III. Methoden
3.11 Lipidisolierung
Die in den Proben enthaltenen Lipide wurden mit Hilfe von Diethylether extrahiert, geringfügig modifiziert nach der Methode von Bligh und Dyer (1959). Die im Diethylether gelöste Lipidfraktion wurde im Scheidetrichter von dem Rest der Probe (ab hier als Proteinfraktion bezeichnet) getrennt und mit PBS, auf einen pH-Wert von 8 eingestellt, gewaschen und wiederum im Scheidetrichter voneinander separiert. Somit erhielt man am Ende zweierlei Proben: eine „Proteinfraktion“ (bestehend aus diversen Molekülen wie Proteinen, aber auch Zucker) und eine gewaschene Lipidphase, gelöst in Diethlether.
Das Diethylether wurde mit Argongas weggedampft und der Lipidextrakt anschließend in 1 ml Komplettmedium wieder aufgenommen.
IV. Ergebnisse
4.1 Spontanapoptose der PMN
Wir untersuchten das Apoptoseverhalten von neutrophilen Granulozyten um eine Beeinflussung desselbigen durch Streptococcus pneumoniae beurteilen zu können. Hierfür wurden neutrophile Granulozyten frisch isoliert und anschließend bei 37°C belassen um zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Apoptoserate zu kontrollieren.
A) B)
Abb. 1:Spontanapoptose bei neutrophilen Granulozyten. Kernmorphologie gefärbt mit Giemsa bei humanen PMN, 0h (Bild A) oder 18h (Bild B) nach Inkubation in Komplettmedium. Die Bilder sind repräsentativ für 5 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente.
Die Abbildung 1A) zeigt einen frisch isolierten neutrophilen Granulozyten zum Zeitpunkt 0, der eine intakte, nicht apoptotische Kernmorphologie aufweist (siehe Pfeil). Im Gegensatz dazu ist in der Abbildung 1B) eine Population von 18h alten PMN zu erkennen, welche kondensierte, geschrumpfte Zellkerne aufweisen (siehe Pfeil), deren multilobuläre Struktur aufgehoben ist. Diese PMN können somit anhand ihrer Kernmorphologie als apoptotisch deklariert werden.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 2 4 6 18 42
Zeit (h)
Apoptoserate(%)
Abbildung 2: Spontanapoptose: Der Prozentsatz apoptotischer PMN von unterschiedlichen
Zeitpunkten (0h, 0,5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 18h, 42h) wurde analysiert mittels mikroskopischer Evaluierung von >200 Zellen auf Cytospingläsern, gefärbt mit Giemsa. Die Daten repräsentieren den Mittelwert +/- Standardabweichung (SD) für 16 unabhängige Experimente.
Den Verlauf der Spontanapoptoserate zeigt die Abbildung 2. Es wurde der Prozentsatz an Zellen mit kondensierten Zellkernen, also apoptotischen Zellen, ausgezählt und anhand dessen eine Kurve der Apoptoseraten erstellt. Dabei zeigte sich zum Zeitpunkt 0 eine Spontanapoptoserate von 1% (+/-1% SD), nach einer halben Stunde 0,3% (+/- 0,4%), nach einer Stunde eine Apoptoserate von 4% (+/-3%) und nach 2h eine Apoptoserate von 5%
3% SD). Nach 4h lag die Spontanapoptoserate bei 6% 4%), nach 6h bei 18% (+/-10%). Zum 18h-Zeitpunkt war die Rate der Spontanapoptose auf 54% (+/- 12% SD) angestiegen. Nach 42h waren fast alle PMN (99%) spontan in die Apoptose gegangen.
4.2 Induzierte Apoptose der PMN
Neben der Spontanapoptose wurde gezielt Apoptose bei den PMN induziert:
1. Durch Behandlung mit 1µM Staurosporin. Staurosporin ist eine Substanz, die in neutrophilen Granulozyten das Apoptoseprogramm aktiviert (Bahlis et al. 2005).
