelle ein chemotaktisches Signal empfangen hat, richtet er sich zuerst im Gradienten so aus, dass die Pseudopodien in Richtung der Quelle des Chemoattractans liegen, und beginnt dann, sich auf die Quelle entlang des Konzentrationsgradienten des Lockstoffs zuzubewegen (Klein 1991).
Ohne Gradienten bewegen sich Zellen auf zufällige Art und Weise, indem sie laufen oder taumeln. Im ersten Fall schwimmt die Zelle gerichtet vorwärts, im zweiten hält sie dagegen an und torkelt. Nach dem Taumeln erfolgt die Richtung des nächsten Laufes zufällig.
Somit bewegt sich die Zelle zufällig laufend oder taumelnd in ihrem Lebensraum, aber nicht in eine bestimmte Richtung. Ist nun jedoch ein Gradient eines chemischen Lockstoffes vorhanden, dann werden aus diesen zufälligen Bewegungen gerichtete Bewegungen. In dem Maße, wie die Zelle höhere Konzentrationen des Lockstoffes wahrnimmt, indem sie periodisch die Konzentration der Chemikalie in ihrer Umwelt bestimmt, läuft sie längere Strecken und taumelt seltener. Die Folge davon ist, dass sich die Zelle entlang des Konzentrationsgradienten des Lockstoffes bewegt. Dieser chemische Gradient wird zeitlich wahrgenommen durch so genannte Chemorezeptoren, sensorische
Proteine in der Membran, welche als Folge durch Interaktion mit cytoplasmatischen Proteinen beeinflussen, in welche Richtung die Zelle sich bewegt (Brock et al. 2000).
Die Granulozyten werden durch chemotaktische Faktoren, wie z.B. N-Formyl-Methionyl- Leucyl-Phenylalanin (fMLP) oder chemotaktische Zytokine (Chemokine), zum Ort der Infektion geleitet. Hierbei können zwei Untergruppen aufgrund der Struktur und der biologischen Aktivität unterschieden werden: die sogenannten CC-Chemokine sind dadurch charakterisiert, dass zwei aminoterminale Zysteinreste direkt nebeneinander liegen. Bei den CXC-Chemokinen sind die beiden Zysteinreste durch eine weitere Aminosäure getrennt. Die CXC-Chemokine wirken hauptsächlich auf neutrophile Granulozyten, während die CC-Chemokine in erster Linie Monozyten stimulieren.
Chemokine werden nicht nur von mononukleären Phagozyten, sondern auch von anderen Zellen gebildet. Typischerweise sind dies Zellen, die an einem Entzündungsherd zu finden sind. IL-8 stellt ein charakteristisches CXC-Chemokin dar, während RANTES und MCP-1 typische Vertreter der CC-Familie sind (Hahn et al. 2004).
Bakterien selbst erzeugen ebenfalls Peptide als Chemoattraktoren für PMN. Viele Bakterien wie z.B. Escherichia coli, so vermutlich auch Streptococcus pneumoniae (obwohl nicht explizit in der Literatur beschrieben), erzeugen Peptide mit einem aminoterminalen N-formylierten Methionin, und das fMLP ist ein Molekül mit starker chemotaktischer Wirkung auf Entzündungszellen, besonders auf neutrophile Zellen (Janeway et al. 2001). Zuerst wurde fMLP als ein Produkt von Escherichia coli festgestellt.
Der fMLP-Rezeptor ist wie die Rezeptoren für Chemokine und für die Komplementfragmente C5a, C3a und C4a ebenfalls an ein G-Protein gekoppelt (Janeway et al. 2001). Es gibt also einen gemeinsamen Mechanismus für das Anlocken von neutrophilen Zellen, sei es nun durch Komplement, Chemokine oder bakterielle Peptide.
Neuere Studien zeigen, dass offensichtlich auch Lipide wie Lysophosphatidylcholin (LPC) als chemotaktische Faktoren von sterbenden Zellen eine entscheidende Rolle spielen (Lauber et al. 2004).
1.6 Fragestellung/ Zielsetzung
Die Aufrechterhaltung der Homöostase eines Organismus spielt für sein Fortbestehen eine zentrale Rolle. Gewährleistet wird diese vor allem durch die neutrophilen Granulozyten, welche die erste Linie der Abwehr darstellen. Besonders bei einer Infektion, hier durch Streptococcus pneumoniae, einem typischen extrazellulären Erreger, ist also das effiziente
Abtöten und Abräumen von Erregern wesentlich, sowie auch das Abräumen von infizierten sterbenden Zellen.
Die mit Streptococcus pneumoniae infizierten PMN fungierten bei den Versuchen sowohl als abzuräumende, apoptotische Zellen, als auch als aufräumende, phagozytierende Zellen.
Die Fragen, die sich stellten, formulieren sich wie folgt:
1) Welche Auswirkungen hat eine Infektion mit Streptococcus pneumoniae auf die Apoptose von PMNs?
2) Gibt es alternative/kaspaseunabhängige Wege der Apoptoseinduktion bei neutrophilen Granulozyten induziert durch Streptococcus pneumoniae-Infektion?
3) Werden chemotaktische Faktoren von sterbenden PMN ausgeschüttet? Läßt sich diese Chemotaxis auch bei PMN, welche mit Streptococcus pneumoniae infiziert wurden, nachweisen?
4) Welche chemotaktischen Faktoren werden von infizierten apoptotischen PMNs ausgeschüttet?
