Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Modifizierte durchflusszytometrische Methode zum empfindlicheren Nachweis der Produktion
von reaktiven Sauerstoffspezies neutrophiler Granulozyten in vitro.
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Liliya Mironova aus Omsk, Russland
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung : Univ.-Prof. Dr. med. vet., Dr. h.c. W. Leibold
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet., Dr. h.c. W. Leibold 2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. D. Steinhagen
Tag der mündlichen Prüfung: 4. Juni 2004
Für
Juri und meine Eltern
in Liebe und Dankbarkeit
INHALTVERZEICHNIS
Verzeichnis der Abkürzungen und Termini technici Glossar
1 Einleitung und Zielsetzung 13
2 Literaturübersicht 14
2.1 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten 14
2.1.1 Entwicklung und morphologische Eigenschaften neutrophiler Granulozyten
14 2.1.2 Phänotypische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten 18 2.1.3 Funktionelle Eigenschaften neutrophiler Granulozyten 20
2.1.3.1 Extravasation und Chemotaxis 20
2.1.3.2 Phagozytose 22
2.1.3.3 Bildung reaktiver Sauerstoffspezies 24
2.1.3.3.1 Die in-vitro-Beurteilung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies 26
2.1.3.4 Zytotoxizität 28
2.2 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr 28
3 Material und Methoden 30
3.1 Geräte und Materialien 30
3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf 30
3.1.2 Reagenzien und andere Verbrauchsmaterialien 33
3.1.3 Puffer, Lösungen und Medien 35
3.1.4 Materialien für die Separation, Differenzierung und Vitalitätsbestimmung von Zellen
36
3.1.5 Materialien für die Durchflusszytometrie 37
3.1.6 Materialien zur durchflusszytometrischen Bestimmung absoluter Zellzahlen
37
3.1.7 Materialien für die Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) 38
3.1.8 Probanden 39
3.2 Methoden 41
3.2.1 Gewinnung und Isolierung von Leukozyten aus dem Blut 41
3.2.1.1 Blutentnahme 41 3.2.1.2 Isolierung der Leukozyten aus dem peripheren Blut 41 3.2.1.2.1 Isolierung boviner Leukozyten aus dem peripheren Blut 41 3.2.1.2.1.1 Isolierung der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) 41
3.2.1.2.1.2 Separation der Gesamtleukozyten 42
3.2.1.2.2 Isolierung equiner Leukozyten aus dem peripheren Blut 43 3.2.1.2.3 Isolierung caniner Leukozyten aus dem peripheren Blut 43 3.2.1.2.4 Isolierung humaner Leukozyten aus dem peripheren Blut 44 3.2.1.3 Isolierung boviner Thrombozyten aus dem peripheren Blut 44
3.2.2 Durchflusszytometrie 45
3.2.3 Bestimmung der Zellzahl 46
3.2.3.1 Herstellung der Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung 47 3.2.3.1.1 Referenzzellmethode (durchflusszytometrische Bestimmung absoluter
Zellzahlen)
48
3.2.4 Leukozytendifferenzierung 50
3.2.5 Vitalitätsbestimmung 51
3.2.6 Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies 52
3.2.6.1 Herstellung der eingesetzten Zellsuspension 52 3.2.6.2 Vorbereitung des Testansatzes (der Reagenzien für den ROS-Test) 52
3.2.6.3 Ansatz der Percoll-Kissen 53
3.2.6.4 Durchführung der ROS-Tests 53
3.2.6.4.1 Percoll-Test: Induktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) auf Percoll- Kissen
53 3.2.6.4.2 Plastik-Test: ROS-Induktion auf Plastik ohne Percoll-Kissen 54 3.2.6.5 Durchflusszytometrische Auswertung der ROS-Produktion 54 3.2.7 Datenverarbeitung und statistische Auswertung 57
4 Ergebnisse 58
4.1 Zellverluste und ihre Ursachen 58
4.1.1 Plastikadhärenz als Ursache für Zellverluste 58 4.1.2 Einfluss von PMA, Plastik oder Percoll auf die Vitalität der Zellen 61
4.1.3 Zellverluste in Probenröhrchen 63
4.1.4 Zellverluste in Mikrotiterplatten unterschiedlicher Beschaffenheit 65
4.2 Aufbau eines modifizierten ROS-Verfahrens 67
4.2.1 Vergleich zwischen sequentieller und gleichzeitiger Zugabe von PMA und DHR bei der Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies
67 4.2.2 Einfluss von Percoll und von Plastik auf die Morphologie und die
„spontane“ ROS-Bildung von PMN
70 4.2.3 Einfluss von Percoll und Plastik auf die Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies (ROS) von PMN nach konzentrationsabhängiger Stimulation mit PMA
72
4.2.4 Relevanz der Aussagen für andere Spezies 78 4.3 Einfluss von zellulären Bestandteilen auf die PMN des Blutes 85 4.3.1 Einfluss von MNC auf die Bildung von Sauerstoffmetaboliten durch
die PMN des Blutes
85 4.3.2 Einfluss von Thrombozyten auf die Bildung von
Sauerstoffmetaboliten durch die PMN des Blutes
87
5 Diskussion 90
5.1 Konzeptionelle Überlegungen zu Untersuchungen über den Einfluss von Percoll™ und von Plastik auf die funktionelle Kapazität neutrophiler Granulozyten
90
5.2 Erarbeitung einer Methode zur Bestimmung der ROS-Bildung von PMN
91 5.3 Erarbeitung optimaler Inkubationsbedingungen für die ROS-Bildung
neutrophiler Granulozyten
93
5.4 Einfluss von Percoll auf PMN 94
5.5 Testoptimierung 94
6 Zusammenfassung 96
7 Summary 99
8 Literaturverzeichnis 102
Verzeichnis der Abkürzungen und Termini technici Abb. Abbildung
ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity – Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität Aqua dest. Aqua destillata – destilliertes Wasser
Aqua tridest. Aqua tridestillata – dreifach destilliertes Wasser AICC antibody independent cellular cytotoxicity –
Antikörper-unabhängige zelluläre Zytotoxizität BLAD bovine leukocyte adhesion deficiency –
bovine Leukozytenadhäsionsdefizienz
Br- Bromid-Ionen
BSA Bovines Serum Albumin
bzw. beziehungsweise C3, C3a, C3b, iC3b, C4b,
C5, C5a, C5b
Complement factor(s) – Komplementkomponenten und ihre Spaltprodukte
ca. circa
CD cluster of differentiation –
System zur Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene CFU-GEMM colony forming unit of granulocytes, erythrocytes, monocytes and
megacaryocytes
Kolonie bildende Einheit an gemeinsamen Stammzellen für Granulozyten, Erythrozyten, Monozyten und Megakaryozyten CFU-GM colony forming unit of granulocytes and monocytes
Kolonie bildende Einheit an gemeinsamen Stammzellen für Granulozyten und Monozyten
CGD chronic granulomatous disease –
chronische septische Granulomatose
Cl- Chlorid-Ionen
CLAD canine leukocyte adhesion deficiency – canine Leukozytenadhäsionsdefizienz
CO2 Kohlenstoffdioxid
CR-1, 3 und 4 Complement receptor – Komplementrezeptor-1, 3 und 4 CRP C-reaktives Protein
Cy™5 Cytochrom 5
Cy™5-DαM IgG (H+L) Mit dem Fluorochrom Cy™5 konjugierte (donkey anti mouse) Esel-Antikörper-mit Spezifität gegen schwere und leichte Ketten (heavy and light chains) von murinem IgG
d.h. das heisst
DCF Dichlorofluoreszein DCFH Dichlorofluoreszin
DCFHDA Dihydrochlorofluoreszindiacetat
DHE Dihydroethidium
DHR 123 Dihydrorhodamin 123
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium mit L-Glutamin und NaHCO3
DMSO Dimethylsulfoxid
EB Ethidiumbromid
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest Eos. Gr. eosinophile Granulozyten
Fa. Firma
FACS fluorescence activated cell scanner –
Fluoreszenz-aktiviertes Zellanalysegerät, Durchflusszytometer Fc fragment cristalline – kristallisierbares Antikörperfragment des
konstanten Teils der schweren Immunglobulinketten FITC Fluorescein Isothiocyanate
FL 1, 2, 3, 4 Fluoreszenzemmissionsfenster nach Anregung durch Argonlaser = 488 nm: 1=grün: 500-560 nm, 2=orange: 543-627 nm, 3=rot: >649 nm, und nach Anregung durch Diodenlaser = 635 nm: 4=rot: 645- 676 nm
FSC forward scatter – Vorwärtsstreulicht g Gramm
G-CSF granulocyte–colony stimulating factor – Granulozyten-Wachstumsfaktor
GM-CSF granulocyte–monocyte–colony stimulating factor – Granulozyten-Monozyten-Wachstumsfaktor
Gra Granulozyt(en)
H2O2 Wasserstoffperoxid
IAP Integrin-Associated-Protein – Integrinassoziiertes Protein ICAM intercellular adhesion molecule –
interzelluläres Adhäsionsmolekül IgG Immunglobulin G
IgM Immunglobulin M
J- Jodid-Ionen
IL-1, 2, usw. Interleukin-1, 2, usw.
LAD I Leucocyte adhesion protein deficiency Typ I – Leukozytendefizienz Typ I
LFA1 Leukozyten-funktionsassoziiertes-Antigen 1 LPS Lipopolysaccharid
LRI Leukocyte-Response-Integrin
Leukozytereaktionsintegrin
LTB4 Leukotriene B4
Lym Lymphozyt(en)
Mac-1 macrophage receptor 1 – Makrophagenantigen 1
mAk monoklonaler Antikörper
MHC Major Histocompatibility Complex – Haupthistokompatibilitätskomplex
µ Mikro (x 10-6)
mg Milligramm mL Milliliter Min Minute(n) mmol millimolar M Mol
MNC mononuclear cells – mononukleäre Zellen (umfassen v.a.
Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen) Mon Monozyt(en)
MW arithmetischer Mittelwert
n Stichprobengröße NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
NBT Nitroblautetrazolium
nm Nanometer (= 10-9m)
Nr. Nummer
o.g. oben genannt
1O2 Singulet-Sauerstoff
O2 Molekularer Sauerstoff
O2˙¯ Superoxidanion
OH˙ Hydroxylradikal OH¯ Peroxidanion
PBS phospate buffered saline –
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (2xPBS = doppelt konzentriertes PBS)
PECAM platelet endothelial cell adhesion molecule
Adhäsionsmolekül (CD31) auf Thrombozyten, Leukozyten und Endothelzellen
PFA Paraformaldehyd PJ Propidiumjodid
PMA Phorbol-Myristat-Acetat
PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten R-123 Rhodamin-123
ROS reactive oxygen species – reaktive Sauerstoffmetaboliten RT Raumtemperatur
s. siehe s.o. siehe oben
SD standard deviation – Standardabweichung
SSC side scatter – Seitwärtsstreulicht
Tab. Tabelle
TNF-α tumor necrosis factor-α – Tumornekrosefaktor-α To-Pro-3 To-Pro-3iodid
u. und
u.a. unter anderem usw. und so weiter v.a. vor allem vgl. vergleiche
x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²) z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
ZÜ Zellkulturüberstand
Glossar
Basopenie Verringerung der absoluten Zahl basophiler Granulozyten pro Blutvolumen unter die physiologische Norm
Blut-PMN Aus dem peripheren venösen Blut gewonnene segmentkernige neutrophile Granulozyten
Eosinopenie Verringerung der absoluten Zahl eosinophiler Granulozyten pro Blutvolumen unter die physiologische Norm
Falcon Röhrchen-förmiges Reaktionsgefäß (50 mL) aus Kunststoff Interphase Ansammlung von Zellen nach einer Dichtezentrifugation
oberhalb einer Phase definierter Dichte
Neutrophilie Steigerung der absoluten Zahl segmentkerniger neutrophiler Granulozyten pro Blutvolumen über die physiologische Norm Neutrozytose Steigerung der absoluten Zahl segmentkerniger neutrophiler
Granulozyten pro Blutvolumen über die physiologische Norm Pellet Ansammlung von Zellen zumeist am Boden eines
Reaktionsgefäßes meist nach Zentrifugation oder Spontansedimentation
well Vertiefung einer Zellkulturplatte
Einleitung und Zielsetzung
1 Einleitung und Zielsetzung
Die um die Jahrhundertwende von dem russischen Zoologen ELIE METCHNIKOFF (1884) entdeckten polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (STICKLE 1996) sind ein wichtiger Bestandteil der unspezifischen Abwehr des Körpers. Sie schützen den Organismus vor schädigenden Einflüssen in Form von Mikroorganismen oder anderen Fremdkörpern, können jedoch auch apoptotische, geschädigte, überalterte oder opsonisierte körpereigene Zellen erkennen und beseitigen. Sie tätigen somit gleichzeitig unerlässliche Abwehr- und Aufräumarbeiten. Eine Störung dieser Zellpopulation und ihrer Funktionen führt oft zu schweren Erkrankungen des gesamten Organismus und möglicherweise zum Tod. Es ist daher sehr wichtig, rechtzeitig mittels labortechnischer Verfahren Funktionsdefekte der neutrophilen Granulozyten aufzudecken. Eine der wichtigsten funktionellen Eigenschaften der neutrophilen Granulozyten (PMN) ist die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Für die Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies werden verschiedene Verfahren, wie die Erfassung der Lichtemission über Photonenverstärker (Lumineszenz) oder die photometrische Darstellung oxidativer Reaktionsprodukte eingesetzt. In letzter Zeit kommen zunehmend durchflusszytometrische Messverfahren zur Anwendung. Es werden die relative Anzahl und Intensität von positiven und negativen PMN bewertet. Probleme bereiten allerdings starke Schwankungen der Messergebnisse bei quantitativer Auswertung.
Die vorliegende Arbeit versucht Ursachen für diese Unregelmässigkeiten zu ergründen und, wenn möglich, zu beseitigen. Ziel ist eine Optimierung und Standardisierung geeigneter durchflusszytometrischer Verfahren für die quantitative Messung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies beim Rind. Zudem soll die Übertragbarkeit dieser Technik auf andere Spezies geprüft werden.
Literaturübersicht
14
2 Literaturübersicht
2.1 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN)
Bei der unspezifischen zellulären Abwehr zählen PMN neben Monozyten und Makrophagen zu der wichtigsten Zellpopulation. Zur Abwehr von Fremdorganismen benötigen sie keine Spezifität gegenüber Antigenstrukturen. Ihre Hauptaufgabe verrichten sie bei akuten Entzündungen und in Zusammenarbeit mit geeigneten Antikörpern und Komplementfaktoren bei der Bekämpfung parasitärer und bakterieller Infektionen. Nach ihrer Bildung im Knochenmark werden sie in den Blutstrom abgegeben, in dem sie nur wenige Stunden zirkulieren (WECKER 1990, KLEIN 1991). Die Lebensdauer von PMN wird bei Mensch (ZINK 1990) und Ratte mit 2 bis 3 Tagen angegeben (ROITT et al.
1995); die Halbwertszeit von humanen PMN beträgt nach DALE et al. (1998) ungefähr 19 Stunden. Nach JANEWAY et al. (2002) zählt die Lebensdauer von PMN nur wenigen Stunden.
2.1.1 Entwicklung und morphologische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten
Morphologisch stellen sich PMN als im Durchmesser 10-12 µm messende Zellen dar (DORE et al. 1990).
Die Granulozyten erhielten ihre Bezeichnung auf Grund der deutlichen Granula im Zytoplasma. Wegen ihres unregelmäßig geformten Zellkerns nennt man die ausgereifte Formen auch polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN). Neben dem mehrfach gelappten Kern zählen die lichtmikroskopisch neutralen (azurophilen, primären) Granula zu den charakteristischen morphologischen Merkmalen ausgereifter neutrophiler Granulozyten. Ihre primären Granula sind reich an mikrobiziden Enzymen wie Hydrolasen, Lysozym, Myeloperoxidasen, Proteinasen, sauren Hydrolasen und Histaminase sowie an
Literaturübersicht
kationischen Proteinen. Sekundäre (spezifische) Granula enthalten zudem noch Lactoferrin und Kollagenasen (GEMSA et al. 1991, KLEIN 1991).
Bovine neutrophile Granulozyten haben noch eine dritte Art von Granula im Zytoplasma.
Diese Granula sind größer als die anderen Granula und enthalten kationische antibakterielle Proteine, wie z.B. Bactenecin (ROMEO et al. 1988), Indolicin und β-Defensin (SELSTED et al. 1992, 1993).
Wie jede Blutzelle haben auch die neutrophilen Granulozyten ihren Ursprung in den pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks (ROITT et al. 1995, da SILVA et al. 1994, JANEWAY et al. 2002). Der Stammzellpool der Blutzellen wird in der Embryonalphase gebildet und erhält sich danach durch Replikation selbst (LICHTMAN 1983, KWON 1987, da SILVA et al. 1994).
Die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, vor allem Stammzellfaktor (SCF) und Interleukin 3 (IL-3) regen die Stammzellen zur Replikation an. Der SCF wirkt spezifisch auf die Teilung der pluripotenten Stammzellen ein, wogegen IL-3 nahezu alle haematopoetischen Vorläuferzellen einschließlich der pluripotenten Stammzellen zur Teilung anregt (BAUER 1994). Interleukine werden von aktivierten Blutzellen vermehrt gebildet und abgegeben. Neben IL-3 wirken Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 9 (IL-9), Interleukin 11 (IL-11) (da SILVA et al. 1994) und Interleukin 2 (IL-2) (BAUER 1994) positiv auf die Stammzell-und Vorläuferzellreplikation ein. Aus einem mitotischen Teilungsprozess entstehen zum einen die multipotenten, lymphatischen Vorläuferzellen als Ausgangspunkt der lymphozytären Zellreihe, zum anderen die für die Granulopoese weitaus wichtigeren multipotenten, myeloischen Vorläuferzellen. Diese sind Ursprung aller Zellen der myeloischen Linie wie Erythrozyten, Thrombozyten, Monozyten, eosinophiler, basophiler und neutrophiler Granulozyten (LICHTMAN 1983, da SILVA et al. 1994, KRAFT et al. 1997) und werden deshalb auch colony forming unit of granulocytes, erythrocytes, monocytes and megacaryocytes (CFU-GEMM) genannt (da SILVA et al. 1994). Im Rahmen der Granulozytopoese entwickelt sich während der Vermehrungsphase im Knochenmark aus der myeloischen Vorläuferzelle durch mitotische Prozesse der Myeloblast. Dieser Zelltyp ist ca. 10-15 µm groß und hat ein hohes Kern/Plasma-Verhältnis. Im Zytoplasma befinden sich reichlich Mitochondrien und freie Polysomen mit hydrolytischen und oxidativen Enzymen (da SILVA et al. 1994). Der
Literaturübersicht
16
Myeloblast teilt sich in Vorläuferzellen für eosinophile und basophile Granulozyten und in die gemeinsamen Vorläuferzellen von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen, der colony forming unit of granulocytes and monocytes (CFU-GM). Diese nächste Zellstufe wird auch Promyelozyt genannt. Er ist mit 15-25 µm der größte Vertreter in der granulozytären Zellreihe (LIEBICH 1993, da SILVA et al. 1994). Sein Zellkern ist von runder Gestalt und im Zytoplasma von zahlreichen peroxidasepositiven, d.h. azurophilen Granula umgeben. Über die erneute Zellteilung entsteht der neutrophile Myelozyt (KWON 1987, LIEBICH 1993, da SILVA et al. 1994, KRAFT et al. 1997). Hierbei kommt es zur Differenzierung in peroxidase-positive, azurophile Granula und in die kleineren, peroxidase-negativen, „spezifischen“ Granula. Die Zelle ist ca. 10µm groß, hat einen gezackten Zellkern und einen sekretorisch aktiven, prominenten Golgiapparat (da SILVA et al. 1994). Der Myelozyt ist der letzte zur mitotischen Teilung fähige Vertreter der Granulozytopoese. Dessen Nachkomme ist der Metamyelozyt. Im Entwicklungsprozess der neutrophilen Granulozyten ist jetzt die Reifungsphase im Knochenmark erreicht. Ab diesem Zeitpunkt sind die Zellen im Notfall zur Phagozytoseaktivität fähig (KWON 1987), d.h. die Nachkommen der Vorläuferzellen erlangen die Fähigkeit zu spezifischen Funktionen, verlieren gleichzeitig jedoch die Möglichkeit zur Replikation (da SILVA et al. 1994). Ein Drittel der Zellen im Knochenmark gehört zum aktiven, sich teilenden Pool, die Granulopoese betreffend sind das Myeloblasten, Promyelozyten und Myelozyten. Zwei Drittel gehören zum maturen, sich nicht teilenden Pool (da SILVA et al. 1994). Der Metamyelozyt hat einen sekretorisch inaktiven Golgiapparat. Im Zytoplasma befinden sich gemischte Granulapopulationen, Ansammlungen von Glykogenpartikeln und wenige Mitochondrien.