2. Durch Bestrahlung mit UV-Licht- hierbei wurde in diversen Versuchen 5000mJ/m2 als optimale Bestrahlungsintensität ermittelt. UV-Licht führt zu einer Schädigung der DNA und somit zur Induktion des Apoptoseprogramms der Zelle (Lauber et al.
2003, Lo et al. 2005).
3. Durch Infektion mit Streptococcus pneumoniae.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 4 18 42
Zeit (h)
Apoptoserate(%)
Abbildung 3: Apoptoseinduktion durch UV-Licht (Quadrate, durchgezogene Linie) oder Staurosporin (Dreiecke, gestrichelte Linie) bei frisch isolierten PMN: Der Prozentsatz apoptotischer PMN von unterschiedlichen Zeitpunkten (0h, 0,5h, 1h, 2h, 18h, 42h) wurde analysiert mittels mikroskopischer Evaluierung von >200 Zellen auf Cytospingläsern, gefärbt mit Giemsa. Die Daten repräsentieren den Mittelwert +/- Standardabweichung (SD) für 5 unabhängige Experimente.
Insgesamt zeigte sich, dass sowohl eine Behandlung der PMN mit Staurosporin als auch eine Bestrahlung mit UV-Licht zu einer eindeutigen Erhöhung der Apoptoserate sowohl der früheren Zeitpunkte als auch der späteren Zeitpunkte führte im Vergleich zu der Höhe der Spontanapoptoserate (siehe Abbildung 3).
Die Apoptoserate des 2h-Zeitpunktes lag sowohl bei der Behandlung der PMN mit Staurosporin als auch bei Bestrahlung der PMN mit UV-Licht bei jeweils 30% (+/-3% SD) bei Behandlung mit Staurosporin bzw. 29% (+/-3% SD) bei Bestrahlung der PMN mit UV-Licht (demnach jeweils 6fach erhöht im Vergleich zur Spontanapoptoserate der PMN nach 2h). Nach 18h zeigte sich bei beiden Verfahren eine Erhöhung auf jeweils 92% (+/-3%
SD) (Spontanapoptoserate der PMN nach 18h liegt bei 54%). Nach 42h waren über 99%
der PMN in die Apoptose gegangen.
4.3 Apoptoseinduktion bei PMN durch Infektion bzw. Koinkubation mit Streptococcus pneumoniae
Wie wirken aber Erreger auf die Apoptose der PMN? Wir suchten hierfür das Modell eines apoptose-induzierenden Erregers und entschieden uns nach diversen Testreihen für den extrazellulären Erreger der Meningitis und Pneumonie: Streptococcus pneumoniae Wildtyp (Pc w). Ob und wie dieser das Apoptoseverhalten von neutrophilen Granulozyten beeinflusst, ist bisher noch nicht untersucht.
Gleichzeitig untersuchten wir dabei, ob und was es für einen Unterschied gibt von apoptotisch gewordenen PMN, die mit lebenden Pc w infiziert wurden und solchen, die mit abgekochten (100°C-Wasserbad für 15 Minuten), also toten Pc w koinkubiert wurden.
A) B)
Abbildung 4: Neutrophiler Granulozyt, koinkubiert mit lebenden Streptococcus pneumoniae Erregern (Wildtyp). Die lebenden Pneumokokken lagern sich außen an die Membran der PMN (siehe Pfeil) (Bild A).
Neutrophiler Granulozyt koinkubiert mit abgetöteten Streptococcus pneumoniae Erregern (Wildtyp).
Die toten Pneumokokken befinden sich im Cytoplasma des neutrophilen Granulozyten (siehe Pfeile) (Bild B).
Giemsafärbung. Repräsentativ für 5 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente.
Die mikroskopische Auswertung der Giemsa-Präparate zeigte, dass PMN welche mit lebenden Pc w infiziert wurden zum 2h-Zeitpunkt, eine Auflagerung der Pneumokokken auf ihrer äußeren Zellmembran zeigten (siehe Pfeil, Abbildung 4, Bild A). Nur ein sehr geringer Teil der Pc w ließ sich im Zellinneren erkennen.
