3 Material und Methoden
5.4 Einfluss von Percoll auf PMN
Zwar werden aus Percoll ausgekleideten Vertiefungen nach der Testinkubation die eingesetzten PMN-Zahlen weitgehend vollständig wiedergewonnen und stehen repräsentativ für die Ausgangspopulation zur Messung zur Verfügung, doch stellt sich die Frage, wie sich das Percoll auf die einzelnen Zellfunktionen auswirkt.
Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies bleibt durch Percoll weitgehend unbeeinflusst.
Den Ergebnissen der Untersuchungen mit Percoll-Kissen (s. Abb. 5) zufolge scheint PMA seine stimulierende Wirkung am Enzymsystem der ROS-Bildung ungehindert zu erfüllen. Das im Zellinneren gebildete fluoreszierende Rhodamin-123 verliert durch das Percoll nicht an Fluoreszenzintensität. Der frühere und stärkere Anstieg der Fluoreszenzintensität auf Percoll gegenüber Untersuchungen ohne Percoll-Kissen liegt vermutlich an dem höheren Anteil besonders aktiver Zellen, die an der Plastikoberfläche adhärieren – vielleicht sogar durch den Doppelstimulus (Plastik plus PMA) desintegrieren auf Percoll aber mit zur Auswertung zur Verfügung stehen.. Dadurch wird der Wert der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität pro Zelle im Ansatz erhöht, was einerseits das Percoll-Verfahren empfindlicher macht, andererseits aber der tatsächlichen ROS-Kapazität der zu prüfenden PMN wesentlich näher kommt, als die nicht-adhärenten
„Restzellen“ nach Plastikinkubation.
5.5 Testoptimierung
Um den Test zu optimieren ist auch von Bedeutung, dass nicht nur Zellverluste durch Mikrotiterplatten minimiert werden, sondern möglichst keine weiteren Zellverluste durch die Probenröhrchen hinzukommen (s. Abb. 8). Deswegen es ist wichtig, die Probe aus der Mikrotiterplatte direkt vor der Messen in die vorgekühlten FACS-Röhrchen mit Sheath-To-Pro-3 zu übertragen und sofort zu messen.
Wie in zahlreichen Veröffentlichungen bereits beschrieben, regt Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) die Zellen zur ROS-Bildung an (PERTICARARI et al. 1994, RAIDAL et al.
1998). Mit steigender Konzentration erhöht sich die Menge der gebildeten
Diskussion
Sauerstoffspezies. Ab einer Konzentration von 100 nmol/L PMA erreicht die ROS-Bildung auf Percoll-Kissen ein Plateau. Es ist deshalb ausreichend, die Sauerstoffradikalbildung bei Konzentrationen von 0 bis 100 nmol/L PMA zu überprüfen.
Wichtig ist auch, dass für den Percoll-Test beim Messen im Durchflusszytometer ein langsamer Messmodus gewählt wird, um Zellverformung bei einer schnellen Erfassung zu vermeiden (s. Abb. 4).
Die modifizierte durchflusszytometrische Methode zur Bestimmung der ROS-Produktion von neutrophilen Granulozyten hat viele Vorteile im Vergleich zu anderen durchflusszytometrischen Verfahren. Sie ist technisch einfacher, da alle Reagenzien vor dem Testablauf in das Percoll-Kissen eingemischt werden, womit 15 minütige Reaktionsschritte mit stets erneuten Reagenzienzugaben und Temperaturschwankungen entfallen. Insgesamt wird die Erfassung der ROS-Bildungskapazität nicht nur sensitiver sondern auch „wirklichkeitsnäher“: Es werden weitgehend alle eingesetzten Zellen ausgewertet, nicht nur die wenigen, die nicht am Kunststoff der Mikrotiterplatten und der FACS-Röhrchen haften bleiben. Zudem sind die Zellen nur einem kontrollierten Stimulus (hier PMA) und nicht zusätzlich einem unkontrollierten Einfluss durch die Plastikadhärenz ausgesetzt. So hat man ein weitgehend komplettes Bild des ROS-Bildungsvermögens der eingesetzten neutrophilen Granulozyten. Allerdings muss gesagt werden, dass bei älteren FACS-Geräten, die eventuell belastete Schläuche haben, unter Umständen eine längere Messzeit beobachtet werden kann, weil zu viele Percoll-Partikel gemessen und den Zellfluß eventuell beeinträchtigen können. Bei neueren FACS-Geräten ist das nicht der Fall. Eine gründliche Durchspülung des Systems nach der Percoll Messung ist auf jeden Fall zu empfehlen.