Während der Reifung verändert sich das Aussehen des Zellkerns und die Zellgrösse nimmt kontinuierlich ab (LIEBICH 1993).
Der neutrophile Metamyelozyt („jugendlicher“ Granulozyt) weist einen bohnen- oder nierenförmigen Zellkern mit grobscholligem Chromatin auf. Der daraus entstehende stabkernige neutrophile Granulozyt ist unter physiologischen Bedingungen das erste Stadium im Blut. Die Kerngestalt ist hierbei verschmälert, C- oder S-förmig ohne erkennbare Schnürfurchen, und die Chromatinschollen sind noch gröber (Leopardenmuster). Nach weiterer Reifung ist das Chromatin dem des stabkernigen
Literaturübersicht
ähnlich, der Kern weist aber drei bis fünf mit fädigen Verbindungen aneinandergereihte Segmente auf (segmentkerniger neutrophiler Granulozyt). Als segmentkerniger neutrophiler Granulozyt ist die Funktionsphase erreicht und die Zellen sind bereit, ins Blut abgegeben zu werden, um von dort aus ihre Aufgaben wahrzunehmen (da SILVA et al. 1994, KRAFT et al. 1997). Eine positive Wirkung auf die Ausdifferenzierung und Reifung der Granulozyten haben die haematopoetisch wirksamen Faktoren granulocyte–
monocyte–colony stimulating factor (GM-CSF) und granulocyte–colony stimulating factor (G-CSF) (TILL u. THIELMANN 1989, BAUER 1994, da SILVA et al. 1994), gebildet u.a. von aktivierten Granulozyten und Makrophagen, unterstützt von IL-3 und IL-6 (BAUER 1994).
Nach der Freisetzung aus dem Knochenmark zirkulieren die PMN im Blutstrom, wobei sie besonders im Kapillargebiet engen Kontakt zum Endothel haben. Dieser Kontakt zu Endothelzellen wird über Adhäsionsmoleküle vermittelt.
Neutrophile Granulozyten stellen den Hauptanteil der zirkulierenden Granulozyten dar (GEMSA et al. 1991). Bei Mensch, Pferd, Hund und Katze (s. Tab.1) sind die neutrophilen Granulozyten die mengenmäßig größte Fraktion der weißen Blutzellen (da SILVA et al.
1994, KRAFT et al. 1997). Beim Rind stellen die segmentkernigen neutrophilen Granulozyten mit 25-45% neben den Lymphozyten (45-65%) der insgesamt 4.000 bis 12.000 Leukozyten pro µL Blut die zweitstärkste Leukozytenpopulation dar (KRAFT und DÜRR 1999). In geringeren Anteilen treten bei gesunden Rindern eosinophile (1-10%), basophile (0-2%) und stabkernige neutrophile Granulozyten (0-3%) auf (HOFMANN 1992).
Literaturübersicht
18
Tab. 1: Differenzialblutbild (Roche Lexikon Medizin 1991, KRAFT et al. 1997)
Zellform Hund Katze Pferd Mensch
% % % % stabkernige
Granulozyten
0-4 0-4 0-6 3-5 segmentkernige
Granulozyten
55-75 60-78 45-70 50-70
Lymphozyten 12-30 15-38 20-45 25-40
Monozyten 0-4 0-4 0-5 2-6 eosinophile
Granulozyten
0-6 0-6 0-4 2-6 basophile
Granulozyten bis 1 bis 1 0-2 0-1
absolute Zellzahl /µL /µL /µL /µL
stabkernige Granulozyten
0-500 0-600 0-600 120-450 segmentkernige
Granulozyten 3000-9000 3000-11000 3000-7000 2000-6300 Lymphozyten 1000-3600 1000-4000 1500-4000 1000-3600 Monozyten 40-500 40-500 40-400 80-540 eosinophile
Granulozyten
40-600 40-600 40-350 80-360 basophile
Granulozyten bis 40 bis 40 0-150 0-90
2.1.2 Phänotypische Eigenschaften neutrophiler Granulozyten
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten exprimieren an ihrer Oberfläche zahlreiche Moleküle, die entsprechend ihrer Antigenstruktur und Funktion bezeichnet werden.
Darüber hinaus kommen Oberflächenmoleküle bei Interaktionen mit anderen Zellen zum Tragen.
RÖNSCH (1992) teilt die Oberflächenstrukturen von Leukozyten in drei funktionelle Gruppen ein:
1) Antigenspezifische Rezeptormoleküle.
Sie finden sich auf der Oberfläche von Lymphozyten und vermitteln die Antigenerkennung.
Bei Granulozyten kommen sie nicht vor (RÖNSCH 1992).
2) Die Transplantationsantigene („major histocompatibility complex“, MHC).
Literaturübersicht
Sie werden auf allen kernhaltigen Zellen des Körpers außer auf Spermien gefunden. Durch die Präsentation endogener Antigene ermöglichen sie T-Zellen die Unterscheidung zwischen körpereigenen und –fremden Proteinen sowie zwischen gesunden und entarteten Strukturen. MHC-Klasse-I-Moleküle werden innerhalb einer Spezies polymorph, innerhalb eines Individuums aber konstant exprimiert (SCHUBERTH et al. 1991). Dagegen kommen MHC-Klasse-II-Moleküle in der Regel konstitutiv nur auf monozytären Zellen und B- Lymphozyten vor. PMN können jedoch zu einer Expression angeregt werden. MHC-II- Moleküle präsentieren den T-Zellen vornehmlich extrazellulär aufgenommene Proteinsequenzen.
3) Differenzierungsantigene (CD-Moleküle).
Beim Menschen sind bisher über 260 verschiedene Differenzierungsantigene bekannt. Die Expression von Oberflächenmolekülen und deren Dichte auf der Zelloberfläche wird durch zelluläre Kontakte und humorale Faktoren reguliert. Sie werden je nach Funktion auf allen Zellen in unterschiedlicher Menge und Zusammensetzung exprimiert. Sie ermöglichen eine genauere Differenzierung von Zellpopulationen als es aufgrund morphologischer Charakteristika möglich ist. Der Nachweis von Differenzierungsantigenen findet in diesem Fall über monoklonale Antikörper (mAk) statt. Aufgrund des Reaktionsverhaltens von mAk gegenüber Zelloberflächenmolekülen werden diese einem „Cluster of differentiation“ (CD) zugeordnet (SCHUBERTH et al. 1991).
Unter den Differenzierungsantigenen sind für PMN v.a. funktionsassoziierte Oberflächenmoleküle, beispielsweise bei der transendothelialen Migration von Bedeutung.
Dieser Prozess kann nur unter Beteiligung der sogenannten CD11a/18-Integrine der PMN ablaufen. Diese Membranstruktur wird auch Leukozyten-Funktionsassoziiertes-Antigen (LFA-1) genannt. Dieses stellt ein Adhäsionsmolekül dar, welches an das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 („intercellular adhesion molecule“, ICAM-1), das auf aktivierten Endothelzellen exprimiert werden kann, bindet. CD11b bildet zusammen mit CD18 den Komplementrezeptor-3 (CR-3 oder Mac-1), der an der Extravasation und an der Vermittlung der Phagozytose und der ROS-Bildung der PMN beteiligt ist (SMITH 1993, ROITT et al. 1995). Die gleichen Funktionen erfüllt auch der Komplementrezeptor-4 (CR- 4), der aus der Zusammensetzung von CD11c und CD18 entsteht (ROITT et al. 1995).
Literaturübersicht
20
Bei der Leucocyte adhesion protein deficiency Typ I (LAD I), einer autosomal oder x- chromosomal rezessiv vererbten Erkrankung (GIGER et al. 1987, TROWALD-WIGH et al.
1993), kommt es zu einer verminderten oder sogar vollkommen ausbleibenden Exprimierung von Oberflächenantigenen der ß2-Integrinfamilie, wie LFA-1 und Mac-1.
Verursacht wird der genetische Defekt durch Punktmutation in der Codierungsregion ITGB2 von CD18, also der ß-Untereinheit der Integrine (ARNAOUT et al. 1990, KIJAS et al. 1999). Der Typ I dieser Erbkrankheit ist bisher bei Mensch (LAD I) (ARNAOUT et al.
1985, 1990, 1990a), Rind (BLAD) (MULLER et al. 1994, GERARDI 1996, MEYLAN et al. 1997) und Hund (CLAD) (GIGER et al. 1987, KIJAS et al. 1999, TROWALD-WIGH et al. 1992, 1993, 2000) beschrieben. Da keine funktionsfähigen CD18-abhängigen Oberflächenmoleküle ausgebildet werden, ist die Adhäsion der PMN an Endothelzellen und somit ihre Extravasation gestört (SMITH und ANDERSON 1991).