Wurden hingegen die PMN mit abgekochten, also toten, Pc w koinkubiert, wurden praktisch 100% der Pneumokokken in das Zellinnere der Neutrophilen aufgenommen (siehe Pfeile) (Abbildung 4, Bild B).
Ähnliches zeigte die Live-Dead-Färbung (Ergebnisse nicht abgebildet): wurden lebende Pc w zu frisch isolierten PMN gegeben, zeigte sich nach 2h eine Auflagerung der grünen (also lebendigen) Pc w auf grün gefärbten (nicht apoptotischen) PMN. Nach 18h waren ca. 85%
der PMN grün und 15% rot (also nekrotisch, bzw. nicht klar differnzierbar ob apoptotisch oder nekrotisch).
Bei den PMN die mit den toten Pc w inkubiert worden waren, bot sich zum 2h- Zeitpunkt dagegen das Bild, dass der Hauptteil der Pc w (rot) von nicht apoptotischen PMN (grün) aufgenommen worden waren. Nach 18h färbten sich etwa 70% der PMN grün und 30%
rot.
Die Auswertung der Giemsa-Präparate ergab, dass im Vergleich zu der Rate der Spontanapoptose sowohl die Apoptoserate der PMN, welche mit lebenden Pc w infiziert
worden waren, als auch die der PMN, welche mit abgekochten Pc w koinkubiert worden waren, höher lagen. Dieses ließ sich sowohl für frühe Zeitpunkte als auch zumindest bedingt für späte Zeitpunkte zeigen. Des Weiteren ließ sich zeigen, dass die PMN, welche mit lebenden Pc w infiziert wurden, früher und ausgeprägter in Apoptose gingen als die PMN, welche mit toten (abgekochten) Pc w koinkubiert worden waren (siehe Abbildung 5).
Die Apoptoserate der behandelten PMN war im Vergleich zur Spontanapoptoserate zu allen bestimmten Zeitpunkten höher oder gleich hoch.
18
Abbildung 5: Spontanapoptoserate von PMN (Dreiecke, durchgezogene Linie) verglichen mit der Apoptoserate von PMN, welch mit lebenden Pc w (dunkle Quadrate, durchgezogene Linie) infizierten wurden oder mit toten Pc w (helle Quadrate, gestrichelte Linie) koinkubiert. Das Verhältnis der Pneumokokken zu den PMN betrug dabei jeweils 100:1. Auswertung durch Giemsapräparate - der Anteil der apoptotischen PMN ist in Prozent angegeben. Es wurden verschiedene Zeitpunkte untersucht: 0h, 30 Minuten, 1h, 2h, 4h, 6h, 18h, 42h. n=12 +/- Standardabweichung
Beispielhaft soll hier als früher Zeitpunkt der Apoptose der 4h-Zeitpunkt hervorgehoben werden, welcher für die mit lebenden Pc w infizierten PMN eine Apoptoserate von 28%
(+/-5% SD) ergab. Also eine fast 5fach erhöhte Apoptoserate im Vergleich zu der, der
Spontanapoptose (6% +/-4% SD). Für die mit toten Pc w infizierten PMN zeigte sich nach 4h eine Apoptoserate von 13% (+/-5% SD). Diese ist demnach mehr als doppelt so hoch wie die Spontanapoptoserate.
Beispielhaft für einen späten Zeitpunkt lässt sich über den 18h-Zeitpunkt berichten, dass auch hier die Apoptoserate der infizierten bzw. mit toten Pc w koinkubierten PMN höher war als die Spontanapoptoserate. Für die mit lebenden Pc w infizierten PMN ließ sich dabei eine Apoptoserate von 92% (+/-4% SD) ermitteln, für die PMN, welche mit toten Pc w infiziert worden waren, ergab sich ein Wert von 62% (+/-6%). Vergleichswert für die Spontanapoptoserate zum 18h-Zeitpunkt ist 54% (+/-13%). Die Einzelwerte lassen sich der Abbildung 5 entnehmen.
Wir entschieden uns in den Folgeexperimenten den 18h-Zeitpunkt weiter zu verfolgen, weil wir hier die höchste Apoptoserate fanden.