So konnten in der vorliegenden Studie viele Ursachen für mögliche Schwankungen erkannt und bei der Überprüfung der ROS-Bildung auch beseitigt werden.
Zusammenfassung
96
6 Zusammenfassung
Liliya Mironova: Modifizierte durchflusszytometrische Methode zum empfindlicheren Nachweis der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies neutrophiler Granulozyten in vitro.
In der vorliegenden Arbeit wird eine verbesserte Technik vorgestellt, die nicht nur eine empfindlichere qualitative, sondern auch eine zuverlässigere und aussagekräftigere quantitative Auswertung der Bildung von reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) neutrophiler Granulozyten (PMN) in vitro ermöglicht. In den bisher eingesetzten durchflusszytometrischen Verfahren besteht der größte Nachteil in den stark variablen und teils sehr hohen Zellverlusten während der Aktivierungsphase der PMN in Reaktionsgefäßen aus Plastik. Diese variablen Zellverluste bieten ein unzuverlässiges Ergebnis, da sie die Frage offen lassen, wie repräsentativ die auswertbaren restlichen Zellen für die eingesetzte Gesamtzellpopulation sind.
Um diese Verluste weitgehend zu vermeiden, wird in dem hier entwickelten neuen Verfahren die Reaktion der PMN in einer Zellkulturmikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen auf einem isotonen Percoll-Kissen von 100 µL/ Vertiefung (Percoll-Test) statt wie bisher auf der Plastikoberfläche geprüft. Zur Bewertung des Percoll-Tests wurden die meisten Parameter vergleichend an identischen Zellpräparationen zeitgleich – und meist in denselben Mikrotiterplatten – direkt auf Plastik (ohne Percoll-Kissen) jedoch unter sonst gleichen Bedingungen durchgeführt (Plastik-Test). In diesen Vergleichsuntersuchungen waren somit die einzigen Unterschiede der Kontakt der Zellen mit der Plastikoberfläche oder mit dem isotonen Percoll.
In beide ROS Testarten wurden stets Triplikate von 3 x 105 gereinigter PMN in 50 µL Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) alleine, unter Zusatz des Fluoreszenzfarbstoffes Dihydrorhodamin 123 (DHR) – als grünfluoreszierender (FL1) Indikator der intrazellulären ROS-Produktion - in einer Endkonzentration von 0,75 µg/mL sowie ohne oder mit dem rezeptorunabhängigen Zellaktivator Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L eingesetzt. Beide Testarten wurden für 45 Min. bei 37 °C und 5% CO2 in Luft inkubiert und die Reaktion durch
Zusammenfassung
Lagerung auf feuchtem Eis (4°C) angehalten. Durch Zugabe einer definierten Anzahl Cy™5-markierter (rotfluoreszierender: FL4) mononukleärer Referenzzellen wurde eine Quantifizierung der geernteten PMN möglich. Der Zusatz des tief rot fluoreszierenden (FL4) Farbstoffes To-Pro-3 erlaubte eine Beurteilung der Vitalität der PMN.
