Gewinnung und Isolierung von Leukozyten aus dem Blut .1 Blutentnahme

Das Blut wurde mit Hilfe des Vacutainersystems (s. 3.1.1) unter sterilen Bedingungen aus der gestauten Vena jugularis beim Pferd und Rind, aus der Vena cephalica antebrachii beim Hund und aus der Vena intermedia antebrachii beim Menschen entnommen. Dabei wurden Vacutainer-Röhrchen mit Kalium-EDTA Zusatz (s. 3.1.1) verwendet.

3.2.1.2 Isolierung der Leukozyten aus dem peripheren Blut

Nach der Entnahme wurde das Blut je nach Fragestellung und Spezies unterschiedlich sofort weiterverarbeitet.

3.2.1.2.1 Isolierung boviner Leukozyten aus dem peripheren Blut

3.2.1.2.1.1 Isolierung der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) Vom Rind wurden etwa 15 mL EDTA-Blut 1:2 mit sterilem PBS verdünnt und in einem 50 mL Röhrchen über einen einstufigen diskontinuierlichen Gradienten von 15 mL Ficoll (s.

3.1.4) geschichtet. Bei 10°C und 1.275 x g wurde für 30 Minuten ohne Bremse zentrifugiert. Aufgrund ihrer spezifischen Dichte sammelten sich die mononukleären Zellen (Lymphozyten und Monozyten) und einige Thrombozyten in einer Interphase zwischen dem Plasma und dem Ficoll. Unterhalb des Ficolls lagen in einem Pellet die Erythrozyten und die polymorphkernigen Blutzellen vor. Die MNC-Interphase wurde zuerst abgenommen und, wenn erforderlich, zur Herstellung von Referenzzellen (s. 3.2.3.1)

Materialen und Methoden

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eingesetzt, ansonsten verworfen. Mit dem darunter liegenden Erythrozyten-Granulozyten-Sediment wurde bei 4°C anschließend eine hypotone Lyse durchgeführt, um Erythrozyten zu eliminieren. Dazu wurden 20 mL Aqua tridest. zu etwa 10 mL Erythrozytensediment gegeben und dieses 10 Sekunden geschwenkt. Die Isotonie wurde durch Zugabe von 20 mL 2xPBS (s. 3.1.3) wieder hergestellt. Dieses Gemisch wurde 10 Minuten bei 500 x g und 4°C zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurde das Zentrifugat in der restlichen Flüssigkeit resuspendiert. Da in der Regel beim Rind mit einer hypotonen Lyse nicht alle Erythrozyten entfernt werden, ist der Lysevorgang zu wiederholen: zum resuspendierten Zellpellet werden 20 mL Aqua tridest. zugegeben, 10 Sekunden geschwenkt und erneut 20 mL 2xPBS zugegeben, bei 4°C, 220 x g pelletiert und anschließend mit PBS gewaschen:

das Zellpelet wird mit 20 mL PBS resuspendiert, dann bei 100 x g für 10 Minuten und bei 4°C abzentrifugiert, der Überstand wird anschließend entfernt. Die Reinheit so gewonnenen PMN lag über 95%. Sie hatten eine Vitalität (s. 3.2.5) von über 98%.

3.2.1.2.1.2 Separation der Gesamtleukozyten

Gerinnungsgehemmtes Vollblut (Kalium-EDTA, Volumen: 10 mL, s. 3.1.1) wurde in ein 50 mL Röhrchen (s. 3.1.1) überführt. Alle anschließenden Schritte wurden auf Eis bzw. bei 4°C durchgeführt. Die Erythrozyten des Vollblutes wurden hypoton lysiert, indem 20 mL Aqua tridest. in das Röhrchen gegeben wurden. Nach 10sekündigem Schwenken wurden 20 mL doppelt konzentriertes PBS (2xPBS, s. 3.1.3) hinzugefügt und das Röhrchen erneut geschwenkt. Nach der Zentrifugation bei 220 x g für 10 Minuten wurde der Überstand abgegossen, das Pellet resuspendiert und der Lysevorgang wiederholt. Nach erneuter Zentrifugation (s. oben) schloss sich ein Waschschritt an. Hierzu wurde das Pellet in 20 mL PBS resuspendiert und dann bei 220 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Abgießen des Überstandes wurde der Waschschritt wiederholt. Schließlich wurde das Pellet erneut in der restlichen Flüssigkeit resuspendiert und auf die gewünschte Zellkonzentration mit DMEM (s. 3.1.3) eingestellt.