4.4 Ermittelung der Apoptoserate von PMN infiziert bzw. koinkubiert mit Pc w durch FASC-Analyse
Durch die Durchführung einer FACS-Analyse sollte geklärt werden, ob die PMN tatsächlich apoptotisch werden oder eventuell doch primär nekrotisch.
Die FACS-Färbung wurde mit AnnexinV-Fluos (ANV) und Propidiumiodid (PI) durchgeführt.
Die Abbildung 6 zeigt die FACS-Färbung von 4h-alten PMN.
Quad %Total XGeoMean YGeo Mean UL 2,35 4,58 79,67
UR 2,53 559,85 31,85 LL 80,97 3,70 3,28 LR 14,15 253,41 3,84
Abbildung 6: Punktdiagramm (dot plot) als Ergebnis einer FACS-Färbung mit AnnexinV-Fluos (x-Achse) und Propidiumiodid (y-(x-Achse) von 4h-alten neutrophilen Granulozyten; die Tabelle gibt den totalen Prozentsatz (%Total), den geometrischen Mittelwert für x- bzw. y-Achse (XGeo Mean, bzw. Y Geo Mean) der Punkteverteilung in den jeweiligen Quadranten an (linker oberer Quadrant = UL, rechter oberer = UR, linker unterer = LL, rechter unterer = LR); repräsentative Abbildung für 10 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente
Als apoptotische Population (also ANV positiv, PI negativ) werden Zellen im rechten unteren (LR) Quadrant deklariert; als nekrotisch (also PI positiv, ANV negativ) werden Zellen im oberen linken (UL) und als apoptotisch nekrotische Zellen (das heißt: ANV positiv und PI Positiv) gelten diejenigen im oberen rechten (UR) Quadranten. Der linke untere Quadrant (LL) bildet die lebendigen Zellen ab. Jeder Punkt des dot plots entspricht der spezifischen gemessenen Fluoreszenz einer Zelle (Janeway et al.2001).
Die FACS-Färbung von nicht infizierten 4h-alten PMN zeigte hier dementsprechend eine Apoptoserate von 14%, die Nekroserate lag bei 2%. Apoptotisch nekrotisch waren 2,5%
der PMN. Der Hauptteil (80%) war lebendig und lag somit im linken unteren Quadranten (siehe Abbildung 6).
Quad %Total XGeoMean YGeo Mean UL 24,05 8,69 50,10
UR 69,50 47,33 153,62 LL 5,95 2,87 6,42 LR 0,50 29,67 9,19
Abbildung 7: Punktdiagramm (dot plot) als Ergebnis einer FACS-Färbung mit AnnexinV-Fluos (x-Achse) und Propidiumiodid (y-(x-Achse) von 4h-alten neutrophilen Granulozyten, die mit frischen Erregern vom Streptococcus pneumoniae Wildtyp (Verhältnis Pc w zu PMN betrug dabei 100:1) infiziert wurden; repräsentative Abbildung für 10 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente
Der 4h-Zeitpunkt von PMN, welche mit dem Pneumokokken-Wildtyp infiziert worden waren, zeigte in der FACS-Analyse eine Verschiebung der PMN in den linken und vor allem den rechten oberen Quadranten (siehe Abbildung 7).
Die Nekroserate war hier entsprechend höher (24%), die Rate der apoptotisch nekrotischen PMN mit 69% ebenfalls. Die Apoptoserate betrug hier 0,5%.
Quad %Total XGeoMean YGeo Mean UL 2,67 6,29 63,16
UR 17,55 776,59 58,44 LL 35,13 4,17 3,57 LR 44,65 229,79 3,55
Abbildung 8: Punktdiagramm (dot plot) als Ergebnis einer FACS-Färbung mit AnnexinV-Fluos (x-Achse) und Propidiumiodid (y-(x-Achse) von 18h-alten neutrophilen Granulozyten; die Tabelle gibt den totalen Prozentsatz (%Total), den geometrischen Mittelwert für x- bzw. y-Achse (XGeo Mean, bzw. Y Geo Mean) der Punkteverteilung in den jeweiligen Quadranten an (linker oberer Quadrant = UL, rechter oberer = UR, linker unterer = LL, rechter unterer = LR); repräsentative Abbildung für 10 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente
Die FACS-Färbung der nicht infizierten 18h-alten PMN (siehe Abbildung 8) zeigte eine Apoptoserate von 44%. Die nekrotische Population liegt bei 2,6%. Der Prozentsatz der apoptotisch nekrotischen PMN liegt bei 17,5%.