Diese vergleichenden Untersuchungen, primär mit gereinigten PMN aus dem Blut gesunder Rinder durchgeführt, brachten eine Reihe überraschender Ergebnisse:
Werden PMN ohne jeden Zusatz für 45 Min. bei 37°C auf Plastik inkubiert, so gehen allein dadurch ca. 50 % der Zellen für die Auswertung verloren. Werden sie zusätzlich noch mit 10 bis 10.000 nmol/L PMA stimuliert, betragen die Verluste über 80 bis 95 %. Da die gewonnen und im Durchflusszytometer auswertbaren „restlichen“ PMN auch zunehmend Anteile an „toten“ (To-Pro-3 positiven) Zellen (9% ohne PMA bis 30% mit PMA) zeigen, dürften die drastischen Verluste sowohl auf Plastikadhärenz als auch auf Zelltod beruhen.
Dazu mag noch beitragen, dass in den üblichen Röhrchen zur durchflusszytometrischen Auswertung (FACS-Röhrchen) aus Polystyrol selbst nicht aktivierte PMN während 40 Min.
Lagerung bei 4°C in beachtlichen Mengen verloren gehen. Diese Verluste lassen sich jedoch durch Polypropylenröhrchen und direkte Messung nach der Zellentnahme aus der Mikrotiterplatte weitgehend reduzieren.
Werden die gleichen PMN statt auf Plastik auf einem isotonen Percoll-Kissen von 100 µL/Vertiefung jedoch sonst identisch behandelt, so treten ohne und mit bis zu 100 nmol/L PMA maximal 5% PMN-Verluste auf und selbst bei Zugabe von 10.000 nmol/L PMA erreichen die Verluste höchstens 20% der eingesetzten Zellmenge. Zudem ist gegenüber der Vitalität der Ausgangspopulation (< 2% „tote“ PMN) auch nach 45 Min auf Percoll ohne und mit bis 10.000 nmol/L PMA keine Änderung zu sehen. Die durch Percoll erzielte Vermeidung oder starke Reduktion der PMN-Verluste ließ sich durch keine der hier geprüften 5 unterschiedlichen kommerziellen Mikrotiterplatten auch nur annähernd erreichen.
Funktionell unterschieden sich PMN ebenfalls erheblich, wenn sie direkt auf Plastik oder auf Percoll inkubiert wurden: Die alleinige Inkubation von PMN auf Plastik ohne jeden weiteren Zusatz führte zu einer Zunahme der Zellgröße und einer Induktion der ROS-Produktion (gemessen an der Intensität der DHR-Fluoreszenz) um den Faktor 14 bis 27 im Vergleich zur Ausgangspopulation. Im Gegensatz dazu wurde die Morphologie der PMN
Zusammenfassung
98
durch Percoll nicht vergrößert und ihre ROS-Aktivität war lediglich 2 x die der Ausgangspopulation. Diese Ergebnisse sprachen dafür, dass Plastik alleine einen unkontrollierbaren Einfluss auf die PMN hatte, der sich neben den Zellverlusten als Costimulator mit unbekannter Auswirkung bemerkbar machen konnte. Dafür sprachen auch die Ergebnisse unter Zusatz von PMA als Zellaktivator: Während auf Plastik erst ab 100 nmol/L PMA eine deutliche ROS-Produktion nachweisbar und ein Plateau erst bei 1.000 bis 10.000 nmol/L PMA erreicht wurde, reagierten die gleichen PMN auf Percoll um den Faktor 10 bis 100 x empfindlicher: Ab 10 nmol/L PMA war bereits eine starke ROS-Produktion zu messen, die meist schon bei 100 nmol/L PMA ihr Plateau erreichte, das häufig deutlich über dem des vergleichbaren Plastik-Tests lag. Neben der Empfindlichkeit war auch die Reaktionsbreite auf Percoll (bei 10 nmol/L PMA: 373 – 634 x und bei 100 nmol/L PMA: 914 – 1.080 x die ROS-Produktion der Kontrolle ohne PMA) wesentlich höher als auf Plastik (bei 100 nmol/L PMA: 8 – 10 x und bei 1.000 – 10.000 nmol/L PMA:
45 – 63 x). Da auf Percoll bereits mit 100 nmol/L PMA das Stimulationsplateau erreicht war, der PMA-Konzentration, bei der auch auf Percoll die Zellverluste über 5% stiegen, war eine nahezu verlustfreie Bestimmung der ROS-Produktion von PMN in vitro dank des Percoll-Kissens und dem hier beschriebenen Verfahren möglich.