Die Aktivierung von Granulozyten durch Entzündungsmediatoren oder chemotaktische Substanzen führt zu einer Verminderung oder Erhöhung der Expressionsdichte von Oberflächenmolekülen. Da durch die Modulation membranständiger Strukturen die Funktionalität von Zellen beeinflusst werden kann, besitzt der Nachweis von Oberflächenmolekülen diagnostische Bedeutung (RÖNSCH 1992). Der Nachweis kann mittels fluorochromkonjugierter monoklonaler Antikörper unter Verwendung von immunzytochemischen (ELISA, „enzyme-linked immunosorbent assay“), fluoreszenzmikroskopischen oder durchflusszytometrischen Methoden geführt werden (GUIDRY et al. 1992, LOHMEYER et al. 1994, MAGYAR et al. 1995).
2.1.3 Funktionelle Eigenschaften neutrophiler Granulozyten 2.1.3.1 Extravasation und Chemotaxis
Die Wanderung von Leukozyten aus dem Blutgefäß heraus bezeichnet man als Extravasation (JANEWAY und TRAVERS, 1997). Dieser Prozess kann entweder durch die PMN selbst oder durch die Gefäßendothelzellen des betroffenen Gewebes in Gang gebracht werden (ZIMMERMAN et al. 1992, HOGG 1992).
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Unter Chemotaxis versteht man die gerichtete Bewegung von Zellen entlang eines Konzentrationsgradienten bestimmter chemoattraktiver Faktoren. Das können z.B.
Komplementkomponenten (z.B. C3a und C5a), von lokalen Zellen sezernierte Zytokine (z.B. Interleukin-8, IL-8), bakterielle Toxine oder endogene Pyrogene (z.B.
Lipopolysaccharide, LPS) sein, die u.a. PMN aus dem Kapillarsystem ins betreffende Gebiet locken. Die PMN reagieren auf diese Signale, indem sie ihre Expression von Adhäsions-vermittelnden Oberflächenmolekülen ändern. Dadurch kommt es zu reversiblen Anheftungen der PMN an die stimulierten Endothelzellen. So wird die Wirkung der angreifenden Scherkräfte gemindert und die Granulozyten rotieren durch die reversible Adhäsion langsam an der Epithelwand entlang („rolling“). Nach JANEWAY und TRAVERS (1997) wird dieser Vorgang dabei durch LTB4, C5a und Histamin-aktivierte P- Selektine ausgelöst, die in Granula von Epithelzellen (Weibel-Palade-Körperchen) enthalten sind. Die Expression von P-Selektinen läuft innerhalb weniger Minuten ab, wohingegen die auch beteiligten E-Selektine erst Stunden nach der Interaktion mit TNF-α oder LPS aktiv werden (NORMAN et al. 1995). Die Selektine erkennen Kohlenhydratepitope bestimmter Glykoproteine auf Leukozyten (JANEWAY und TRAVERS 1997). Nachdem die Leukozyten durch das „rolling“ an Geschwindigkeit verloren haben, kommt es zur Adhärenz, wobei besonders Leukozytenintegrine (CD11a/CD18 (LFA-1 (Leukozyten-Funktionsassoziertes-Antigen 1)) und CD11b/CD18 (CR3 oder Mac-1)) und L-Selektin eine wichtige Funktion übernehmen. IL-8 ruft Konformationsänderung von LFA-1 und CR3 hervor und erhöht damit deutlich die Affinität dieser Moleküle für ihre Liganden. Die nun feste Bindung mit Oberflächenstrukturen der Gefäßendothelzellen (z. B. ICAM-1 (interzelluläres Adhäsionsmolekül)) führt zur Diapedese der PMN durch die Endothelwand. Diese wird wiederum durch die Leukozytenintegrine und durch das immunglobulinähnliche Molekül PECAM (platelet endothelial cell adhesion molecule, CD31) vermittelt. Letzteres wird sowohl von Endothelzellen als auch durch Leukozyten exprimiert (JANEWAY und TRAVERS 1997). Diapedese findet zwischen den Kontaktstellen von 3 Endothelzellen („tricellular corners“) statt. Die PMN durchstoßen die Basalmembran mit Hilfe proteolytischer Enzyme (JANEWAY und TRAVERS 1997, FRANK 2000). Beim Kontakt des an der Phagozytenoberfläche sitzenden LRI (Leukocyte-Response-Integrin) mit dem
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Basalmembranprotein Eutactin kommt es zur weiteren Aktivierung der Granulozyten. Das mit LRI vergesellschaftete IAP (Integrin-Associated-Protein) fungiert als Ca2+-Kanal. Bei Kontakt erfolgt ein starker intrazellulärer Ca2+-Anstieg. Die PMN zeigen eine erhöhte Phagozytoseaktivität und einen gesteigerten O2-Stoffwechsel (EICKHOFF 2002).
Im Gewebe reagieren die neutrophilen Granulozyten auf chemotaktische Botenstoffe.
Hierbei kommt es zu einer Bindung des Mediators mit einem heptahelikalen, G-Protein gekoppelten Leukozytenoberflächenrezeptor für Chemoattraktoren. Über das G-Protein wird abhängig vom Mediator eine spezielle Enzymkaskade aktiviert, die ihrerseits eine stimulierende Wirkung auf die Migration, Adhärenz oder Loslösung der Zelle sowie die Verformung des Zytoskeletts der Leukozyten besitzt (BOKOCH 1995).
2.1.3.2 Phagozytose
Seit der Entdeckung der Phagozytose durch METCHNIKOFF (1884) wird diesem zellulären Mechanismus eine primäre Funktion im Rahmen des unspezifischen Immunsystems zugeschrieben. Als Phagozytose bezeichnete er die Aufnahme und Verdauung von Mikroben durch wandernde Mesodermzellen. Heutzutage wird dieser Begriff etwas anders gefasst und steht hauptsächlich für die Aufnahme körperfremder Partikel, mutierter oder abgestorbener eigener Zellen und Mikroorganismen durch bestimmte Körperzellen – den Phagozyten (KWON 1987).
Die neutrophilen Granulozyten wandern solange im Gewebe gegen Konzentrationsgradienten chemotaktischer Faktoren, bis sie die zu eliminierenden Partikel erreichen und neutralisieren (ROITT 1988). Meistens sind diese Partikeln Bakterien. Viele Mikroorganismen verfügen über Oberflächenstrukturen, die die Anheftung der Phagozyten erschweren. PMN verfügen dagegen über Rezeptoren für opsonisierte Zellen oder Partikel.
Die Opsonine stellen eine Verbindung zwischen den spezifischen Rezeptoren der Phagozyten her. Man unterscheidet 3 Klassen von Opsoninen: Immunglobuline vom Typ IgG, die an Fcγ-Rezeptoren der PMN binden, Spaltprodukte der Komplementkaskade (z.B.
C3b, iC3b, C4b), die von den korrespondierenden Komplementrezeptoren der PMN erkannt werden (hier CR1, CR3 und CR4), und schließlich membranständige
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Kohlenhydratgruppen auf Mikroorganismen, die seitens der PMN an Lektin-Rezeptoren binden (KLEIN 1991, ZERBE 1994).
Das an der Opsonisierung der Erreger beteiligte Komplementsystem wird meist über den sogenannten alternativen Weg aktiviert. Hierbei kommt es direkt zur Spaltung des C3- Faktors in einen kleineren Anteil C3a und den mengenmässig grösseren Teil C3b, welcher sich wegen seiner Instabilität schnell zu iC3b wandelt (TROWALD-WIGH et al. 1993).
Das agierende Enzym C3-Konvertase bindet an der Oberfläche vieler Bakterien, so dass dort große Mengen von C3b und iC3b entstehen. Es kommt zu einer Komplexbildung zwischen C3b und dem weiteren Komplementfaktor C5. Der instabile C5- Komplementfaktor wird zu C5a und C5b gespalten. C3a und C5a fungieren als effektive Chemotaxine und führen außerdem zu einem erhöhten O2-Stoffwechsel in den PMN, dem sogenannten Respiratory Burst (ROITT 1988, TILL u. THIELMANN 1989). C3b, iC3b und C5b verbleiben an der Bakterienmembran und bilden zum einen zusammen mit den Komplementfaktoren C6, C7, C8 und C9 den Membranangriffskomplex (ROITT 1988, BAUER 1994), welcher zur Lyse der Bakterienzellwand führen kann. Andererseits wirken sie als sogenannte Opsonine und erleichtern somit die Phagozytose durch die Entzündungszellen. Der klassische Weg der Komplementkaskade beginnt mit der Aktivierung des Komplementfaktors C1q durch Immunkomplexe von IgM oder geeigneten IgG-Isotypen und Mikroorganismen. Über die Aktivierung verschiedener Faktoren mündet dieser Weg auch in die Spaltung des Faktor C3 und verläuft dann weiter wie der alternative Weg (ROITT 1988, BAUER 1994). Das u.a. durch IL-1-Einfluss vermehrt in der Leber produzierte CRP (C-reaktives Protein), welches zur Familie der akuten Phase-Proteine gezählt wird, bindet an der Oberfläche zahlreicher Bakterien und Pilze (ROITT 1988, TILL u. THIELMANN 1989, BAUER 1994). Dies führt wiederum zu einer verstärkten Bindung von Komplement und ist somit phagozytosefördernd (TILL u. THIELMANN 1989). Die Anlagerung der PMN an opsonisierende Komplementfaktoren oder Antikörper erfolgt durch spezifische C3b- (CR1), C3bi- (CR3 oder CR4) (ARNAOUT 1990b, TROWALD- WIGH et al. 1993, BAUER 1994) und Fc-Rezeptoren (FcγRII, FcγRIII) der Phagozytenmembran (TROWALD-WIGH et al. 1993, BAUER 1994) und macht die nachfolgende Aufnahme der Erreger effizienter. Man spricht von einer opsonisierenden Adhärenz.