Quad %Total XGeoMean YGeo Mean
UL 2,35 10,88 29,57 UR 91,02 245,25 100,55
LL 2,32 3,86 3,67 LR 4,32 212,94 5,47
Abbildung 9: Punktdiagramm (dot plot) als Ergebnis einer FACS-Färbung mit AnnexinV-Fluos (x-Achse) und Propidiumiodid (y-(x-Achse) von 18h-alten neutrophilen Granulozyten, die mit frischen Erregern vom Streptococcus pneumoniae Wildtyp (Verhältnis Pc w zu PMN betrug dabei 100:1) infiziert wurden; repräsentative Abbildung für 10 voneinander unabhängig durchgeführte Experimente
Die Abbildung 9 zeigt die FACS-Färbung von 18h-alten PMN, die mit dem Wildtyp von Streptococcus pneumoniae infiziert wurden. Hier zeigt sich im Vergleich zur Abbildung 8 insgesamt eine Verschiebung der Zellen in den rechten oberen Quadranten.
Der Anteil der apoptotischen PMN betrug hier 4,3%, der der nekrotischen PMN 2,3%. Der Anteil der apoptotisch nekrotischen PMN lag bei 91%.
Insgesamt konnte man anhand der FACS-Analyse beobachten, dass PMN, wenn sie mit dem Streptococcus pneumoniae-Wildtyp infiziert worden waren, eine Verschiebung in den ANV- und PI-positiven Bereich zeigten. Dieses Phänomen zeigte sich sowohl für frühere (z.B. 4h) als auch für spätere (18h) Zeitpunkte.
4.5 Apoptoseinduktion bei PMN durch Infektion mit Streptococcus pneumoniae-Mutanten
Nach neuen Forschungsergebnissen wird für Streptococcus pneumoniae eine neue und alternative, kaspase-unabhängige Form der Apoptoseinduktion für dendritische Zellen und Gliazellen beschrieben (Colino et al. 2003; Braun et al. 2002).- Für PMN ist bisher noch nichts dergleichen bekannt. Gibt es diese also auch für die Neutrophilen?
Verantwortlich für diese alternative Apoptoseinduktion werden dabei H2O2 und Pneumolysin gemacht. Diese beiden Stoffe aktivieren den sogenannten Apoptosis-inducing-factor (AIF), welcher das Apoptoseprogramm der Zelle einschaltet ohne dabei Kaspasen zu aktivieren. Es wird hypothetisiert, dass dieser kaspase-unabhängige Weg zeitlich schneller ablaufen könnte, also zu einer früheren Apoptose führt.
Unsere Ergebnisse zeigten, dass PMN, welche mit dem Streptococcus pneumoniae Wildtyp infiziert worden waren, tatsächlich früher apoptotisch wurden, verglichen mit der Spontanapoptoserate von PMN. Daher wollten wir diesen offenbar anderen Weg der Apoptoseinduktion genauer untersuchen. Hierfür arbeiteten wir mit Mutanten von Streptococcus pneumoniae: spxB-, einem H2O2-defizienten Mutanten, welcher uns freundlicherweise von der Forschungsgruppe von Dr. Mann, Memphis, Lauderdale überlassen wurde und mit plnA-, einem Pneumolysin-defizienten Mutanten, welchen wir von der Forschungsgruppe Dr. Briles, Birmingham erhielten.
Bei der Bestimmung der Apoptoserate mittels Giemsa-Färbung wurden frühe Zeitpunkte mit berücksichtigt, um so den Zeitpunkt einer eventuell früher als zuvor beobachteten induzierten Apoptose beobachten zu können (Abbildung 10).