Prinzipiell ähnlich vorteilhaft erwies sich dieses neue Verfahren auch bei Hund, Mensch und Pferd. Zudem ermöglichte es den Nachweis, dass autologe Thrombozyten im Verhältnis 0,1 bis 100 pro PMN keinen erkennbaren Einfluss auf die ROS-Produktion nach PMA-Stimulation hatten. Deutlich anders war es bei 50% autologen MNC, die vermutlich durch Absorption von PMA als auch möglicherweise durch regulativen Einfluss die ROS-Produktion von PMN minderten.
Summary
7 Summary
Liliya Mironova: A modified flow citometric method with enhanced sensitivity for the detection of reactive oxygen spezies generated by neutrophilic granulocytec in vitro.
An improved technique is described providing a more sensitive qualitative as well as a more reliable and informative quantitative evaluation of the generation of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils in vitro. A major drawback of presently practised flow cytometric ROS-measurements is the variable loss of considerable amounts of PMN during their activation on plastic. These variable cell losses provide unreliable results because it is unknown to which extend the residually measurable cells really represent the initial population to be tested.
In order to largely avoid such cell losses our new technique monitors the reactivity of PMN in 96 well microtiter plates on an isotonic Percoll cushion of 100 µL per well (Percoll-test) instead of placing the cell directly on plastic. For evaluation of the Percoll-test most of the parameters investigated were achieved contemporarily by identical cell preparations and conditions – usually within the same microtiter plate – however placing the cells directly on plastic. Thus, the only differences in these comparative tests were the contact of PMN to either plastic or Percoll.
Both types of ROS-tests included triplicates of 3 x 105 purified PMN in 50 µL Dulbecco`s modified Eagle`s medium (DMEM) alone, with the addition of Dihydrorhodamine 123 (DHR), a green fluorescing indicator (FL1) of intracellular ROS-production, in a final concentration of 0,75 µg/mL with or without 1 to 10.000 nmol/L of phorbol-12-myristat-13-acetate (PMA), a receptor independent activator of cells. All tests were incubated for 45 min. at 37°C in 5% CO2 in air and stopped by placing them on wet ice (4°C). Prior to flowcytometric evaluation the addition of a defined amount of red fluorescing (FL4) CyTM5-labelled mononuclear reference cells permitted quantitation of the harvested PMN.
Addition of the infra red fluorescing (FL4) dye To-Pro-3 allowed evaluation of cell viability.
These comparative investigations were mainly performed with PMN purified from the peripheral blood of various healthy cows. They provided a number of surprising results:
Summary
100
About 50% of the PMN incubated on plastic without any addition were lost for evaluation within 45 min. of incubation at 37°C. Stimulation of these cells by 10 to 10.000 nmol/L of PMA increased PMN losses to more than 80 and 95% of the input. Due to the fact that the residually harvested cells comprised an increasing number of “dead” (To-Pro-3 positive) cells (9% without and up to 30 % with PMA) the remarkable cell losses might be caused by cell death in addition to strong adherence to plastic. An additional loss factor is most likely the polystyrene tubes usually employed for flow cytometry (FACS tubes). Simple storage of none activated PMN for 40 min. at 4°C in these tubes can cause a considerable cell loss.
This can be reduced or avoided by using polypropylene tubes instead plus measuring the cells in the flow cytometer immediately after harvest from the well into the tube.
Identical treatment of PMN on a 100 µL Percoll-cushion per well instead on plastic reduced cell losses to a maximum of 5% of the input when incubated with or without up to 100 nmol/L of PMA. More than 100 nmol/L of PMA increased cell losses but hardly above 20%. Moreover the cell viability of the stock PMN preparation (< 2% “dead” cells) will not change during 45 min. of incubation with and without up to 10.000 nmol/L of PMA. The reduction of PMN losses achieved by the Percoll-cushion could by no means be reached by any of the 5 different brands of commercial microtiter plates tested.