II. Material
2.1 Instrumente
Analysenwaage Sartorius, Göttingen Axioskop mit Axiocam HRS Carl Zeiss, Jena Blockthermostat
UnitekTMblock thermostat HB 130 Peqlab, Erlangen Block thermostat TCR 200 Roth, Karlsruhe
Brutschrank Jouan, Schrankenberg, Bremen Densimat bioMèrieux, Nürtingen
Eisschrank Ziegra, Isernhagen
ELISA-Reader Sunrise, Tecan Austria GmbH, Grödig-Austria
Flow-Cytometer FACS-Calibur Becton Dickinson, Heidelberg mit CellQuest Software
(FACS = Fluorescence activated cell sorter) Kühlschränke (-20°C, -70°C) Liebherr, Ochsenhausen Laminar flow Arbeitsbank ANTARES Biohit, Köln
Mikroskope Carl Zeiss, Jena pH-Meter Inolab, WTW GmbH, Weilheim
Pipetten
Research 20-200µl Eppendorf, Hamburg Reference 0,5-10µl Eppendorf, Hamburg Reference 2-20µl Eppendorf, Hamburg Reference 100-1000µl Eppendorf, Hamburg Rührer Ikamag Reo, Jank&Kunkel UV Stratalinker 2400 Stratagene, Cedar Creek, Texas, USA
Vibrofix VF1 Electronic, Jank&Kunkel Wasserbad Bioblock Scientific, Cedex, Frankreich
Werkbank Steril, Biohit Antares, Mazzo di Rho, Milano, Italien
Zell-Zählkammern Neubauer, Marienfeld Zentrifugen:
- Biofuge fresco Heraeus, Hanau - Megafuge 2.0R Heraeus, Hanau - Microfuge R Beckman, München - Cytocentrifuge Cytospin Shandon, Frankfurt
2.2 Laborbedarf
Boyden Transwell-Platten, 3,0 µm Porengröße, Transwell Clear Costar, Corning 24 wells Inc., NY, USA
Einmalpipetten Greiner, Frickenhausen (5ml, 10ml, 25 ml)
Gewebekultur Mikrotiterplatten Nunc, Wiesbaden (96-well)
Gewebekulturplatten Greiner, Frickenhausen (6-well, 12-well, 24-well)
Glas slides superfrost Menzel, Braunschweig Handschuhe Vinyl 2000PF, Meditrade, Kiefersfeiden
Pipettenspitzen Greiner, Frickenhausen (1-10µl, 10-100µl, 100-1000µl)
Plastikröhrchen Sarstedt, Nümbrecht (15 ml, 50 ml)
Reaktionsgefäße Sarstedt, Nümbrecht (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml)
Transferpipetten Greiner, Frickenhausen
2.3 Medien und Puffer
Albumin aus Rinderserum (BSA) Sigma, Deisenhofen Fetales Kälberserum (FCS) Gibco BRL, Eggenstein
Gentamycin Sigma, Deisenhofen
Hepes Seromed-Biochrom, Berlin
( N-[2-Hydoxyethyl]piperazine-N`-[2-ethanesulphonic acid]) Histopaque 1077 Sigma, Deisenhofen
Histopaque 1119 Sigma, Deisenhofen L-Glutamin Seromed-Biochrom, Berlin
PBS (Phosphate buffered saline) Apotheke der Universität Lübeck
Penicillin/Streptomycin PAA, Linz, Österreich Percoll Pharmacia, Uppsala, Schweden
RPMI 1640 Medium Gibco Laboratories,
( Roswell Park Memorial Institute) Eggenstein
2.4 Zytokine, Enzyme und Farbstoffe
Annexin-V-Fluos Roche Molecular Biologicals, Mannheim ELISA-Kit: Hu IL-8 ELISA Cytoset BioSource, Camarillo, CA, USA
Ethidiumbromid homodimer-2 Molecular Probes, Leiden, Niederlande N-Formyl-Methionyl-Leucin-Phenylalanin (fMLP) Sigma, Deisenhofen Interleukin-8 (IL-8) Peprotech, Frankfurt Katalase Sigma, Deisenhofen
2.5 Chemikalien
Calciumchlorid Sigma, Deisenhofen CaCl2 Merck, darmstadt Dimethyl-Sulfoxide (DMSO) Sigma, Deisenhofen Ethanol (98%, reinst) Roth, Karlsruhe Ethidiumbromid Sigma, Deisenhofen Giemsa Färbelösung Sigma, Deisenhofen
Glycerin Sigma, Deisenhofen Immersionsöl Carl Zeiss, Jena Isopropanol Roth, Karlsruhe Magnesiumchlorid Sigma, Deisenhofen
Methanol J.T.Baker, Deventer, Holland Mounting Fluid Dako Cytomatia, Denmark House, Cambs, UK
N-Acetylcystein (NAC) Merck, Darmstadt Natriumacetat Sigma, Deisenhofen Natriumchlorid Merck, Darmstadt Paraformaldehyd Sigma, Deisenhofen Phenol Sigma, Deisenhofen p-Nitrophenyl-ß-Glucuronid Sigma, Deisenhofen Propidiumiodid Roche Molecular Biologicals, Mannheim SB 203580 (p38 MAP Kinaseinhibitor) Biaffin GmbH, Kassel (= 4-[5-(4-Fluorophenyl)-2-[4-(methylsulfonyl)phenyl]
-1H-imidazol-4-yl]pyridin) Schwefelsäure Merck, Darmstadt Staurosporin Calbiochem, San Diego, CA
Syto-16 Molecular Probes, Leiden,
Netherlands TritonX 100 Merck, Darmstadt
Trypanblau Färbelösung Sigma, Deisenhofen Tween -20 Sigma, Deisenhofen
2.6 Software
CellQuest (Cytometrie) Becton, Dickinson, Heidelberg
Magellan (ELISA) Tecan, Crailsheim
Microsoft Excel 8.0 Microsoft Corporation, USA Microsoft Internet Explorer
Microsoft Power Point Microsoft Word
2.7 Statistik
Die Daten werden gezeigt als Mittelwert +/- Standardabweichung (SD) (Microsoft Excel 8.0 software) und repräsentieren n verschiedene und unabhängig voneinander durchgeführte Experimente.
III. Methoden
3.1 Isolation und Kultivierung von humanen polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN)
Die PMN wurden frisch isoliert und kultiviert in Komplettmedium. Dieses besteht aus RPMI 1640 Medium, welches vorher versetzt wurde mit 10mM Hepes Puffer, 2mM L- Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 5% (v/v) hitzeinaktivierten FCS.