Materialen und Methoden

3.2.1.2.2 Isolierung equiner Leukozyten aus dem peripheren Blut

Beim Pferd wurde nach 30 Minuten der Spontansedimentation bei Raumtemperatur (RT) der leukozytenreiche Überstand möglichst ohne Erythrozyten abgenommen und über einen zweistufigen Percoll-Gradienten geschichtet. Dafür wurde in einem 50-mL-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (s. 3.1.1) Percoll-Lagen (20°C) unterschiedlicher Dichte (54 und 76%, s. 3.1.4) übereinander geschichtet. Zunächst wurden 15 mL 54%igen Percoll in das Röhrchen gegeben. Diese Lage wurde mit Hilfe einer auf einer 10 mL Spritze (s. 3.1.1) aufgesetzten Kanüle (1,0 x 100 mm, s. 3.1.1) durchstochen und mit dem 10 mL 76%igen Percoll behutsam unterschichtet. Nach der Zentrifugation (1.000 x g, 20 Minuten, 20°C, ohne Bremse) wurde die obere Interphase mit den mononukleären Zellen abpipettiert und verworfen, bevor die untere Interphase mit den Granulozyten vorsichtig abgenommen und dreimal mit PBS gewaschen wurde. Hierzu werden die Zellen in 20 mL PBS resuspendiert und dann beim ersten Waschen bei 500 x g, beim zweiten – bei 200 x g und beim dritten - bei 80 x g, jeweils bei 4°C für 10 Minuten abzentrifugiert. Nach jeder Zentrifugation wurde der Überstand abgegossen. Nach dieser Separation lagen die PMN in einer Reinheit von über 98% vor.

3.2.1.2.3 Isolierung caniner Leukozyten aus dem peripheren Blut

Die Separation der Zellen wurde wie unter 3.3.1.2.1.1 beschrieben durchgeführt, nur erfolgte die Separation über Ficoll bei 1.100 x g, 4°C. Die MNC-Interphase wurde verworfen. Da die caninen Erythrozyten gegenüber hypotoner Lyse resistenter sind als bovine Erythrozyten, war in der Regel für die PMN-Phase eine viermalige hypotone Lyse erforderlich, wobei die anschließenden Zentrifugationen bei unterschiedlicher Sedimentationsstärke erfolgten (1. bei 500 x g, 2. bei 320 x g, 3. bei 200 x g, 4. bei 100x g, jeweils bei 4°C für 10 Minuten). Die das Pellet bildenden PMN wurden in DMEM (s. 3.1.3) auf eine definierte Zellkonzentration eingestellt.

Materialen und Methoden

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3.2.1.2.4 Isolierung humaner Leukozyten aus dem peripheren Blut

Humane Granulozyten wurden nach der von KWON (1987) beschriebenen Methode gewonnen, bei der keine Erythrozytenlyse vorgenommen werden muss. Hierbei wurde EDTA-Blut 1:2 mit einer 3%igen Dextran-Lösung (s. 3.1.4) versetzt. Nach 20-30 Minuten der Spontansedimentation bei RT wurde der leukozytenreiche Überstand abgenommen und bei 500 x g, 20°C für 10 Minuten abzentrifugiert. Das Sediment wurde in 25 mL PBS resuspendiert und über einen zweistufigen Percoll-Gradienten gegeben. Hierfür unterschichtete man eine 60%ige Percoll-Lösung (15 mL, s. 3.1.4) mit einer 70%igen Percoll-Lösung (10 mL, s. 3.1.4). Nach der Zentrifugation (750 x g, 25 Minuten, 20°C, ohne Bremse) wurde die obere Interphase mit MNC verworfen und die untere Interphase mit PMN vorsichtig abgenommen und zweimal mit PBS gewaschen (200 x g, 4°C für 10 Minuten) und mit DMEM (s. 3.1.3) auf eine definierte Zellkonzentration eingestellt..

Nach dem letzten Waschgang lagen die PMN in einer Reinheit und Vitalität von über 95%

vor.

3.2.1.3 Isolierung boviner Thrombozyten aus dem peripheren Blut

10 mL gewonnenes EDTA-Vollblut wurde in einem 50 mL Röhrchen (s. 3.1.1) mit 20 mL PBS (s. 3.1.3) verdünnt und bei 800 x g, 4°C, für 10 Min, ohne Bremse abzentrifugiert. Der Überstand wurde fast vollständig abgenommen und in ein neues Röhrchen überführt. Nach Auffüllen des Röhrchens mit PBS wurde es bei 2.500 x g, 4°C für 10 Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Thrombozytenpellet in der restlichen Flüssigkeit resuspendiert. Anschließend wurde die Suspension noch einmal in PBS gewaschen (s. oben) und mit DMEM (s. 3.1.3) auf eine definierte Zellkonzentration eingestellt.

Materialen und Methoden

3.2.2 Durchflusszytometrie

Ein Durchflusszytometer besteht aus einem optischen System, einem Fliesssystem, Signaldetektoren und Konvertern, sowie der dazugehörigen Computereinheit (JOHNSON 1992, GOETZMAN 1993).