Also the functional differences were remarkable between plastic or Percoll incubated PMN:
Plain incubation of PMN on plastic without any addition resulted in an increase in cell size plus an induction of ROS-production (by means of DHR fluorescence) by factors between 14 and 27 as compared to the stock suspension of PMN. In contrast to plastic Percoll did neither increase cell morphology nor did it induce ROS-production by more than 2. These results indicate an unpredictable costimulatory influence of the plastic surface on PMN.
This view is supported by the results achieved in the presence of PMA as cell activator: On plastic a minimum concentration of 100 nmol/L of PMA was required to induce a clearly detectable ROS-production and only 1.000 or 10.000 nmol/L of PMA were able to achieve a plateau level of ROS. On Percoll, however, the same PMN responded 10 to 100 times more sensitive to PMA: With 10 nmol/L of PMA a strong ROS-production could be reliably documented and 100 nmol/L of PMA was enough to generate the plateau level of ROS which was frequently clearly above the plateau on plastic. In addition to improved sensitivity the range of reactivity was considerable wider on Percoll as compared to plastic:
Summary
PMN stimulated with 10 nmol/L of PMA diplayed a ROS-production which was 373 – 634 times that of the same cells under identical conditions but without PMA. And with 100 nmol/L of PMA even factors of 914 – 1.080 were achieved. These were remarkable higher than those on plastic and with higher concentration of PMA: 1.000 to 10.000 nmol/L of PMA resulted only in factors of 45 – 63.
As 30 to 100 nmol/L of PMA are sufficient to induce maximal ROS-production in PMN on Percoll these concentrations stay below those were cell losses on Percoll might exceed 5%.
Thus, ROS studies on Percoll can be performed without any PMN loss greater than 5 % for most of the species tested.
This new technique has been shown to be basically applicable to cattle as well as to dogs, humans and horses. It also made possible to document that 0,1 up to 100 autologous platelets have no detectable influence on the PMA induced ROS-production of PMN. In contrast, 50 % of autologous MNC reduce the ROS-production of PMN due to absorption of PMA and perhaps also by means of regulatory influence.
Literaturverzeichnis
102
8 Literaturverzeichnis
ALLEN, R. C. (1977):
Evaluation of serum opsonic capacity by quantitating the initial chemiluminescent response from phagocyting polymorphonuclear leukocytes.
Infect Immun. 15, 828-833 ARNAOUT, M. A. (1990a):
Leukocyte adhesion molecules deficiency: its structural basis, pathophysiology and implications for modulating the inflammatory response.
Immunol Rev. 114, 145-180 ARNAOUT, M. A. (1990b):
Structure and function of the leukocyte adhesion molecules CD11/CD18.
Blood. 75, 1037-1050
ARNAOUT, M. A., N. DANA, J. PITT u. R. F. TODD 3rd (1985):
Deficiency of two human leukocyte surface membrane glycoproteins (Mo1 and LFA- 1).
Fed Proc. 44, 2664-2670
ARNAOUT, M. A., N. DANA, S. K. GUPTA, D. G. TENEN u. D. M. FATHALLAH (1990):
Point mutations impairing cell surface expression of the common beta subunit (CD18) in a patient with leukocyte adhesion molecule (Leu-CAM) deficiency.
J Clin Invest. 85, 977-981
BASS, D. A., J. W. PARCE, L. R., DECHATELET, P. SZEJDA, M. C. SEEDS u. M.
THOMAS (1983):
Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: a graded response to membrane stimulation.
J Immunol. 130, 1910-1917 BAUER, B. (1994):
Blut: ein flüssiges Organsystem.
In: KLINKE, R. u. S. SILBERNAGL (Hrsg.) Lehrbuch der Physiologie.
Thieme Verlag, Stuttgart, New York, S. 183 – 209 BOKOCH, G. M. (1995):
Chemoattractant signaling and leukocyte activation.
Blood. 86, 1649-1660
Literaturverzeichnis
BRENNEIS, H., A. SCHMIDT, P. BLAAS-MAUTNER, I. WORNER, R. LUDWIG u.