Buffy coat aus der Blutbank-1:6 mit PBS verdünnt – oder heparinisiertes Vollblut von gesunden Probanden gespendet, wurde auf einen Histopaque-Gradienten geschichtet, bestehend aus Histopaque 1077 (oben) und Histopaque 1119 (unten) und anschließend für 5 Minuten bei 300 x g, gefolgt von 15 Minuten 800 x g ohne Bremse bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Interphase zwischen dem Blut und Histopaque 1077 enthält dabei vor allem Mononukleare Zellen. Sie wurde mit einer Transferpipette abgenommen und verworfen. Die PMN-reiche Interphase zwischen Histopaque 1071 und Histopaque 1119 wurde gesammelt und zweimal in Komplettmedium gewaschen. Danach wurden die Zellen weiter fraktioniert indem sie auf einen Percollgradienten gegeben wurden. Die Schichten des Percollgradienten bestanden aus unterschiedlichen Anteilen der Stammlösung: Percoll- Trennlösung 10:1 verdünnt mit 10xPBS. Die 5 unterschiedlichen Schichten hatten dabei im einzelnen folgende Dichten: 1,105 g/ml (85%), 1,100 g/ml (80%), 1,093 g/ml (75%), 1,087 g/ml (70%) und 1,081 g/ml (65%). Nach einer Zentrifugation für 25 Minuten bei 800 x g ohne Bremse, wurde die Interphase zwischen der 80%igen und der 85%igen Percollschicht gesammelt und zweimal in Kompletmedium gewaschen. Die gesamte Isolation erfolgte bei Raumtemperatur (24°C). Der Reinheitsgrad der isolierten Granulozyten (>99%) wurde mikroskopisch durch Giemsa-Präparate kontrolliert. Für Experimente wurden nur Zellen einer Vitalität von über 99% verwendet. Ihre Lebendigkeit wurde durch eine Färbung mit Trypanblau kontrolliert.
Hierfür werden zu 1 x 105 PMN gelöst in 150µl Komplettmedium 100µl Trypanblau, einem Farbstoff für DNA, gegeben. Nach 3 Minuten werden die angefärbten Zellen (10µl der Suspension) in eine Zählkammer gegeben und ausgezählt. Zellen mit nicht intakter Zellmembran färben sich hierbei blau.
3.2 Kultivierung und Aufbereitung von Streptococcus pneumoniae
Als apoptoseinduzierender extrazellulärer Erreger diente Streptococcus pneumoniae (wildtype) (atcc:6303). Der Pneumolysin-defiziente Pneumokokkenmutant plnA- wurde uns freundlicherweise von der Forschungsgruppe von Dr. Briles, University of Alabama, Birmingham, U.S.A. zur Verfügung gestellt (Berry et al. 1989). Der H2O2-defiziente Pneumokokkenmutant spxB- wurde uns von der Forschungsgruppe von Dr. Spellerberg, Laboratory of infectious deseases, The Rockefeller University, New York.U.S.A.
überlassen (Spellerberg et al. 1996).
Die Pneumokokken wurden auf Blutagarplatten gezüchtet, zu welchen für die Kultivierung der Mutanten 0,3 µg/ml Erythromycin zugesetzt wurde (Colino et al. 2003).
Zur Herstellung der gewünschten Pneumokokkenkonzentration wurden diese über 2 Tage auf frisch angeimpften Blutagarplatten im Brutschrank bei 37°C angezüchtet und anschließend mit einer Plastiköse abgenommen und in Pneumokokkenmedium gelöst.
Pneumokokkenmedium besteht aus: RPMI 1640 Medium, welches vorher versetzt wurde mit 10mM Hepes Puffer, 2mM L-Glutamin und 5% (v/v) hitzeinaktivierten FCS.
Mit dem Densimaten konnte die Bakteriendichte gemessen werden (Einheit: MacFarland = MF). Ein MF von 7 entspricht hierbei einer Konzentration von etwa 21 x 108 Pneumokokken pro ml Medium (Araujo et al. 2004).
Zum Abtöten von Pneumokokken wurden diese für 10 Minuten bei 100°C im Wasserbad gekocht.
3.3 PMN: Apoptoseinduktion
Es wurden verschiedene Arten der Apoptoseinduktion untersucht:
1. Bestrahlung mit UV-Licht: 2ml von 10 x 106 frisch isolierten PMN werden in eine Petrischale gegeben, so dass sie grade den Boden der Schale bedeckten und mit 5000mJ/m2 UV-Licht bestrahlt. Das UV-Licht führt zu einer DNA-Schädigung der Zelle, welche daraufhin ihr Apoptoseprogramm aktiviert (Lauber et al. 2003, Lo et al. 2005)
2. Zugabe von 10µl 1µM Staurosporin, einem Induktor des Apoptoseprogramms (Bahlis et al., 2005) zu 500µl 10 x 106 frisch isolierten PMN.
3. Spontanapoptose: Zur Beobachtung der Spontanapoptose wurden die PMN bis zum jeweiligen Zeitpunkt (s.u.) in dem Brutschrank bei 37°C aufbewahrt.
4. Koinkubation mit Streptococcus pneumoniae (s.u.)
3.4 PMN/Streptococcus pneumoniae- Koinkubation
1 x 107 PMN wurden mit Streptococcus pneumoniae bei 37°C in Pneumokokkenmedium für mindestens 2 Minuten koinkubiert und dann die beschriebenen Experimente durchgeführt. Streptococcus pneumoniae wurde dabei in einem Verhältnis von 100:1 zu den frisch isolierten PMN gegeben.
Überstände und Zellen wurden nach 0,5 h, 1h, 1,5 h, 2 h, 4h, 6h, 18h und 42h gesammelt.
3.5 Giemsa-Färbung
Die Giemsa-Färbung ist eine kernmorphologische Färbung, mit welcher anhand von bestimmten Kriterien, wie die des kondensierten Kerns, die Apoptoserate von PMN beurteilt werden kann. Für die morphologische Charakterisierung wurden 1 x 105 PMN in 100 µl PBS mittels Zentrifugation, 112 x g für 5 Minuten, auf Objektträger gebracht und luftgetrocknet. Die Zellen wurden in Methanol für 5 Minuten fixiert, gefolgt von einer 30- minütigen Färbung in Giemsa-Lösung (1:20) in H2Obidest. Anschließend wurden die Objektträger mit Wasser gespült, luftgetrocknet und lichtmikroskopisch die Apoptoserate beurteilt.
3.6 Live-Dead-Färbung
5 x 105 Neutrophile Granulozyten wurden koinkubiert mit Streptococcus pneumoniae und kultiviert wie oben beschrieben. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Zellen angefärbt mit einer Mischung aus SYTO-16 (Molecular Probes, Leiden, Niederlande) und Ethidiumbromid. Die Färbung mit 5µmol SYTO-16 für 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur wurde genutzt um Pneumokokken und PMN sichtbar zu machen und lebende von toten zu unterscheiden. Dieser Farbstoff penetriert Zellmembranen und färbt DNA. Dabei ist es so, dass die Nuklei von Zellen/Bakterien mit intakter Zellmembran grün erscheinen. Im Anschluss an die Färbung mit SYTO-16 wurden die Zellen mit 5µmol Ethidiumbromid gefärbt, um so die PMN und Pneumokokken mit nicht intakter Zellmembran zu markieren, welche sich rot darstellten (van Zandbergen et al. 2004).