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Wurde ein Antigen über Rezeptoren der Granulozytenmembran fixiert, beginnt der Vorgang der Ingestion. Vorraussetzung ist, dass die Phagozytoseobjekte nicht zu groß sind. Ein Partikeldurchmesser von 1 µm oder auch mehr (etwa 10% des PMN- Durchmessers) lässt eine Phagozytose zu (DONNELLY et al. 1987, KLEIN 1991). Die PMN-Membran bildet unter Aktivierung von intrazellulären Aktin- und Myosinfilamenten Pseudopodien, die das zu inkorporierende Material becherartig umschließen und als Vakuole in die Zelle aufnehmen (ENGELKE 2000). Diese als Phagosomen bezeichneten Vakuolen verschmelzen im Zellinneren mit den zytoplasmatischen Lysosomen, die als Granula der PMN viele verschiedene zytotoxische Enzyme enthalten, zu den Phagolysosomen. Die Lysosomen werden in primäre und sekundäre Granula unterteilt. Die primären Granula enthalten Lysozym, Myeloperoxidase und Proteinasen. Dagegen beinhalten die sekundären Granula u.a. Laktoferrin und Kollagenasen, die im Phagolysosom auf das phagozytierte Antigen einwirken (GEMSA et al. 1991, LONNERDAL und IYER 1995). Die unverdaulichen Spaltprodukte der durch Enzymeinwirkung abgetöteten Bakterien werden exozytiert oder sammeln sich im Granulozyten an und können dessen Absterben bedingen (KLEIN 1991). Zerfallsprodukte lysierter Bakterien und PMN wiederum dienen als Entzündungsmediatoren und fördern die weitere Rekrutierung von PMN aus dem Blutstrom sowie deren Aktivierung (GEMSA et al. 1991).
2.1.3.3 Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
Ein weiterer Mechanismus, durch den sowohl phagozytierte als auch Noxen außerhalb des Granulozyten geschädigt werden, ist die Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten (reactive oxygen species, ROS).
Bereits die Anheftung opsonisierter Antigene an die Zelloberflächenrezeptoren der PMN verursacht Membranveränderungen und induziert damit biochemische Reaktionen. Diese führen u.a. zur Bildung einer Reihe mikrobizider Substanzen, die den PMN zur Infektionsabwehr zur Verfügung stehen. Darüber hinaus wird das phagozytierte Material in den Phagolysosomen zersetzt. Zu den angesprochenen Substanzen gehören antimikrobielle
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Proteine (u.a. Defensine), Enzyme (z.B. Lysozym), Kompetitoren (z.B. Laktoferrin), Stickstoffoxide (NOx) und reaktive Sauerstoffmetaboliten (H2O2, O2˙¯ etc). Die Bildung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erfolgt nach entsprechender Stimulation in einer explosionsartigen Kaskade, dem sogenannten „respiratory burst“ (auch „metabolic burst“,
„oxidative burst“). Dabei kommt es zu einer erhöhten Aktivität der membranständigen NADPH-Oxidase, dem Schlüsselenzym der Sauerstoffradikalbildung von Granulozyten (KWON 1987, TILL u. TIELMANN 1989). Diese Flavinoxidase katalysiert die Reduktion von molekularem Sauerstoff (O2) zum Superoxidanion (O2˙¯). Es führt dann weiter durch Radikal-Kettenreaktionen zur Produktion anderer ROS. Spontan (z.B. unter Einwirkung des sauren Milieus) oder durch Enzyme katalysiert (Superoxid-Dismutase) wird dieses schwach toxische Superoxidanion (O2˙¯) in Hydroxylradikale (OH˙), Peroxid-Anionen (OH¯) (jeweils hochreaktive Radikale), atomaren oder Singulet-Sauerstoff (1O2) (potentes Oxidationsmittel) sowie in Wasserstoffperoxid (H2O2) überführt (KWON 1987, ROITT 1988, TILL u. THIELMANN 1989). Es handelt sich bei diesen um hochreaktive, keimtötende Agenzien, die Enzyme oder Membranbestandteile oxidieren und somit funktionell inaktivieren können (KLEBANOFF 1980, KWON 1987).
Unter Einfluss der lysosomalen Myeloperoxidase bilden H2O2 und Halogenionen wie Cl-, J- oder Br- ein stark antimikrobiell wirkendes Halogenierungssystem. Die entstehenden Halogensäuren führen zu einer Halogenierung und damit zur Schädigung der Membranen des aufgenommenen Materials. Außerdem katalysiert die Myeloperoxidase durch H2O2
induzierte oxidative Decarboxylierung und Abspaltung membranständiger Aminosäuren und Peptide (KWON 1987, TILL u. THIELMANN 1989). Die entstehenden O2- Metaboliten haben alle stark zytotoxisches Potential.
Die respiratorische Entladung kann aber auch unabhängig von der Phagozytose durch andere Wechselwirkungen der Zelle mit Stimulanzien ausgelöst werden. Die Bindung von Antikörpern an den Fcγ-Rezeptoren der PMN (JANEWAY und TRAVERS 1997) sowie von komplementopsonisierten Bakterien an den Komplementrezeptoren oder die Ankopplung anderer Zellen über die Adhäsionsmoleküle CD11b/18 kann ebenso zu einer ROS-Ausschüttung führen (GOODMAN et al. 1995, RUIZ et al. 1995), wie der Kontakt mit Entzündungsmediatoren (z.B. TNFα, JANEWAY et al. 2002). Neben PMN können
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mit geringerer Kapazität auch eosinophile Granulozyten, Monozyten sowie Makrophagen ROS bilden (GEMSA et al. 1991).
Oft kommt es durch systemische Erkrankungen des Organismus zu sekundär bedingten Störungen der Granulozytenfunktion. Primäre Störungen der Granulozyten sind äußerst selten (STICKLE 1996). Bei der myeloischen Leukämie des Menschen z.B. zeigen die Tumorzellen einen verminderten Gehalt an NADPH-Oxidase (TAICHMAN 1994), dem wohl wichtigsten Enzym bei der ROS-Bildung. Eine verminderte Bildung von Sauerstoffradikalen zeigen ebenfalls die PMN HIV infizierter Patienten (LAFRADO et al.
1989). Auch therapeutische Behandlung mit Glukokortikoiden oder längerbestehende, stressbedingte Ausschüttung von Cortisol kann zu einer gestörten Funktion der PMN führen. Einen hemmenden Einfluss auf die reaktiven Sauerstoffradikale haben Glukokortikoide (FUKUSHIMA et al. 1990, SALAK et al. 1993, HOEBEN et al. 1998).
Neben den Glukokortikoiden zeigen vereinzelt Vertreter der Antibiotika, wie Ceftiofur oder Oxytetracyclin, über eine Interaktion mit dem Myeloperoxidase-Komplex einen hemmenden Einfluss auf die bakterizide Wirkung der reaktiven Sauerstoffspezies (HOEBEN et al. 1997a, HOEBEN et al. 1997b).
2.1.3.3.1 Die in-vitro-Beurteilung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
Für die Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wurden verschiedene Verfahren, wie die Erfassung der Lichtemission über Photonenverstärker oder die photometrische Darstellung von oxidativen Reaktionsprodukten eingesetzt.
Bei dem erstgenannten Verfahren wird entweder direkte (low level) Chemilumineszenz durch Singulett-Sauerstoff erfasst (ALLEN 1977) oder PMN werden nach Stimulation zur nativen Chemilumineszenz angeregt. Diese wird durch Indikatoren wie Luminol oder Lucigenin verstärkt und damit messbar (MÜLLER-PEDDINGHAUS 1984). Dabei ist die Chemilumineszenz ein Maß für die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid (H2O2), kenntlich gemacht durch Luminol, bzw. für die Menge an Superoxidanion (O2˙¯), verstärkt durch Lucigenin (KWON 1987).
Für die photometrische Bestimmung von Superoxidanion (SCHLOBACH 1988, CHACIN et al. 1990) oder Wasserstoffperoxid (ROTH und KAEBERLE 1981) ist der sogenannte
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Nitroblau-Tetrazolium-(NBT)-Reduktions-Test sehr bekannt. Das Prinzip beruht darauf, dass NBT vom gelben Redoxfarbstoff bei der Aufnahme in aktive PMN zu blauem Formazan reduziert wird. Dieses kann durch organische Lösungsmittel gelöst und dann photometrisch quantifiziert werden.
In jüngster Zeit kommen zunehmend durchflusszytometrische Messverfahren zur Anwendung (BASS et al.1983, MÜLLER-PEDDINGHAUS 1987, ROTHE et al.1988, SZEJDA et al.1984, TRINKLE et al.1987). Dabei beruhen alle auf demselben Prinzip. Ein nicht fluoreszierendes Substrat wird in aktivierten Zellen unter Einfluss der dort gebildeten reaktiven Sauerstoffmetaboliten zu einem fluoreszierenden Farbstoff umgewandelt (EICKHOFF 2002). Die entstehende Fluoreszenz kann im Durchflusszytometer quantitativ gemessen werden. Dabei kann sowohl der Prozentanteil der fluoreszierenden und damit ROS-bildenden Zellen, als auch die mittlere Fluoreszenzintensität der einzelnen Zellen ermittelt werden. Als erstes mögliches Substrat wurde 2`,7`-dihydrochlorofluoreszindiacetat (DCFHDA) verwendet (BASS et al. 1983) und ist auch bei neueren Untersuchungen noch häufig im Gebrauch (SZEJDA et al. 1984, RYAN et al. 1990, VUORTE et al. 1996, SMITS et al. 1997, RAIDAL et al. 1998). Das stabile, nichtfluoreszierende, unpolare DCFHDA kann durch die Plasmamembran der PMN diffundieren. Im Inneren der Zellen kommt es durch Esterasen zur Abspaltung der Acetylgruppe (RYAN et al. 1990). Das entstehende Dichlorofluoreszin (DCFH) ist jetzt polar und kann die Zelle nicht mehr verlassen. Bei Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffprodukten wird das nicht fluoreszierende DCFH schnell zum grünfluoreszierenden Dichlorofluoreszein (DCF) oxidiert (SZEJDA et al. 1984).