G. M. HANSCH (1993):
Chemotaxis of polymorphonuclear neutrophils (pmn) in patients suffering from recurrent infection.
Eur J Clin Invest. 23, 693-698 CASSATELLA, M. A. (1996):
Cytokines produced by polymorphonuclear neutrophils: molecular and biological aspects.
Verlag Springer, Heidelberg CASSATELLA, M. A. (1999):
Production of cytokines by polymorphonuclear neutrophils.
In: D. I. GABRILOVICH (Hrsg.): The Neutrophils: New outlook for old cells.
Imperial College Press, London, S. 79-150
CHACIN, M., P. J. HANSEN, u. M. DROST (1990) :
Effect of stage of the estrous cycle and steroid treatment on uterine immunoglobulin content and polymorphonuclear leukocytes in cattle.
Theriogenology 34, 1169-1184
CLIFFORD, D. P. u. J. E. REPINE (1982):
Hydrogen peroxide mediated killing of bacteria.
Mol Cell Biochem 49, 143-149
da SILVA, F. M., A. M. MASSART-LEEN u. C. BURVENICH (1994):
Development and maturation of neutrophils.
Vet Q. 16, 220-225
DALE, D. C., W. C. LILES, C. LLEWELLYN u. T. H. PRICE (1998):
Effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) on neutrophil kinetics and function in normal human volunteers.
Am J Hematol. 57, 7-15
DJEU, J. Y. u. D. K. BLANCHARD (1987):
Regulation of human polymorphonuclear neutrophil (PMN) activity against Candida albicans by large granular lymphocytes via release of a PMN-activating factor.
J Immunol. 139, 2761-2767
DONNELLY, C. W., E. H. BRIGGS, C. M. BELIVEAU u. W. L. BEEKEN (1987):
In vitro phagocytosis of Listeria monocytogenes by neutrophils and macrophages of bovine origin.
Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 87, 279
Literaturverzeichnis
104
DORE, M., D. O. SLAUSON u. N. R. NEILSEN (1990):
Membrane NADPH oxidase activity and cell size in bovine neonatal and adult neutrophils.
Pediatr Res. 28, 327-331 EICKHOFF, S. (2002):
Standardisierung der quantitativen Messung reaktiver Sauerstoffspezies und der Phagozytoseaktivität caniner neutrophiler Granulozyten mittels Durchflusszytometrie.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
EMMENDÖRFFER, A. M., M. HECHT, L. M. LOHMANN-MATTHES u. J. ROESLER (1990):
A fast and easy method to determine the production of reactive oxygen intermediates by human and murine phagocytoses using dihydrorhodamin 123.
J Immunol Methods 131, 269-275 ENGELKE, F.W. (2000):
Aufbau eines analytischen Endometritismodells bei der Stute.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
FRANK, J. H. M. (2000):
Wanderverhalten neutrophiler Granulozyten in einem Transmigrationsverfahren.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
FUKUSHIMA, K., M. ANDO, K. ITO, M. SUGO u. S. ARAKI (1990):
Stimulus- and cumulative dose-dependent inhibition of O2-production by polymorphonuclear leukocytes of patients receiving corticosteroids.
J Clin Lab Immunol. 33, 117-123
GEMSA, D., J. R. KALDEN u. K. RESCH (1991):
Immunologie: Grundlagen – Klinik – Praxis, 3. Auflage Verlag Georg Thieme, Stuttgart, New York
GERARDI, A. S. (1996):
Bovine leucocyte adhesion deficiency: a review of a modern disease and its implications.
Res Vet Sci. 61, 183-186
GIGER, U., L. A. BOXER, P. J. SIMPSON, B. R. LUCCHESI u. R. F. TODD, 3RD (1987):
Deficiency of leukocyte surface glycoproteins Mo1, LFA-1, and Leu M5 in a dog with recurrent bacterial infections: an animal model.