3.7 Markierung mit Annexin-V / Propidiumiodid
Das Protein Annexin-V zeigt eine calciumabhängige Bindung an Phosphatidylserin, welches auf der äußeren Membran von apoptotischen PMN exprimiert wird (Homburg et al. 1995). Das Labeln der apoptotischen Zellen (5 x 105 PMN) mit Annexin V-FITC und das Anfärben mit Propidiumiodid (PI) für nekrotische Zellen (beide von Roche, Mannheim, Deutschland) wurden durchgeführt wie vom Hersteller empfohlen. Das Propidiumiodid färbt die DNA rot wenn die Zellmembran nicht mehr intakt ist, was wiederum ein Merkmal für Nekrose ist. Die gelabelten PMN wurden mit dem Durchflusszytometer analysiert. Dabei wurde ein FACSCalibur mit CellQuest software (BD Biosciences, San Diego, CA) verwendet (van Zandbergen et al. 2004).
3.8 IL-8-ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay)
Überstände von PMN, welche coinkubiert oder nicht coinkubiert wurden mit Streptococcus pneumoniae, wurden bis zur Durchführung des ELISAs bei -20°C aufbewahrt. Die Menge an enthaltenen IL-8 wurde gemessen unter Verwendung eines IL-8 ELISAs (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland) und gemäß Herstellerinstruktionen mit leichten Modifikationen durchgeführt. Diese sind kurzgefasst: Verwendung von 150µl statt 300µl/well der Blocking-Solution (Herstellung dieser und der übrigen verwendeten Lösungen gemäss Herstellerinstruktionen) und anschließende Inkubation für 30 Minuten statt 2h bei Raumtemperatur. Außerdem wurde für das Coating Coating-Puffer B verwendet. Die Platte wurde bei 450 nm im ELISA-reader (Tecan) eingelesen.
3.9 Chemotaxisassay
Zur Durchführung des Chemotaxisassays werden hochreine PMN benutzt. Als Positivkontrolle für die PMN-Rekrutierung werden die PMN spezifischen chemotaktischen Faktoren IL-8 (5 ng/ml) und fMLP (0,1 µM) verwendet. Ein Volumen von je 600 µl der Proben (Überstände von PMN, Pneumokokken und PMN, welche mit Pneumokokken inkubiert wurden) werden in die untere Kammer einer 24-well Transwell-Platte gegeben.
6x106 frisch isolierte PMN wurden in 100µl Komplettmedium gegeben und in die obere Kammer gefüllt. Ein Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 3 µm teilte die 2 Kammern voneinander. Die Kammern wurden anschließend für 90 Minuten bei 37°C in
einer Atmosphäre, die 5% CO2 beinhaltete, inkubiert. Es erfolgte eine mikroskopische Beurteilung der Menge und Morphologie der PMN, welche durch die Membran gewandert waren (van Zandbergen et al. 2002). Die Anzahl der PMN, die in die untere Kammer gewandert waren, wurde zusätzlich durch einen Glucuronidaseassay festgestellt.
Modifiziert wurde dieser Chemotaxisassay durch Blockierung von bekannten Chemokinrezeptoren auf der Oberfläche der PMN: IL-8-Rezeptoren. Außerdem wurden Experimente mit Blockierung der fMLP-Rezeptoren durchgeführt. Durch diese Blockierung wird eine Chemotaxis der PMN auf IL-8 bzw. fMLP ausgeschaltet.
Um IL-8 als Chemoattractans auszuschalten, wurde der IL-8-Rezeptor blockiert durch Präinkubation der frisch isolierten PMN für 5 Minuten mit 50 ng/ml IL-8.
Analog zu der Blockierung des IL-8-Rezeptors wurde der fMLP-Rezeptor der neutrophilen Granulozyten inhibiert indem 1µM/ml fMLP zu den frisch isolierten PMN für 5 Minuten gegeben wurde.
3.10 Glucuronidaseassay
Für eine quantitative Beurteilung der Chemotaxis der PMN wurde ein Glucuronidaseassay durchgeführt. Hierbei wurden die PMN, welche in die untere Kammer gewandert waren durch 0,1%iges Triton X-100 lysiert und die enzymatische Aktivität der Glucuronidase gemessen mit p-Nitrophenyl-ß-glucuronid als Substrat. Die Glucuronidase reagiert dabei mit p-Nitrophenyl-ß-glucuronid. Die daraus entstehende gelbliche Farbe wurde mittels des ELISA-Readers bei 405nm bezüglich ihrer optischen Dichte quantifiziert. Die Anzahl der durchgewanderten Zellen wurde berechnet anhand einer Standardkurve, welche aus Werten von Lysaten mit einer definierten Zellzahl an PMN erstellt wurde (van Zandbergen et al. 2002).
Der Chemotaktische Index (CI) wurde errechnet aus dem Quotienten, gebildet durch die Anzahl der durchgewanderten Zellen auf einen Stimulus hin und im Nenner der Anzahl der Zellen, die auf das Medium (die Negativkontrolle) zugewandert waren. Für Komplettmedium als Kontrollwert ergibt sich somit ein chemotaktischer Index von 1.
Von einem chemotaktischen Effekt lässt sich entsprechend erst ab einen chemotaktischen Index über 1 sprechen (van Zandbergen et al. 2004).
3.11 Lipidisolierung
Die in den Proben enthaltenen Lipide wurden mit Hilfe von Diethylether extrahiert, geringfügig modifiziert nach der Methode von Bligh und Dyer (1959). Die im Diethylether gelöste Lipidfraktion wurde im Scheidetrichter von dem Rest der Probe (ab hier als Proteinfraktion bezeichnet) getrennt und mit PBS, auf einen pH-Wert von 8 eingestellt, gewaschen und wiederum im Scheidetrichter voneinander separiert. Somit erhielt man am Ende zweierlei Proben: eine „Proteinfraktion“ (bestehend aus diversen Molekülen wie Proteinen, aber auch Zucker) und eine gewaschene Lipidphase, gelöst in Diethlether.
Das Diethylether wurde mit Argongas weggedampft und der Lipidextrakt anschließend in 1 ml Komplettmedium wieder aufgenommen.