Vereinzelt wird als Substrat Dihydroethidium (DHE) verwendet. Durch Oxidation entsteht das rotfluoreszierende Ethidiumbromid (EB) (PERTICARARI et al. 1991, LEHMANN et al. 1998).
Die praktikabelste durchflusszytometrische Methode zur Bestimmung intrazellulärer ROS- Bildung wurde von EMMENDÖRFFER et al. (1990) entwickelt. ZERBE et al. (1996) etablierte diese Methode für bovine PMN. Dabei wird der Gehalt an Wasserstoffperoxyd in einer Zellsuspension als Maß für die ROS-Bildung mittels einer Myeloperoxidase- abhängigen Oxidation von nichtfluoreszierenden Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) zum grünfluoreszierenden Metaboliten Rhodamin 123 durchflusszytometrisch erfasst. Rhodamin
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123 emittiert nach Anregung durch den Argon-Ionen-Laser (488 nm) Licht im grünen Bereich von 534 nm. Dihydrorhodamin 123 stellt im Vergleich zu DHE und DCFHDA ein viel sensitiveres Substrat dar und wird deshalb öfter eingesetzt (ROTHE et al. 1988, VOWELLS et al. 1995, SMITS et al. 1997, LEHMANN et al. 1998).
2.1.3.4 Zytotoxizität
Unter der zellvermittelten Zytotoxizität versteht man die Zerstörung von Zielzellen (z.B.
körperfremde Zellen, infizierte und körpereigene entartete Zellen) durch Effektorzellen, wie zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen. Auch PMN können zytotoxische Effekte ausüben, indem sie zytolytische Enzyme und reaktive Sauerstoffmetabolite ihrer Granula extrazellulär freisetzen. Dadurch werden die Zielzellen geschädigt. Dieser als zellvermittelte Zytotoxizität bezeichnete Prozess kann unter Vermittlung von Antikörpern (ADCC, antibody dependent cellular cytotoxicity), aber auch ohne diese (AICC, antibody independent cellular cytotoxicity) stattfinden.
2.2 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr
PMN gehören zum unspezifischen zellulären Teil des Immunsystems, d.h. sie verfügen über kein immunologisches Gedächtnis und benötigen keine Spezifität gegenüber Antigenstrukturen (KWON 1987). Sie erscheinen als erste Immunzellen am Ort eines Infektionsgeschehens (LEHRER et al. 1988).
Nach ihrer Bildung im Knochenmark werden sie in den Blutstrom abgegeben, in dem sie nur wenige Stunden zirkulieren (WECKER 1990, KLEIN 1991). Aus dem Blut wandern sie durch amöboide Bewegung vornehmlich in Regionen, welche stark den Angriffen durch Mikroorganismen oder Fremdstoffe von außen ausgesetzt sind, wie Haut und Schleimhäute von Respirationstrakt, Magen-Darm-Trakt, Harn- und Reproduktionstrakt und Augen, und schützen den Organismus dort durch ihre Abwehrtätigkeit vor diesen Eindringlingen (da SILVA et al. 1994). Dabei phagozytieren Granulozyten Erreger und Zelldetritus abgestorbener Zellen. Inaktivierert werden Pathogene mit Hilfe reaktiver Sauerstoffmetabolite und bakterizider lysosomaler Enzyme/Polypeptide nach
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Verschmelzung der Phagosomen mit den Lysosomen zu Phagolysosomen (CASSATELLA 1996).
Aber PMN erweisen sich nicht nur als reine „Entsorger“ von Fremdorganismen.
Neben den direkten Interaktionen der PMN mit Fremdorganismen ist auch deren Freisetzung von Zytokinen ein wichtiger Beitrag zur Immunantwort. Nach LLOYD und OPPENHEIM (1992) werden PMN durch verschiedene Mediatoren (Lipopolysaccharide (LPS), IL-1, IL-2, Tumornekrosefaktor (TNF) oder GM-CSF) zur Produktion und Freisetzung von Zytokinen stimuliert. Immunregulatorisch wird durch die aktivierten PMN über lösliche molekulare Botenstoffe auf andere PMN (u.a. IL-1, IL-6, IL-8, G-CSF u. GM- CSF), B-Zellen (IL-6), T-Zellen (IL-1, TNF u. IL-6) und auf das Monozyten-Makrophagen- System (IL-1, TNF, Makrophagen-Wachstumfaktor (M-CSF) und GM-CSF) Einfluss genommen. Über die Fähigkeit, aktivierungsabhängig Zytokine und Chemokine zu sezernieren, beeinflussen PMN unmittelbar auch Mechanismen der adaptiven Immunantwort (CASSATELLA 1999).
Die große Bedeutung von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten vor allem für die Abwehr von bakteriellen Infektionen wird bei Individuen deutlich, deren PMN eine verringerte funktionelle Kapazität aufweisen. Das erbliche Krankheitsbild der humanen septischen Granulomatose (CGD, chronic granulomatous disease), das in der Herabsetzung der ROS-Bildungskapazität durch neutrophile Granulozyten begründet ist, löst typischerweise wiederkehrende pyogene Erkrankungen des Patienten aus (MA et al. 2000).
Weiterhin wiesen BRENNEIS et al. (1993) bei etwa einem Viertel der untersuchten humanen Patienten mit wiederkehrenden Infektionen eine verminderte ROS-Bildung oder eine verminderte Chemotaxis von PMN nach.
Eine Abnahme der Verfügbarkeit und eine reduzierte Funktionsfähigkeit der neutrophilen Granulozyten ist also mit einer abnehmenden Immunkompetenz und einer ansteigenden Zahl von den Körper heimsuchenden Infektionen verbunden (da SILVA et al. 1994).
Materialen und Methoden
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3 Material und Methoden
3.1 Geräte und Materialien
3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf Geräte
Aqua dest. Aufbereitungsanlage
„SG Umkehr-Osmose Anlage Typ RO 50/14 SMB TypI“
Fa. Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel
Aqua tridest. Aufbereitungsanlage
„SG Reinstwasser System Typ SG-RS 90-4 UF“
Fa. Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel
Autoklav „Typ GE406“ Fa. Getinge AB, Getinge, Schweden Brutschrank mit CO2-Begasung
„Typ BK5060E“
Fa. Heraeus-Christ (26146040), Hanau Bunsenbrenner mit automatischer Zündung
„gasprofi1“
Fa. Wartewig (6.001.000), Göttingen CO2-Flasche zur Sterilfiltration Fa. Kohlensäurewerk Hannover,
Hannover Durchflusszytometer mit Computereinheit
„Typ FACSCalibur®“
Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Einmal-Filter, 0,2 µm Fa. Renner (06001), Dannstadt Eismaschine „Typ UBE 30-10“ Fa. Ziegra, Isernhagen
Feuchte Kammer (Plastikbox mit Gittereinsatz)
Einzelhandel Fluoreszenzmikroskop mit Ploemiluminator
und Phasenkontrasteinrichtung Okular: Kpl 10xW
Objektive: Ph2 Neofluar 16/0,40 Ph2 Neofluar 40/0,75 Planneofluar 63 x/1,25; Öl Filtereinsatz 09: Erregerfilter 450-490 nm Farbteiler 510 nm
Sperrfilter 520 nm
Fa. Zeiss (476250-9901), Oberkochen
Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ Fa. Heraeus, Hanau
Materialen und Methoden
Invertmikroskop Okular: CPL W 10x/18
Objektive: Ph1-F-LD 20/0,25 Ph1 10/0,22
Fa. Zeiss (471202-9901), Oberkochen
Kühlschrank mit Gefrierfach (–20°C) Einzelhandel
Laborfeinwaage „B6“ Fa. Mettler, Zürich, Schweiz Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ Fa. Knick, Berlin
Laborwaage „BL310“ Fa. Sartorius, Göttingen Magnetrührer mit Heizplatte „IKAMAG®RH“ Fa. Janke u. Kunkel, Staufen
Pinzette, gebogen, anatomisch Fa. Eickemeyer (170710), Tuttlingen Pipette, einstellbar „Transferpette®“ (2-20 µL) Fa. Brand (09U2539), Wertheim Pipetten, einstellbar „pipetman“
(100-1.000 µL, 20-200 µL, 10-100 µL, 1- 20 µL)
Fa. Gilson, Villers Le Bel, Frankreich
Pipettierhilfe „accu-jet®“ Fa. Brand (26404), Wertheim Röhrchen-Schüttler „Typ Reamix“ Fa. ASID, Unterschleißheim Röhrchen-Schwenker „Typ Automix“ Fa. ASID, Unterschleißheim Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69
Microshaker“
Fa. Dynatech, Zug, Schweiz Schere, rostfrei Fa. Fisher Scientific (9204013),
Schwerte Schlauchpumpe zum Absaugen von
Flüssigkeiten „Rumo100“
Fa. Heidolph (52100), Schwabach Sterile Werkbank, „Heraeus Lamin Air®
HLB 2472“
Fa. Heraeus-Christ, Hanau Wasserbad mit Temperaturregelung Typ
1003
Fa. GFL Hannover, Hannover Zellzählkammer nach Bürker Fa. Brand, Wertheim
Zentrifugen
Kühlzentrifuge „Varifuge K Typ 4500“ Fa. Heraeus-Christ, Osterode Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ Fa. Hermle, Gosheim
Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ Fa. Heraeus-Christ, Osterode Klinikbedarf