0
Abbildung 10: Auszählung der Apoptoserate (in %) von mit Pc-Mutanten infizierten PMN in Giemsapräparaten. Es wurden mehrere Zeitpunkte untersucht. Hier dargestellt sind die 4h-Zeitpunkte (linke vier Figuren, grau) für eine Infektion mit dem Pneumokokken Wildtyp (Pc w), dem H2O2-defizienten Pneumokokkenmutanten spxB-, dem Pneumolysin-defizienten Pneumokokken-mutanten plnA- und PMN in Komplettmedium (aufgelistet von links nach rechts;Verhältnis Erreger zu PMN betrug dabei jeweils 100:1). Die rechten vier Figuren zeigen die entsprechenden 18h-Zeitpunkte; n=4+/- Standardabweichung.
Die Ergebnisse zeigten eine Erhöhung der Apoptoserate zum 4h-Zeitpunkt für alle PMN, welche mit Pneumokokken infiziert wurden (die Spontanapoptoserate der PMN liegt bei 8% +/5% SD zum 4h-Zeitpunkt). Dabei fällt auf, dass die Apoptoserate der PMN, die mit dem Pneumokokkenwildtyp infiziert wurden mit 24% (+/- 9% SD) am höchsten ist (liegt beim bis zu dreifachen der Spontanapoptoserate), gefolgt von der Apoptoserate der PMN, die mit dem H2O2-defizienten Mutanten spxB- infiziert wurden mit einer Apoptoserate von 16% (+/- 5% SD). Die niedrigste Apoptoserate zum 4h-Zeitpunkt hier, zeigten die PMN, welche mit dem Pneumolysin-defizienten Mutanten plnA- infiziert wurden. Ihre Apoptoserate liegt mit 6% (+/-1% SD) knapp unter der Spontanapoptoserate. Von einem
verfrühten Zeitpunkt der Apoptoseinduktion kann für plnA- daher kaum gesprochen werden.
Die 18h-Zeitpunkte zeigten, dass auch hier die PMN, welche mit dem Pneumokokken-Wildtyp infiziert worden waren, die höchste Apoptoserate mit 80% (+/-15% SD) zeigten.
Dicht gefolgt von den PMN, die mit spxB- infiziert worden waren mit 70% (+/-10%), knapp dahinter die PMN, welche mit plnA- infiziert worden waren mit ca. 57% (+/-29%
SD).
Der Trend des 4h-Zeitpunktes blieb somit: am stärksten apoptoseinduzierend wirkte der Pneumokokken-Wildtyp, gefolgt vom Mutanten spxB-. Allerdings zeigten die 18h- Zeitpunkte im Gegensatz zu den frühen 4h-Zeitpunkten einen wesentlich geringeren Unterschied untereinander bezüglich ihrer Apoptoserate.
Auch die FACS-Analyse des Apoptoseverhaltens der PMN, die mit dem Wildtyp, bzw. mit den Mutanten infiziert wurden, bestätigen diese Ergebnisse (hier nicht abgebildet).
4.6 Hemmung der apoptoseinduzierenden Faktoren Pneumolysin und H2O2
Nun wollten wir kontrollieren, ob tatsächlich die Induktion der Apoptose vom Vorhandensein des Pneumolysins bzw. des H2O2 abhängt.
Es ist bekannt, dass sich das Pneumolysin durch SB (p38 MAP Kinaseinhibitor) hemmen lässt.
Die Aktivität von H2O2 lässt sich durch N-Acetyl-Cystein (NAC) oder Katalase sehr stark einschränken bzw. aufheben.
Bei NAC entdeckten wir als Nebeneffekt, dass es bereits allein in der Lage ist die Apoptose bei PMN zu induzieren. Daher konnten Versuche von mit NAC präinkubierten plnA- nicht beurteilt werden.
Der alleinige Effekt von SB erbrachte die gleiche Apoptoserate wie für die PMN, die spontan in Apoptose gegangen waren.