IV. Ergebnisse
4.1 Spontanapoptose der PMN
Wir untersuchten das Apoptoseverhalten von neutrophilen Granulozyten um eine Beeinflussung desselbigen durch Streptococcus pneumoniae beurteilen zu können. Hierfür wurden neutrophile Granulozyten frisch isoliert und anschließend bei 37°C belassen um zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Apoptoserate zu kontrollieren.
A) B)
Abb. 1:Spontanapoptose bei neutrophilen Granulozyten. Kernmorphologie gefärbt mit Giemsa bei humanen PMN, 0h (Bild A) oder 18h (Bild B) nach Inkubation in Komplettmedium. Die Bilder sind repräsentativ für 5 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente.
Die Abbildung 1A) zeigt einen frisch isolierten neutrophilen Granulozyten zum Zeitpunkt 0, der eine intakte, nicht apoptotische Kernmorphologie aufweist (siehe Pfeil). Im Gegensatz dazu ist in der Abbildung 1B) eine Population von 18h alten PMN zu erkennen, welche kondensierte, geschrumpfte Zellkerne aufweisen (siehe Pfeil), deren multilobuläre Struktur aufgehoben ist. Diese PMN können somit anhand ihrer Kernmorphologie als apoptotisch deklariert werden.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 2 4 6 18 42
Zeit (h)
Apoptoserate(%)
Abbildung 2: Spontanapoptose: Der Prozentsatz apoptotischer PMN von unterschiedlichen
Zeitpunkten (0h, 0,5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 18h, 42h) wurde analysiert mittels mikroskopischer Evaluierung von >200 Zellen auf Cytospingläsern, gefärbt mit Giemsa. Die Daten repräsentieren den Mittelwert +/- Standardabweichung (SD) für 16 unabhängige Experimente.
Den Verlauf der Spontanapoptoserate zeigt die Abbildung 2. Es wurde der Prozentsatz an Zellen mit kondensierten Zellkernen, also apoptotischen Zellen, ausgezählt und anhand dessen eine Kurve der Apoptoseraten erstellt. Dabei zeigte sich zum Zeitpunkt 0 eine Spontanapoptoserate von 1% (+/-1% SD), nach einer halben Stunde 0,3% (+/- 0,4%), nach einer Stunde eine Apoptoserate von 4% (+/-3%) und nach 2h eine Apoptoserate von 5%
(+/- 3% SD). Nach 4h lag die Spontanapoptoserate bei 6% (+/-4%), nach 6h bei 18% (+/- 10%). Zum 18h-Zeitpunkt war die Rate der Spontanapoptose auf 54% (+/- 12% SD) angestiegen. Nach 42h waren fast alle PMN (99%) spontan in die Apoptose gegangen.
4.2 Induzierte Apoptose der PMN
Neben der Spontanapoptose wurde gezielt Apoptose bei den PMN induziert:
1. Durch Behandlung mit 1µM Staurosporin. Staurosporin ist eine Substanz, die in neutrophilen Granulozyten das Apoptoseprogramm aktiviert (Bahlis et al. 2005).
2. Durch Bestrahlung mit UV-Licht- hierbei wurde in diversen Versuchen 5000mJ/m2 als optimale Bestrahlungsintensität ermittelt. UV-Licht führt zu einer Schädigung der DNA und somit zur Induktion des Apoptoseprogramms der Zelle (Lauber et al.
2003, Lo et al. 2005).
3. Durch Infektion mit Streptococcus pneumoniae.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 4 18 42
Zeit (h)
Apoptoserate(%)
Abbildung 3: Apoptoseinduktion durch UV-Licht (Quadrate, durchgezogene Linie) oder Staurosporin (Dreiecke, gestrichelte Linie) bei frisch isolierten PMN: Der Prozentsatz apoptotischer PMN von unterschiedlichen Zeitpunkten (0h, 0,5h, 1h, 2h, 18h, 42h) wurde analysiert mittels mikroskopischer Evaluierung von >200 Zellen auf Cytospingläsern, gefärbt mit Giemsa. Die Daten repräsentieren den Mittelwert +/- Standardabweichung (SD) für 5 unabhängige Experimente.
Insgesamt zeigte sich, dass sowohl eine Behandlung der PMN mit Staurosporin als auch eine Bestrahlung mit UV-Licht zu einer eindeutigen Erhöhung der Apoptoserate sowohl der früheren Zeitpunkte als auch der späteren Zeitpunkte führte im Vergleich zu der Höhe der Spontanapoptoserate (siehe Abbildung 3).
Die Apoptoserate des 2h-Zeitpunktes lag sowohl bei der Behandlung der PMN mit Staurosporin als auch bei Bestrahlung der PMN mit UV-Licht bei jeweils 30% (+/-3% SD) bei Behandlung mit Staurosporin bzw. 29% (+/-3% SD) bei Bestrahlung der PMN mit UV- Licht (demnach jeweils 6fach erhöht im Vergleich zur Spontanapoptoserate der PMN nach 2h). Nach 18h zeigte sich bei beiden Verfahren eine Erhöhung auf jeweils 92% (+/-3%
SD) (Spontanapoptoserate der PMN nach 18h liegt bei 54%). Nach 42h waren über 99%
der PMN in die Apoptose gegangen.
4.3 Apoptoseinduktion bei PMN durch Infektion bzw. Koinkubation mit Streptococcus pneumoniae
Wie wirken aber Erreger auf die Apoptose der PMN? Wir suchten hierfür das Modell eines apoptose-induzierenden Erregers und entschieden uns nach diversen Testreihen für den extrazellulären Erreger der Meningitis und Pneumonie: Streptococcus pneumoniae Wildtyp (Pc w). Ob und wie dieser das Apoptoseverhalten von neutrophilen Granulozyten beeinflusst, ist bisher noch nicht untersucht.
Gleichzeitig untersuchten wir dabei, ob und was es für einen Unterschied gibt von apoptotisch gewordenen PMN, die mit lebenden Pc w infiziert wurden und solchen, die mit abgekochten (100°C-Wasserbad für 15 Minuten), also toten Pc w koinkubiert wurden.
A) B)
Abbildung 4: Neutrophiler Granulozyt, koinkubiert mit lebenden Streptococcus pneumoniae Erregern (Wildtyp). Die lebenden Pneumokokken lagern sich außen an die Membran der PMN (siehe Pfeil) (Bild A).
Neutrophiler Granulozyt koinkubiert mit abgetöteten Streptococcus pneumoniae Erregern (Wildtyp).