Butterfly-Kanüle „Micro-FloTM“
21GA 0,8 mm
Fa. Industria Biomedica (AS2102), Mailand, Italien
Einmalspritze Luer 10 mL Fa. AMEFA (302020), Limburg Einmalspritze Luer 50 mL „Plastipak®“ Fa. Becton Dickinson (300865),
Drogheda, Irland
Einmalspritze Luer 5 mL Fa. AMEFA (302010), Limburg
Einmal-Untersuchungs-Handschuhe „Gentle Fa. Meditrade® (1221R), Kiefersfelden
Materialen und Methoden
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Skin® sensitive“
Kanülen 1,8 x 40 mm „TSK STERIJEKT“ Fa. TSK Tochigi, Japan Kanülen 1,0 x 100 mm „TSK STERIJEKT“ Fa. TSK Tochigi, Japan
Staugurt zur Blutentnahme beim Menschen Fa. Medicalis (31001), Garbsen Staukette nach Witte Fa. Eikemeyer (442015), Tuttlingen Vacutainer® Brand Luer Adapter Fa. Becton Dickinson (367300),
Heidelberg
Vacutainer-Kanülen Fa. Becton Dickinson (360215), Heidelberg
Vacutainer® Systems, Halter Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Vacutainer®-Röhrchen (10 mL)
mit EDTA-K2 (18 mg)
Fa. Becton Dickinson (367525), Heidelberg
Laborbedarf
Combitips biopur, 1,25 mL Fa. Becton Dickinson (38161024), Heidelberg
Combitips plus, 0,5 mL Fa. Eppendorf (0030069.420), Hamburg Combitips plus, 2,5 mL Fa. Eppendorf (0030069.447), Hamburg Eppendorf-Reaktionsgefäß mit Deckel
0,5 mL
Fa. Sarstedt (72699), Nürnbrecht Eppendorf-Reaktionsgefäß mit Deckel
1,5 mL
Fa. Greiner (616201), Frickenhausen Filter 0,22 µm
„Sartobran-PH Capsule Sartobran®“
Fa. Sartorius (5231307H7SOB), Göttingen
Händedesinfektionsmittel „Sterilium®“ Fa. Bode Chemie (669), Hamburg Laborflaschen mit Gewinde, 100 mL,
500 mL und 1.000 mL
Fa. VWR international, Hannover Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 96-Loch,
Rundboden, steril, Polystyrol
Fa. Techno Plastic Products TPP®, Trasadingen, Schweiz,
bezogen von Biochrom (P92970), Berlin Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden,
unsteril, Polystyrol
Fa. Greiner (650101), Frickenhausen Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden,
unsteril, Polystyrol
Fa. Nerbe Plus (10.101.0000), Winsen/Luhe
Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden, steril, Polypropylen
Fa. Greiner (650261), Frickenhausen Mikrotiterplatten, 96 Well, Non-Binding
Surface Plates
Fa. Corning (3604), Wiesbaden
Multipette® pro Fa. Eppendorf (4985000.013), Hamburg
Papier, saugfähig Einzelhandel
Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas Fa. Brand (747720), Wertheim
Materialen und Methoden
Pipettenspitzen „Plastibrand®“ 0,5 µL- 20 µL
Fa. Brand (702565), Wertheim Pipettenspitzen, blau und gelb Fa. Sarstedt (70/762002 und
70/760002), Nürnbrecht Röhrchen für die Durchflusszytometrie
(FACS-Röhrchen), 5 mL, Polystyrol
Fa. Becton Dickinson (352008), Heidelberg
Röhrchen für die Durchflusszytometrie (FACS-Röhrchen), 5 mL, Polypropylen
Fa. Sarstedt (55.1578), Nürnbrecht Röhrchen, 15 mL, Polypropylen Fa. Corning (430791), New York, USA Saugpipetten (10 mL) Fa. Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht Tesafilm-Klebeband Einzelhandel Tiegelzange 400 mm Fa. Fisher Scientific (9310240),
Schwerte Zellkulturflaschen, 200 mL
„NunclonTMdelta Surface“
Fa. NuncTM (156499), Wiesbaden Zentrifugenröhrchen, 50 mL, steril,
Polypropylen
Fa. Corning (430829), New York, USA
3.1.2 Reagenzien und andere Verbrauchsmaterialien
Acridinorange Fa. Sigma-Aldrich (A6014), Steinheim Bovines Serumalbumin (BSA), Fraktion V,
98%
Fa. Roth (8076.2), Karlsruhe Cy™5-Esel-anti-Maus Antikörper IgG,
schwere und leichte Ketten Cy™5-DαM IgG (H+L)
Fa. Dianova (715175150), Hamburg
Desinfektionslösung Helipur H Plus Fa. Tierärztebedarf Lehnecke (2390082), Schortens
Dextran T 500 Fa. Roth (9219.1), Karlsruhe
Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) (Molekulargewicht: 346,38 g/mol)
Fa. MoBiTec (D632), Göttingen Dimethylsulfoxid (DMSO) Fa. Sigma (D5879), Steinheim Dulbecco's Modified Eagle's Medium
(DMEM) (Trockensubstanz)
Fa. Biochrom (T-043-10), Berlin
Ethanol, absolut Fa. J.T. Baker (8228), Deventer, Holland Ethidiumbromid Fa. Sigma (E8751), Steinheim
Ethylendiamine-Tetraacetat (EDTA) Fa. Sigma (ED2SS), Steinheim Fetales Kälberserum (FCS) Fa. Biochrom (SO 113/431B), Berlin
Feuerzeug Einzelhandel
Materialen und Methoden
34
Ficoll® (Ficoll) Fa. Cytogen (04-60500), Ober-Mörlen Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat Fa. Roth (8175.1), Karlsruhe
L-Glutamin Fa. Biochrom (K0282), Berlin
Natriumazid (NaN3), 10%ig Fa. Sigma (S-2002), Steinheim Natriumbicarbonat (NaHCO3) Fa. Biochrom (L1703), Berlin Natriumchlorid (NaCl) Fa. Roth (9265.2), Karlsruhe Natriumhydroxyd-Pellets (NaOH), wasserfrei Fa. Sigma (S-5881), Steinheim Natriumhypochlorit-Lösung 12% Fa. Roth (9062), Karlsruhe Paraformaldehyd Fa. Sigma (P6148), Steinheim PBS Dulbecco, Instant (9,55 g/L,
phosphatgepufferte Salzlösung) (PBS)
Fa. Biochrom (L-182-10), Berlin
PercollTM (Percoll) Fa. Amersham Biosciences (17-0891-01), Freiburg
Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) Fa. Sigma (P-8139), Steinheim
Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) Fa. J.T. Baker (6081), Deventer, Holland To-Pro-3iodide (To-Pro-3) Fa. Molecular Probes (T36-05), Leiden,
Niederlande
Materialen und Methoden
3.1.3 Puffer, Lösungen und Medien Puffer und Lösungen
MIF (Membranimmunfluoreszenz)-Puffer:
BSA NaN3
PBS ad
0,5 0,01 100
g g mL Natriumchloridlösung 0,9%:
NaCl
Aqua tridest. ad
8,77 1.000
g mL Phosphatpuffer (PBS):
(hergestellt aus Trockensubstanz Dulbecco PBS, s. 3.1.2) NaCl
Na2HPO4 x H2O KH2PO4
KCl
Aqua tridest.
HCl / NaOH
ad ad
8 1,24 0,2 0,2 1.000 pH 7,4
g g g g mL Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2xPBS):
Zur Herstellung wurde doppelt soviel Trockensubstanz wie bei PBS eingesetzt und mit Aqua tridest. auf 1.000 mL ergänzt.
HCl / NaOH ad pH 7,4
Alle Puffer wurden für 30 Min. bei 121°C autoklaviert und bei 4°C gelagert.
Medien
Zellkulturmedium DMEM- DMEM-Grundlösung (135,3 g DMEM-
Trockensubstanz [s. 3.1.2] in 10 L Aqua tridest.
gelöst) mit L-Glutamin 2 mmol/L, NaHCO3
18 mmol/L, ohne Zusatz von Antibiotika
Materialen und Methoden
36
3.1.4 Materialien für die Separation, Differenzierung und Vitalitätsbestimmung von Zellen
Acridinorange-Ethidiumbromid
Die bei 4°C gelagerte Gebrauchslösung enthielt 2,5 mg Acridinorange und 2,5 mg Ethidiumbromid (s. 3.1.2), die in 1.000 mL PBS (s. 3.1.3) mit 0,02% NaN3 (s. 3.1.2) gelöst wurden. Die Lösung wurde zur Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung eingesetzt.
Dextran-Lösung
Um eine 3%ige Dextran-Lösung zu erhalten, wurden 3 g Dextran T 500 (s. 3.1.2) in 100 mL sterilem PBS (s. 3.1.3) aufgenommen.
Ficoll®
Ficoll® (s. 3.1.2) ist eine isotone, wässrige Lösung eines hochmolekularen Zuckers mit einem Zusatz Isopaque (ein Röntgenkontrastmittel hoher Dichte), welches bei 10°C eine Dichte von 1,077 g/mL hat. Das kommerzielle Ficoll (s. 3.1.2) wurde unverdünnt verwendet.
Percoll™
Dieses synthetische Sol, bestehend aus Polyvinyl-Pyrrolidon-beschichteten Silikat- partikeln, hat bei 20°C ein spezifisches Gewicht von 1,130 g/mL. In dieser Arbeit wurde 100%iges Percoll (s. 3.1.2) durch Zugabe von kristallinem NaCl (s. 3.1.2; 0,9 g/100 mL Percoll) in einen isotonen Zustand gebracht. Für eine 54, 60, 70 oder 76%ige Endverdünnung wurde die Ausgangslösung mit einer entsprechenden Menge 0,9%iger NaCl-Lösung (s. 3.1.3) versetzt.
Materialen und Methoden
3.1.5 Materialien für die Durchflusszytometrie Aqua tridest. und Natriumhypochlorit
Sterilfiltriertes Aqua tridest. (Porengröße des Sterilfilters: 0,2 µm, s. 3.1.1) und 1%ige Natriumhypochlorit-Lösung (s. 3.1.2) wurden zur Spülung und Reinigung des Messkanal- und Schlauchsystems innerhalb des Durchflusszytometers verwendet.
To-Pro-3iodide (To-Pro-3)
Bei To-Pro-3iodide handelt es sich um einen Fluoreszenzfarbstoff, der nach Laseranregung bei 635 nm (Diodenlaser) zum Emissionsmaximum bei 661 nm Wellenlänge aktiviert wird.