Blood. 69, 1622-1630
GOETZMAN, E. A. (1993):
Flow cytometry: basic concepts and clinical applications in immunodiagnostics.
Clin Lab Sci. 6, 177-182
Literaturverzeichnis
GOODMAN, E. B., D. C. ANDERSON u. A. J. TENNER (1995):
C1q triggers neutrophil superoxide production by an unique CD18-dependent mechanism.
J Leukoc Biol. 58, 168-176
GUIDRY, A. J., M. J. PAAPE, K. E. SQUIGGINS, M. WORKU, C. N. HAMBLETON u. R. H. MILLER (1992):
Monoclonal antibodies to subpopulations of bovine neutrophils.
Comp. Haematol. Int. 2, 18-23 HENDRICKS, A. (1998):
Funktionelle Charakterisierung der Interaktion zwischen bakteriellen Superantigenen und bovinen MHC-Klasse II-Molekülen.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
HOEBEN, D., C. BURVENICH u. R. HEYNEMAN (1997a):
Influence of antimicrobial agents on bactericidal activity of bovine milk polymorphonuclear leukocytes.
Vet Immunol Immunopathol. 56, 271-282
HOEBEN, D., H. DOSOGNE, R. HEYNEMAN u. C. BURVENICH (1997b):
Effects of antibiotics on the phagocytotic and respiratory burst activity of bovine granulocytes.
Eur J Pharmacol. 332, 289-297
HOEBEN, D., C. BURVENICH u. A. M. MASSART-LEEN (1998):
Glucocorticosteroids and in vitro effects on chemiluminescence of isolated bovine blood granulocytes.
Eur J Pharmacol. 354, 197-203 HOFMANN, W. (1992):
Rinderkrankheiten
Bd. 1. Innere und chirurgische Erkrankungen.
Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart HOGG, N. (1992):
Roll, roll, roll your leukocyte gently down the vein.
Immunol Today. 13, 113-115
JANEWAY, C. A. u. P. TRAVERS (1997):
Immunologie, 2. Auflage
Verlag Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, Oxford
JANEWAY, C. A., P. TRAVERS, M. WALPORT u. M. SHLOMCHIK (2002):
Immunologie, 5. Auflage
Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, Oxford
Literaturverzeichnis
106
JOHNSON, K. L. (1992):
Basics of flow cytometry.
Clin Lab Sci. 5, 22-24
KIJAS, J. M., T. R. BAUER, JR., S. GAFVERT, S. MARKLUND, G. TROWALD-WIGH, A. JOHANNISSON, A. HEDHAMMAR, M. BINNS, R. K. JUNEJA, D. D.
HICKSTEIN u. L. ANDERSSON (1999):
A missense mutation in the beta-2 integrin gene (ITGB2) causes canine leukocyte adhesion deficiency.
Genomics. 61, 101-107 KLEBANOFF, S. J. (1980):
Oxygen metabolism and the toxic properties of phagocytes.
Ann Intern Med. 93, 480-489 KLEIN, J. (1991):
Immunologie.
VCH-Verlagsgesellschaft, Weinheim
KRAFT, W., U. M. DÜRR, M. FÜRLL, H. BOSTEDT u. K. HEINRITZI (1997):
Hämatologie.
In: KRAFT, W. u. U. M. DÜRR (Hrsg.): Klinische Labordiagnostik in der Tiermedizin, 4. Auflage
Verlag Schattauer, Stuttgart, New York, S. 43 – 77 KRAFT, W. u. U. M. Dürr (1999):
Klinische Labordiagnostik in der Tiermedizin, 5.Auflage Verlag Schattauer, Stuttgart, New York
KWON, M.-S. (1987):
Vergleichende Untersuchungen von Eigenschaften neutrophiler Granulozyten.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
LAFRADO, L. J., D. A. QUINTANA, M. A. JAVADIAN u. J. C. KELLIHER (1989):
Polymorphonuclear leukocyte function in HIV-1-infected chimpanzees.
Vet Immunol Immunopathol. 21, 3-12
Vet Immunol Immunopathol. 21, 3-12