Die Durchflusszytometrie basiert darauf, dass in Suspension befindliche Partikel

(Zellen) durch besondere Führung in einer Trägerflüssigkeit (Sheath fluid, s. 3.1.5) vereinzelt werden, so dass sie nacheinander einen bzw. zwei Laserstrahlen passieren können. Dabei streuen die Zellen das einfallende Laserlicht ohne Veränderung von dessen Wellenlänge, zum einen in Verlängerung des Strahls (Vorwärtsstreulicht, Forward Scatter, FSC) und zum anderen im rechten Winkel dazu (Seitwärtsstreulicht, Side Scatter, SSC).

Dieses Streulicht wird von zwei Detektoren mit jeweils 1024 Kanälen aufgefangen, in ein elektronisches Signal umgewandelt und an die angeschlossene Computereinheit weiter geleitet. Das Ausmaß des FSC spiegelt die Größe des Partikels wieder und ist von seinem Refraktionsindex abhängig, während das SSC von der Komplexität, die sich aus Oberflächenbeschaffenheit und Granularität der Zelle zusammensetzt, beeinflusst wird.

Das optische System des für die Untersuchungen eingesetzten Durchflusszytometers FACSCalibur^© (s. 3.1.1) entspricht einem Dual-Lasersystem, d.h. es verfügt über zwei Laser. Der Argonlaser erzeugt Licht der Wellenlänge 488 nm, der ihm zeitlich nachgeschaltete Diodenlaser Licht der Wellenlänge 635 nm. Dem Argonlaser sind zusätzlich zu den Streulichtdetektoren drei Fluoreszenzdetektoren zugeordnet. Der Detektor

„FL1“ nimmt Licht im Wellenlängenbereich von 500 – 560 nm (Grünfluoreszenz) auf, der Detektor „FL2“ arbeitet bei 543 – 627 nm (Orangefluoreszenz), und „FL3“ registriert Licht im Bereich von ≥ 650 nm (Rotfluoreszenz). Dem Diodenlaser ist der Detektor „FL4“

zugeordnet, der Ereignisse erfasst, die Licht im Bereich von 645 – 676 nm (Rotfluoreszenz) emittieren und die in definiertem zeitlichen Abstand nach der Passage des Argonlasers auftreten. Die Fluoreszenzintensität wird logarithmisch verstärkt und auf einer linearen Skala mit 1.024 Kanälen, die 4 Log-Dekaden (0-10.000) entspricht, dargestellt. So können pro Partikel, das die beiden Laser passiert, bis zu 6 Parameter (FSC, SSC, FL1 – FL4) erfasst werden und mit Hilfe der zugehörigen Software (WinMDI^©, TROTTER 1999) untereinander korreliert und ausgewertet werden.

Materialen und Methoden

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Die graphische Darstellung der Messwerte kann entweder als „Dotplot“, „Densityplot“ oder Histogramm erfolgen. Beim auch als Punktgraph bezeichneten „Dotplot“ werden zwei Parameter gegeneinander aufgetragen und bei jeder Schnittstelle der beiden Werte ein Punkt angezeigt (korrelierte Zweiparameterdarstellung). Der „Densityplot“ erweitert diese Darstellung um den Parameter der Häufigkeit, mit der das jeweilige Wertepaar während der Messung aufgetreten ist. Bereiche mit großer Häufigkeit bzw. Dichte

(„Densityplot“-„Dichtegraph“) werden hellgrau dargestellt, mit abnehmender Häufigkeit wird die Farbe der Bereiche zunehmend dunkler. Somit handelt es sich beim „Densityplot“ um eine Darstellung, die es ermöglicht, Schwerpunkte von Populationen besser zu differenzieren.

Das Histogramm stellt anhand der Abszisse die 1.024 Kanäle des jeweiligen Parameters dar und anhand der Ordinate die Anzahl der jeweiligen Messsignale in diesem Kanal.

Werden FSC und SSC in einem „Dotplot“ gegeneinander aufgetragen, so stellen sich morphologisch ähnliche Zellen als zusammenhängende Wolke dar. Werden aus Blut isolierte Zellen untersucht, so bilden ruhende lymphoide Zellen, Blasten und Monozyten sowie Granulozyten drei voneinander abgrenzbare Wolken. Allerdings lassen sich eosinophile Granulozyten nicht rein morphologisch von neutrophilen Granulozyten (PMN) unterscheiden. In der Korrelation von FL2 mit SCC stellen sich diese beiden Zellarten aber durch die höhere rotorange Autofluoreszenz der Eosinophilen als getrennte Wolken dar.

Mit Hilfe dieser Darstellungen lassen sich die gemessenen Partikel oder Zellen empfindlich charakterisieren und differenzieren sowie bestimmte Teilpopulationen gezielt untersuchen.

Ebenso ist es möglich, schon vor der Messung diese Teilbereiche zu definieren und nur diese Messwerte zu erfassen („lifegate“).