Dieses wird im Fluoreszenzkanal 4 des Durchflusszytometers FACSCalibur© (s. 3.1.1) registriert. Die gelieferte 1mM/L Lösung wurde mit PBS (s. 3.1.3) zu einer 1 µmol/L Gebrauchslösung verdünnt, in 1 mL aliquotiert und bei –20°C lichtgeschützt gelagert. Bei durchflusszytometrischen Messungen enthielt jede Probe eine Endkonzentration von 0,1 µmol To-Pro-3/L.
Trägermedium zur Messung (Sheath fluid)
Das Trägermedium bestand aus mit Hilfe des Filters „Sartobran“ (Porenweite 0,22 µm, s.
3.1.1) sterilfiltriertem PBS (s. 3.1.3) mit 0,1 g/L Natriumazid (s. 3.1.2).
3.1.6 Materialien zur durchflusszytometrischen Bestimmung absoluter Zellzahlen
Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung
Als Referenzzellen wurden Cy™5-markierte (s. 3.1.2) bovine mononukleäre Zellen (MNC) eingesetzt. Diese wurden, wie unter 3.2.3.1 beschrieben, mit Hilfe eines Ficoll- Dichtegradienten mit einer Reinheit von über 98% aus EDTA-Blut gewonnen und in einer Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/mL Sheath (s. 3.1.5) bei 4°C bis zu mehreren Monaten lichtgeschützt gelagert.
Materialen und Methoden
38
Monoklonale Antikörper
mAk Synonym Donor Isotyp Gebrauchs- verdünnung
Art Spezifität
Bo11) 3W-586 Maus IgG1 1:1 ZÜ fast monomorpher Bereich des bovinen MHC-Klasse-I- Moleküls
Abkürzungen: Ig, Immunglobulin; mAk, monoklonaler Antikörper; ZÜ, Zellkulturüberstand
Referenzen und Herkunft der monoklonalen Antikörper
1) SCHUBERTH et al. (1991) Arbeitsgruppe Immunologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Konjugierte Antikörper
Der affinitätschromatographisch isolierte Antikörper „Esel (donkey)-anti-Maus IgG, schwere und leichte Kette“ wird mit Cy™5-Fluorescein konjugiert (Cy™5- DαM IgG (H+L), s. 3.1.2). Dieser Antikörper wird von Serumproteinen verschiedener Arten (Mensch, Rind, Pferd, Ziege, Ratte, Schwein, Hamster, Huhn und Schaf) absorbiert, und hat eine Konzentration von 1,4 mg/mL. Die Stammlösung wurde 1:100 mit MIF-Puffer (s. 3.1.3) verdünnt.
3.1.7 Materialien für die Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA)
Phorbol-Myristat-Acetat (PMA, s. 3.1.2) greift ohne Beteiligung von Rezeptoren in die Enzymkaskade ein, die an der Bildung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten (EMMEN- DÖRFFER et al. 1990) beteiligt ist. Durch PMA wird die Proteinkinase C und damit indirekt auch die für die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies wichtige NADPH- Oxidase aktiviert. PMA wurde in DMSO (s. 3.1.2) gelöst und in einer Konzentration von 1 mmol/L in aliquoten Teilen je 200 µL bei -20°C gelagert.
Materialen und Methoden
Dihydrorhodamin 123
Das nichtfluoreszierende Dihydrorhodamin 123 (DHR 123, s. 3.1.2) wird von Zellen aufgenommen und durch Oxidation (katalysiert durch Myeloperoxidase) zum grünfluoreszierenden Metaboliten Rhodamin 123 umgewandelt (EMMENDÖRFFER et al. 1990). Gekoppelt an die Zellmembran ist dieser Farbstoff durchflusszytometrisch bestimmbar und stellt ein Maß für die ROS-Bildung einer Zelle dar. Rhodamin 123 emittiert nach der Anregung durch den Argonlaser (488 nm) Licht im grünen Bereich von 534 nm.
Die Ausgangsubstanz wurde in DMSO (s. 3.1.2) gelöst (1,5 mg/mL) und in aliquoten Teilen zu 100 µl aufbewahrt. Durch Verdünnungen der Stammlösung mit PBS entstanden zwei Gebrauchslösungen: erste (1:100) Gebrauchslösung (15 µg/mL) und zweite (1:66,6) Gebrauchslösung (22,5 µg/mL). Alle DHR-Lösungen wurden bei einer Temperatur von – 20°C gelagert. Dabei galt zu beachten, dass die Verdünnung mit PBS aufgrund einer geringeren Stabilität innerhalb weniger Wochen aufzubrauchen war.
Feuchte Kammer
Um das Verdunsten von Flüssigkeiten während der Inkubationsphase im Brutschrank möglichst gering zu halten, wurde eine feuchte Kammer (s. 3.1.1) eingesetzt. Hierbei handelte es sich um eine Kunststoffbox mit Gittereinsatz, die mit etwa 20 mL einer 1%igen Kupfersulfatlösung (s. 3.1.2) befüllt wird.
3.1.8 Probanden
Bei allen Rindern handelte es sich um „Deutsche Schwarzbunte“ oder „Deutsche Rotbunte“. Die Tiere stammten entweder aus der Klinik für Geburtshilfe und Gynäkologie des Rindes oder aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Für die Experimente mit aus Pferdeblut isolierten PMN dienten insgesamt 3 klinisch gesunde Warmblutstuten aus der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Materialen und Methoden
40
Das benötigte Hundeblut wurde von Hunden der Rasse Beagle der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover gewonnen.
Für die hier vorgestellten Experimente mit PMN anderer Spezies stellten sich auch drei Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztliche Hochschule Hannover zur Blutspende zur Verfügung.
Alle Probanden waren bei der Probenentnahme klinisch gesund.
Materialen und Methoden
3.2 Methoden
3.2.1 Gewinnung und Isolierung von Leukozyten aus dem Blut 3.2.1.1 Blutentnahme
Das Blut wurde mit Hilfe des Vacutainersystems (s. 3.1.1) unter sterilen Bedingungen aus der gestauten Vena jugularis beim Pferd und Rind, aus der Vena cephalica antebrachii beim Hund und aus der Vena intermedia antebrachii beim Menschen entnommen. Dabei wurden Vacutainer-Röhrchen mit Kalium-EDTA Zusatz (s. 3.1.1) verwendet.
3.2.1.2 Isolierung der Leukozyten aus dem peripheren Blut
Nach der Entnahme wurde das Blut je nach Fragestellung und Spezies unterschiedlich sofort weiterverarbeitet.
3.2.1.2.1 Isolierung boviner Leukozyten aus dem peripheren Blut
3.2.1.2.1.1 Isolierung der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) Vom Rind wurden etwa 15 mL EDTA-Blut 1:2 mit sterilem PBS verdünnt und in einem 50 mL Röhrchen über einen einstufigen diskontinuierlichen Gradienten von 15 mL Ficoll (s.
3.1.4) geschichtet. Bei 10°C und 1.275 x g wurde für 30 Minuten ohne Bremse zentrifugiert. Aufgrund ihrer spezifischen Dichte sammelten sich die mononukleären Zellen (Lymphozyten und Monozyten) und einige Thrombozyten in einer Interphase zwischen dem Plasma und dem Ficoll. Unterhalb des Ficolls lagen in einem Pellet die Erythrozyten und die polymorphkernigen Blutzellen vor. Die MNC-Interphase wurde zuerst abgenommen und, wenn erforderlich, zur Herstellung von Referenzzellen (s. 3.2.3.1)
Materialen und Methoden
42
eingesetzt, ansonsten verworfen. Mit dem darunter liegenden Erythrozyten-Granulozyten- Sediment wurde bei 4°C anschließend eine hypotone Lyse durchgeführt, um Erythrozyten zu eliminieren. Dazu wurden 20 mL Aqua tridest. zu etwa 10 mL Erythrozytensediment gegeben und dieses 10 Sekunden geschwenkt. Die Isotonie wurde durch Zugabe von 20 mL 2xPBS (s. 3.1.3) wieder hergestellt. Dieses Gemisch wurde 10 Minuten bei 500 x g und 4°C zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurde das Zentrifugat in der restlichen Flüssigkeit resuspendiert. Da in der Regel beim Rind mit einer hypotonen Lyse nicht alle Erythrozyten entfernt werden, ist der Lysevorgang zu wiederholen: zum resuspendierten Zellpellet werden 20 mL Aqua tridest. zugegeben, 10 Sekunden geschwenkt und erneut 20 mL 2xPBS zugegeben, bei 4°C, 220 x g pelletiert und anschließend mit PBS gewaschen:
das Zellpelet wird mit 20 mL PBS resuspendiert, dann bei 100 x g für 10 Minuten und bei 4°C abzentrifugiert, der Überstand wird anschließend entfernt. Die Reinheit so gewonnenen PMN lag über 95%. Sie hatten eine Vitalität (s. 3.2.5) von über 98%.
3.2.1.2.1.2 Separation der Gesamtleukozyten
Gerinnungsgehemmtes Vollblut (Kalium-EDTA, Volumen: 10 mL, s. 3.1.1) wurde in ein 50 mL Röhrchen (s. 3.1.1) überführt. Alle anschließenden Schritte wurden auf Eis bzw. bei 4°C durchgeführt. Die Erythrozyten des Vollblutes wurden hypoton lysiert, indem 20 mL Aqua tridest. in das Röhrchen gegeben wurden. Nach 10sekündigem Schwenken wurden 20 mL doppelt konzentriertes PBS (2xPBS, s. 3.1.3) hinzugefügt und das Röhrchen erneut geschwenkt. Nach der Zentrifugation bei 220 x g für 10 Minuten wurde der Überstand abgegossen, das Pellet resuspendiert und der Lysevorgang wiederholt. Nach erneuter Zentrifugation (s. oben) schloss sich ein Waschschritt an. Hierzu wurde das Pellet in 20 mL PBS resuspendiert und dann bei 220 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Abgießen des Überstandes wurde der Waschschritt wiederholt. Schließlich wurde das Pellet erneut in der restlichen Flüssigkeit resuspendiert und auf die gewünschte Zellkonzentration mit DMEM (s. 3.1.3) eingestellt.