Die toten Pneumokokken befinden sich im Cytoplasma des neutrophilen Granulozyten (siehe Pfeile) (Bild B).
Giemsafärbung. Repräsentativ für 5 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente.
Die mikroskopische Auswertung der Giemsa-Präparate zeigte, dass PMN welche mit lebenden Pc w infiziert wurden zum 2h-Zeitpunkt, eine Auflagerung der Pneumokokken auf ihrer äußeren Zellmembran zeigten (siehe Pfeil, Abbildung 4, Bild A). Nur ein sehr geringer Teil der Pc w ließ sich im Zellinneren erkennen.
Wurden hingegen die PMN mit abgekochten, also toten, Pc w koinkubiert, wurden praktisch 100% der Pneumokokken in das Zellinnere der Neutrophilen aufgenommen (siehe Pfeile) (Abbildung 4, Bild B).
Ähnliches zeigte die Live-Dead-Färbung (Ergebnisse nicht abgebildet): wurden lebende Pc w zu frisch isolierten PMN gegeben, zeigte sich nach 2h eine Auflagerung der grünen (also lebendigen) Pc w auf grün gefärbten (nicht apoptotischen) PMN. Nach 18h waren ca. 85%
der PMN grün und 15% rot (also nekrotisch, bzw. nicht klar differnzierbar ob apoptotisch oder nekrotisch).
Bei den PMN die mit den toten Pc w inkubiert worden waren, bot sich zum 2h- Zeitpunkt dagegen das Bild, dass der Hauptteil der Pc w (rot) von nicht apoptotischen PMN (grün) aufgenommen worden waren. Nach 18h färbten sich etwa 70% der PMN grün und 30%
rot.
Die Auswertung der Giemsa-Präparate ergab, dass im Vergleich zu der Rate der Spontanapoptose sowohl die Apoptoserate der PMN, welche mit lebenden Pc w infiziert
worden waren, als auch die der PMN, welche mit abgekochten Pc w koinkubiert worden waren, höher lagen. Dieses ließ sich sowohl für frühe Zeitpunkte als auch zumindest bedingt für späte Zeitpunkte zeigen. Des Weiteren ließ sich zeigen, dass die PMN, welche mit lebenden Pc w infiziert wurden, früher und ausgeprägter in Apoptose gingen als die PMN, welche mit toten (abgekochten) Pc w koinkubiert worden waren (siehe Abbildung 5).
Die Apoptoserate der behandelten PMN war im Vergleich zur Spontanapoptoserate zu allen bestimmten Zeitpunkten höher oder gleich hoch.
18
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Zeit (h)
Apoptoserate(%)
0 1 2 4 6 42
Abbildung 5: Spontanapoptoserate von PMN (Dreiecke, durchgezogene Linie) verglichen mit der Apoptoserate von PMN, welch mit lebenden Pc w (dunkle Quadrate, durchgezogene Linie) infizierten wurden oder mit toten Pc w (helle Quadrate, gestrichelte Linie) koinkubiert. Das Verhältnis der Pneumokokken zu den PMN betrug dabei jeweils 100:1. Auswertung durch Giemsapräparate - der Anteil der apoptotischen PMN ist in Prozent angegeben. Es wurden verschiedene Zeitpunkte untersucht: 0h, 30 Minuten, 1h, 2h, 4h, 6h, 18h, 42h. n=12 +/- Standardabweichung
Beispielhaft soll hier als früher Zeitpunkt der Apoptose der 4h-Zeitpunkt hervorgehoben werden, welcher für die mit lebenden Pc w infizierten PMN eine Apoptoserate von 28%
(+/-5% SD) ergab. Also eine fast 5fach erhöhte Apoptoserate im Vergleich zu der, der
Spontanapoptose (6% +/-4% SD). Für die mit toten Pc w infizierten PMN zeigte sich nach 4h eine Apoptoserate von 13% (+/-5% SD). Diese ist demnach mehr als doppelt so hoch wie die Spontanapoptoserate.
Beispielhaft für einen späten Zeitpunkt lässt sich über den 18h-Zeitpunkt berichten, dass auch hier die Apoptoserate der infizierten bzw. mit toten Pc w koinkubierten PMN höher war als die Spontanapoptoserate. Für die mit lebenden Pc w infizierten PMN ließ sich dabei eine Apoptoserate von 92% (+/-4% SD) ermitteln, für die PMN, welche mit toten Pc w infiziert worden waren, ergab sich ein Wert von 62% (+/-6%). Vergleichswert für die Spontanapoptoserate zum 18h-Zeitpunkt ist 54% (+/-13%). Die Einzelwerte lassen sich der Abbildung 5 entnehmen.
Wir entschieden uns in den Folgeexperimenten den 18h-Zeitpunkt weiter zu verfolgen, weil wir hier die höchste Apoptoserate fanden.
4.4 Ermittelung der Apoptoserate von PMN infiziert bzw. koinkubiert mit Pc w durch FASC-Analyse
Durch die Durchführung einer FACS-Analyse sollte geklärt werden, ob die PMN tatsächlich apoptotisch werden oder eventuell doch primär nekrotisch.
Die FACS-Färbung wurde mit AnnexinV-Fluos (ANV) und Propidiumiodid (PI) durchgeführt.
Die Abbildung 6 zeigt die FACS-Färbung von 4h-alten PMN.
Quad %Total XGeoMean YGeo Mean UL 2,35 4,58 79,67
UR 2,53 559,85 31,85 LL 80,97 3,70 3,28 LR 14,15 253,41 3,84
Abbildung 6: Punktdiagramm (dot plot) als Ergebnis einer FACS-Färbung mit AnnexinV-Fluos (x- Achse) und Propidiumiodid (y-Achse) von 4h-alten neutrophilen Granulozyten; die Tabelle gibt den totalen Prozentsatz (%Total), den geometrischen Mittelwert für x- bzw. y-Achse (XGeo Mean, bzw. Y Geo Mean) der Punkteverteilung in den jeweiligen Quadranten an (linker oberer Quadrant = UL, rechter oberer = UR, linker unterer = LL, rechter unterer = LR); repräsentative Abbildung für 10 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente
Als apoptotische Population (also ANV positiv, PI negativ) werden Zellen im rechten unteren (LR) Quadrant deklariert; als nekrotisch (also PI positiv, ANV negativ) werden Zellen im oberen linken (UL) und als apoptotisch nekrotische Zellen (das heißt: ANV positiv und PI Positiv) gelten diejenigen im oberen rechten (UR) Quadranten. Der linke untere Quadrant (LL) bildet die lebendigen Zellen ab. Jeder Punkt des dot plots entspricht der spezifischen gemessenen Fluoreszenz einer Zelle (Janeway et al.2001).