Wir beobachteten also die Apoptoserate von 18h-alten PMN, die mit Pc w infiziert worden waren und dann mit SB 1µM/ml für 5 Minuten präinkubiert wurden und verglichen sie mit der Apoptoserate von PMN, welche mit spxB- infiziert worden waren, welche ebenfalls mit SB 1µM/ml für 5 Minuten präinkubiert wurden (Abbildung 11).
0
Abbildung 11: Vergleich der Apoptoserate in % (Auszählung von Giemsapräparaten) von 4h- und 18h-Zeitpunkten: dabei werden PMN, welche mit dem Pneumokokken-Wildtyp und solche, die mit dem Pneumokokkenmutanten spxB- infiziert wurden verglichen (Pcw: dunkle Säulen, spxB-: helle Säulen;Verhältnis Erreger zu PMN betrug dabei jeweils 100:1) mit der Spontanapoptoserate (weiß) und es wird verglichen, was für einen Effekt die Präinkubation von SB (=p38 MAP Kinaseinhibitor) 1µM/ml auf die Apoptoserate hat (jeweils die rechte der paarweise angeordneten Säulen); n=3 +/- Standardabweichung.
Es zeigte sich, dass zum frühen 4h-Zeitpunkt die Apoptoserate der PMN, die mit Pc w infiziert worden waren im Gegensatz zu den mit Pc w infizierten PMN, welche anschließend mit SB präinkubiert wurden, kaum unterschied (lagen bei 34% (+/-5% SD) bzw. bei 32% (+/-4% SD).
Beim 4h-Zeitpunkt der PMN allerdings, welche mit spxB- infiziert worden waren, bestand ein deutlicher Unterschied der Apoptoserate zwischen den PMN, welche lediglich mit spxB- infiziert worden waren und denen, welche zusätzlich mit SB präinkubiert wurden:
wurden die H2O2-defizienten Pneumokokkenmutanten spxB- mit SB vorinkubiert, sank ihre Apoptoserate auf 9% (+/-2% SD) ab. Im Gegensatz dazu lag die Apoptoserate der
ausschließlich mit spxB- infizierten PMN bei ca. 18% (+/-3% SD)- dementsprechend also doppelt so hoch.
Für den späten 18h-Zeitpunkt ließ sich erkennen, dass es keine relevanten Unterschiede hinsichtlich der Apoptoserate gab: weder bei den PMN, infiziert mit Pc w und im Vergleich dazu Pc w mit SB präinkubiert ( in beiden Fällen lag die Apoptoserate bei etwa 98% (+/-10% SD)) noch bei den PMN infiziert mit spxB- vorbehandelt versus nicht vorbehandelt mit SB. In beiden Fällen war hier die Apoptoserate etwa gleich hoch (85%
(+/-6% SD), bzw. 86% (+/-6% SD). Die Einzelwerte lassen sich der Abbildung 11 entnehmen.
Abschließend läßt sich sagen, dass offenbar die Infektion der PMN mit Streptococcus pneumoniae zu einer früheren Apoptoseinduktion bei den PMN führt im Vergleich zu der Spontanapoptoserate. Dieses gilt sowohl für den Pneumokokken-Wildtyp als auch für beide Mutanten, wobei der Wildtyp zu dem frühsten Eintritt der Apoptose und zu den jeweils höhsten Apoptoseraten zu den unterschiedlichen Zeitpunkten bei den PMN führte.
Des Weiteren führen lebende Pneumokokken zu einem früheren und höherem Prozentsatz an Apoptose als dieses tote Pneumokokken tun.
Für eine alternative und schnellere bzw. frühere Form der Apoptoseinduktion durch Streptococcus pneumoniae bei neutrophilen Granulozyten spricht somit einiges.
4.7 Untersuchung der Fähigkeit zur Rekrutierung von Phagozyten durch PMN
Hat aber die Infektion der neutrophilen Granulozyten mit Streptococcus pneumoniae auch Einfluss auf die Rekrutierung anderer PMN? Wenn Pneumokokken PMN schneller in die Apoptose treiben, stellt sich die Frage, ob PMN, welche mit Pc infiziert sind, andere Phagozyten auch schneller rekrutieren. Ist also die Chemotaxis verändert?