Die FACS-Färbung von nicht infizierten 4h-alten PMN zeigte hier dementsprechend eine Apoptoserate von 14%, die Nekroserate lag bei 2%. Apoptotisch nekrotisch waren 2,5%
der PMN. Der Hauptteil (80%) war lebendig und lag somit im linken unteren Quadranten (siehe Abbildung 6).
Quad %Total XGeoMean YGeo Mean UL 24,05 8,69 50,10
UR 69,50 47,33 153,62 LL 5,95 2,87 6,42 LR 0,50 29,67 9,19
Abbildung 7: Punktdiagramm (dot plot) als Ergebnis einer FACS-Färbung mit AnnexinV-Fluos (x- Achse) und Propidiumiodid (y-Achse) von 4h-alten neutrophilen Granulozyten, die mit frischen Erregern vom Streptococcus pneumoniae Wildtyp (Verhältnis Pc w zu PMN betrug dabei 100:1) infiziert wurden; repräsentative Abbildung für 10 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente
Der 4h-Zeitpunkt von PMN, welche mit dem Pneumokokken-Wildtyp infiziert worden waren, zeigte in der FACS-Analyse eine Verschiebung der PMN in den linken und vor allem den rechten oberen Quadranten (siehe Abbildung 7).
Die Nekroserate war hier entsprechend höher (24%), die Rate der apoptotisch nekrotischen PMN mit 69% ebenfalls. Die Apoptoserate betrug hier 0,5%.
Quad %Total XGeoMean YGeo Mean UL 2,67 6,29 63,16
UR 17,55 776,59 58,44 LL 35,13 4,17 3,57 LR 44,65 229,79 3,55
Abbildung 8: Punktdiagramm (dot plot) als Ergebnis einer FACS-Färbung mit AnnexinV-Fluos (x- Achse) und Propidiumiodid (y-Achse) von 18h-alten neutrophilen Granulozyten; die Tabelle gibt den totalen Prozentsatz (%Total), den geometrischen Mittelwert für x- bzw. y-Achse (XGeo Mean, bzw. Y Geo Mean) der Punkteverteilung in den jeweiligen Quadranten an (linker oberer Quadrant = UL, rechter oberer = UR, linker unterer = LL, rechter unterer = LR); repräsentative Abbildung für 10 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente
Die FACS-Färbung der nicht infizierten 18h-alten PMN (siehe Abbildung 8) zeigte eine Apoptoserate von 44%. Die nekrotische Population liegt bei 2,6%. Der Prozentsatz der apoptotisch nekrotischen PMN liegt bei 17,5%.
Quad %Total XGeoMean YGeo Mean
UL 2,35 10,88 29,57 UR 91,02 245,25 100,55
LL 2,32 3,86 3,67 LR 4,32 212,94 5,47
Abbildung 9: Punktdiagramm (dot plot) als Ergebnis einer FACS-Färbung mit AnnexinV-Fluos (x- Achse) und Propidiumiodid (y-Achse) von 18h-alten neutrophilen Granulozyten, die mit frischen Erregern vom Streptococcus pneumoniae Wildtyp (Verhältnis Pc w zu PMN betrug dabei 100:1) infiziert wurden; repräsentative Abbildung für 10 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente
Die Abbildung 9 zeigt die FACS-Färbung von 18h-alten PMN, die mit dem Wildtyp von Streptococcus pneumoniae infiziert wurden. Hier zeigt sich im Vergleich zur Abbildung 8 insgesamt eine Verschiebung der Zellen in den rechten oberen Quadranten.
Der Anteil der apoptotischen PMN betrug hier 4,3%, der der nekrotischen PMN 2,3%. Der Anteil der apoptotisch nekrotischen PMN lag bei 91%.
Insgesamt konnte man anhand der FACS-Analyse beobachten, dass PMN, wenn sie mit dem Streptococcus pneumoniae-Wildtyp infiziert worden waren, eine Verschiebung in den ANV- und PI-positiven Bereich zeigten. Dieses Phänomen zeigte sich sowohl für frühere (z.B. 4h) als auch für spätere (18h) Zeitpunkte.
4.5 Apoptoseinduktion bei PMN durch Infektion mit Streptococcus pneumoniae- Mutanten
Nach neuen Forschungsergebnissen wird für Streptococcus pneumoniae eine neue und alternative, kaspase-unabhängige Form der Apoptoseinduktion für dendritische Zellen und Gliazellen beschrieben (Colino et al. 2003; Braun et al. 2002).- Für PMN ist bisher noch nichts dergleichen bekannt. Gibt es diese also auch für die Neutrophilen?
Verantwortlich für diese alternative Apoptoseinduktion werden dabei H2O2 und Pneumolysin gemacht. Diese beiden Stoffe aktivieren den sogenannten Apoptosis- inducing-factor (AIF), welcher das Apoptoseprogramm der Zelle einschaltet ohne dabei Kaspasen zu aktivieren. Es wird hypothetisiert, dass dieser kaspase-unabhängige Weg zeitlich schneller ablaufen könnte, also zu einer früheren Apoptose führt.
Unsere Ergebnisse zeigten, dass PMN, welche mit dem Streptococcus pneumoniae Wildtyp infiziert worden waren, tatsächlich früher apoptotisch wurden, verglichen mit der Spontanapoptoserate von PMN. Daher wollten wir diesen offenbar anderen Weg der Apoptoseinduktion genauer untersuchen. Hierfür arbeiteten wir mit Mutanten von Streptococcus pneumoniae: spxB-, einem H2O2-defizienten Mutanten, welcher uns freundlicherweise von der Forschungsgruppe von Dr. Mann, Memphis, Lauderdale überlassen wurde und mit plnA-, einem Pneumolysin-defizienten Mutanten, welchen wir von der Forschungsgruppe Dr. Briles, Birmingham erhielten.