Hierfür führten wir Chemotaxisassays durch. Als Phagozyten, also auf ein chemotaktisches Signal hin wandernde Zellen, verwendeten wir dabei ebenfalls PMN.
Chemotaxis gilt hierbei als erfolgt, wenn der Chemotaktische Index (CI) größer als 1 ist.
Der CI errechnet sich als Quotient aus der ß-Glucuronidase-Konzentration der Probe und der ß-Glucuronidase-Konzentration des Mediums, welches als Negativkontrolle fungiert.
Als Positivkontrolle wurden das gut untersuchte Chemokin IL-8 (Abbildung 12) und der chemotaktische Faktor fMLP (Abbildung 13) verwendet.
1 6 11 16 21 26 31 36
IL-8 25 ng 15 ng 10 ng 5 ng 0,5 ng 0,05 ng
CI
Abbildung 12: Chemotaxisassay: Frisch isolierte PMN migrierten auf Lösungen mit unterschiedlichen IL-8-Konzentrationen: 25; 15; 10; 5; 0,5 und 0,05 ng jeweils pro ml. n=1
Der Chemotaktische Index lag bei Verwendung von IL-8 als chemotaktisch wirksamer Substanz wie die Abbildung 12 zeigt, ab einer Konzentration von 0,5 ng/ml immer deutlich über 1. Für die folgenden Chemotaxisexperimente wurde als Positivkontrolle eine IL-8-Konzentration von 5 ng/ml verwendet.
1 6 11 16 21 26 31 36
fMLP 1,0 µM
0,1 µM 0,05 µM 0,025 µM 0,01 µM 0,005 µM 0,0025 µM 0,001 µM 0,0001 µM
CI
Abbildung 13: Chemotaxisassay: Frisch isolierte neutrophile Granulozyten wurden auf Lösungen von fMLP zuwandern gelassen. Es wurden unterschiedliche Konzentrationen von fMLP getestet: 1,0; 0,1;
0,05; 0,025; 0,01; 0,005; 0,0025; 0,001und 0,0001 µM jeweils pro ml. n=1
Die Abbildung 13 zeigt das Ergebnis eines Chemotaxisassays zur Ermittlung einer maximalen/optimalen chemotaktischen Wirkung von fMLP. Die Werte lagen für alle aufgelisteten Konzentrationen jeweils deutlich über 1. Einzelwerte lassen sich der Abbildung entnehmen. Für die nachfolgenden Experimente wurde fMLP in einer Konzentration von 0,1 µM als Positivkontrolle verwendet.
4.8 Chemotaxisassays von PMN (Spontanapoptose versus Apoptoseinduktion)
Die Versuche ergaben eindeutig positive und gut reproduzierbare Chemotaktische Indices für die Proben, der durch Staurosporin (CI bei 0,3 SD) und UV-Licht (CI bei 1,7+/-0,4 SD) induzierten apoptotischen PMN.
0 0,5 1 1,5 2 2,5
PMN 18h (Spontanapoptose)
PMN 18h+St(1µM) PMN
18h+UV(5000mJ/m2)
CI
Abbildung 14: Ergebnis von Chemotaxisversuchen mit frisch isolierten PMN als migrierende Zellen auf Überstände von auf unterschiedliche Art apoptotisch gewordenen neutrophilen Granulozyten: 1.
spontan in die Apoptose gegangenen PMN, 2. mit Staurosporin 1µM behandelten PMN und 3. mit UV-Licht 5000mJ/m2 bestrahlten PMN (von links nach rechts in der Abbildung, jeweils 18h-Zeitpunkte).
n=3+/- Standardabweichung
Die Überstände von den spontan in Apoptose gegangenen PMN waren erst ab einem Zeitpunkt von 18h in dem Großteil der Versuche chemotaktisch positiv. Dabei waren die
Die Überstände von den spontan in Apoptose gegangenen PMN waren erst ab einem Zeitpunkt von 18h in dem Großteil der Versuche chemotaktisch positiv. Dabei waren die