Bei der Bestimmung der Apoptoserate mittels Giemsa-Färbung wurden frühe Zeitpunkte mit berücksichtigt, um so den Zeitpunkt einer eventuell früher als zuvor beobachteten induzierten Apoptose beobachten zu können (Abbildung 10).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
PM N 4h
+Pc w PM
N 4h +spXB
PM N 4h
+plnA 4h+
medium PM
N 18h+
Pc w
PMN 18h+
spX B
PMN 18h+
plnA 18h
+m edium
Apoptoserate (%)
Abbildung 10: Auszählung der Apoptoserate (in %) von mit Pc-Mutanten infizierten PMN in Giemsapräparaten. Es wurden mehrere Zeitpunkte untersucht. Hier dargestellt sind die 4h- Zeitpunkte (linke vier Figuren, grau) für eine Infektion mit dem Pneumokokken Wildtyp (Pc w), dem H2O2-defizienten Pneumokokkenmutanten spxB-, dem Pneumolysin-defizienten Pneumokokken- mutanten plnA- und PMN in Komplettmedium (aufgelistet von links nach rechts;Verhältnis Erreger zu PMN betrug dabei jeweils 100:1). Die rechten vier Figuren zeigen die entsprechenden 18h- Zeitpunkte; n=4+/- Standardabweichung.
Die Ergebnisse zeigten eine Erhöhung der Apoptoserate zum 4h-Zeitpunkt für alle PMN, welche mit Pneumokokken infiziert wurden (die Spontanapoptoserate der PMN liegt bei 8% +/5% SD zum 4h-Zeitpunkt). Dabei fällt auf, dass die Apoptoserate der PMN, die mit dem Pneumokokkenwildtyp infiziert wurden mit 24% (+/- 9% SD) am höchsten ist (liegt beim bis zu dreifachen der Spontanapoptoserate), gefolgt von der Apoptoserate der PMN, die mit dem H2O2-defizienten Mutanten spxB- infiziert wurden mit einer Apoptoserate von 16% (+/- 5% SD). Die niedrigste Apoptoserate zum 4h-Zeitpunkt hier, zeigten die PMN, welche mit dem Pneumolysin-defizienten Mutanten plnA- infiziert wurden. Ihre Apoptoserate liegt mit 6% (+/-1% SD) knapp unter der Spontanapoptoserate. Von einem
verfrühten Zeitpunkt der Apoptoseinduktion kann für plnA- daher kaum gesprochen werden.
Die 18h-Zeitpunkte zeigten, dass auch hier die PMN, welche mit dem Pneumokokken- Wildtyp infiziert worden waren, die höchste Apoptoserate mit 80% (+/-15% SD) zeigten.
Dicht gefolgt von den PMN, die mit spxB- infiziert worden waren mit 70% (+/-10%), knapp dahinter die PMN, welche mit plnA- infiziert worden waren mit ca. 57% (+/-29%
SD).
Der Trend des 4h-Zeitpunktes blieb somit: am stärksten apoptoseinduzierend wirkte der Pneumokokken-Wildtyp, gefolgt vom Mutanten spxB-. Allerdings zeigten die 18h- Zeitpunkte im Gegensatz zu den frühen 4h-Zeitpunkten einen wesentlich geringeren Unterschied untereinander bezüglich ihrer Apoptoserate.
Auch die FACS-Analyse des Apoptoseverhaltens der PMN, die mit dem Wildtyp, bzw. mit den Mutanten infiziert wurden, bestätigen diese Ergebnisse (hier nicht abgebildet).
4.6 Hemmung der apoptoseinduzierenden Faktoren Pneumolysin und H2O2
Nun wollten wir kontrollieren, ob tatsächlich die Induktion der Apoptose vom Vorhandensein des Pneumolysins bzw. des H2O2 abhängt.
Es ist bekannt, dass sich das Pneumolysin durch SB (p38 MAP Kinaseinhibitor) hemmen lässt.
Die Aktivität von H2O2 lässt sich durch N-Acetyl-Cystein (NAC) oder Katalase sehr stark einschränken bzw. aufheben.
Bei NAC entdeckten wir als Nebeneffekt, dass es bereits allein in der Lage ist die Apoptose bei PMN zu induzieren. Daher konnten Versuche von mit NAC präinkubierten plnA- nicht beurteilt werden.
Der alleinige Effekt von SB erbrachte die gleiche Apoptoserate wie für die PMN, die spontan in Apoptose gegangen waren.
Wir beobachteten also die Apoptoserate von 18h-alten PMN, die mit Pc w infiziert worden waren und dann mit SB 1µM/ml für 5 Minuten präinkubiert wurden und verglichen sie mit der Apoptoserate von PMN, welche mit spxB- infiziert worden waren, welche ebenfalls mit SB 1µM/ml für 5 Minuten präinkubiert wurden (Abbildung 11).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
4h+
medium PM
N 4h+Pc w
PMN 4 h+Pcw
+SB
PMN 4h+spXB
PM
N 4h+spxB+SB
18h +m
edium PM
N 18 h+P
cw
PMN 18h+Pcw+SB PMN 1
8h+spXB
PMN 18h+s
pxB+SB
Apoptoserate (%)
Abbildung 11: Vergleich der Apoptoserate in % (Auszählung von Giemsapräparaten) von 4h- und 18h-Zeitpunkten: dabei werden PMN, welche mit dem Pneumokokken-Wildtyp und solche, die mit dem Pneumokokkenmutanten spxB- infiziert wurden verglichen (Pcw: dunkle Säulen, spxB-: helle Säulen;Verhältnis Erreger zu PMN betrug dabei jeweils 100:1) mit der Spontanapoptoserate (weiß) und es wird verglichen, was für einen Effekt die Präinkubation von SB (=p38 MAP Kinaseinhibitor) 1µM/ml auf die Apoptoserate hat (jeweils die rechte der paarweise angeordneten Säulen); n=3 +/- Standardabweichung.
Es zeigte sich, dass zum frühen 4h-Zeitpunkt die Apoptoserate der PMN, die mit Pc w infiziert worden waren im Gegensatz zu den mit Pc w infizierten PMN, welche anschließend mit SB präinkubiert wurden, kaum unterschied (lagen bei 34% (+/-5% SD) bzw. bei 32% (+/-4% SD).
Beim 4h-Zeitpunkt der PMN allerdings, welche mit spxB- infiziert worden waren, bestand ein deutlicher Unterschied der Apoptoserate zwischen den PMN, welche lediglich mit spxB- infiziert worden waren und denen, welche zusätzlich mit SB präinkubiert wurden:
wurden die H2O2-defizienten Pneumokokkenmutanten spxB- mit SB vorinkubiert, sank ihre Apoptoserate auf 9% (+/-2% SD) ab. Im Gegensatz dazu lag die Apoptoserate der