Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies

Zur Abtötung von Mikroorganismen besitzen die neutrophilen Granulozyten neben der Aktivierung von zahlreichen lysosomalen Enzymen auch die Fähigkeit, mikrobizide Sauerstoffmetaboliten (ROS) (SAWYER et al. 1989) zu generieren. Die in vivo u.a.

durch Mikroorganismen verursachte Aktivierung des Schlüsselenzyms beim Sauerstoffmetabolismus - die NADPH-Oxidase - wurde hier in vitro durch die Zugabe von PMA (s. 3.1.2 und 3.1.7) erreicht. PMA ist ein rezeptorunabhängiger ROS-Stimulator (EMMENDÖRFFER et al. 1990).

Die NADPH-Oxidase katalysiert spontan oder zusammen mit der Superoxid-Dismutase die Bildung des relativ schwach toxischen Wasserstoffperoxids, das aber mit Hilfe von Halogenionen durch die Myeloperoxidase aus den primären Granula zu einer stark bakteriziden unterchlorigen Säure umgesetzt wird (CLIFFORD u. REPINE 1982). Um die intrazelluläre Bildung von Wasserstoffperoxid nachzuweisen, wird der PMA-stimulierten Zellsuspension DHR 123 (s. 3.1.2 und 3.1.7) hinzugegeben, welches durch die Myeloperoxidase in das grünfluoreszierende Rhodamin 123 umgebaut wird. Da dieses Oxidationsprodukt an den Membranen der Zelle haftet und sie nicht verlassen kann, sind Granulozyten mit erhöhtem Sauerstoffmetabolismus aufgrund ihrer Grünfluoreszenz differenzierbar.

3.2.6.1 Herstellung der eingesetzten Zellsuspension

Falls nicht anders angegeben, wurden die PMNs jeder Spezies auf die finale Konzentration von 6 x 10⁶ Zellen pro mL DMEM eingestellt und auf Eis bei 4°C bereitgehalten.

3.2.6.2 Vorbereitung des Testansatzes (der Reagenzien für den ROS-Test) Die DHR-Gebrauchslösungen (s. 3.1.7) wurden unmittelbar vor Versuchsdurchführung aufgetaut. Aus der ersten Gebrauchslösung (15 µg/mL) wurde durch Verdünnung mit PBS (1:5) eine Arbeitslösung von 3 µg/mL für den Test ohne Percoll (Plastik-Test) erstellt, für

Materialen und Methoden

den Test mit Percoll™-Kissen (Percoll-Test) wurde die zweite Gebrauchslösung (22,5 µg/mL) ohne weitere Verdünnung eingesetzt.

Die PMA-Stammlösung (1 mmol/L, s. 3.1.7) wurde ebenfalls direkt vor der Versuchsdurchführung aufgetaut. Um die Endkonzentrationen im Testansatz von 0, 1, 10, 100, 1.000, 10.000 nmol/L zu erzielen, wurden mit PBS zwei Verdünnungsreihen angesetzt: die erste Verdünnungsreihe für den Percoll-Test mit 0, 30, 300, 3.000, 30.000 und 300.000 nmol/L PMA, die zweite für den Plastik-Test mit 0, 4, 40, 400, 4.000 und 40.000 nmol/L PMA.

3.2.6.3 Ansatz der Percoll-Kissen

Um möglichst feindisperses isotones Percoll (ohne Kristallbildung oder anderweitig bedingte Trübung) zu benützen, wird jeweils am Testtage steriles nicht isotones Percoll (s. 3.1.2) in der benötigten Menge frisch mit NaCl versetzt (100%iges frisches isotones Percoll, s. 3.1.4). Dieses wurde mit der zweiten DHR-Gebrauchslösung (s. 3.1.7) von 22,5 µg/mL Konzentration und den vorverdünnten PMA-Lösungen für den Percoll-Test (s.

3.2.5.2) so vermischt, dass im vollständigen Testansatz (einschließlich der Zellsuspension) das DHR in einer Endkonzentration von 0,75 µg/mL und das PMA in den für den jeweiligen Versuch gewünschten Endkonzentrationen von 0, 1, 10, 100, 1.000 und 10.000 nmol/L vorliegt (jeweils 5 µL DHR und PMA-Vorverdünnung zu 90 µL 100%iges isotones Percoll). Damit wird ein 90%iges Percoll-Kissen erreicht. Dieser Ansatz der Percoll-Kissen soll unmittelbar vor dem Einpipettieren in die Mikrotiterplatte unter lichtgeschützten Kautelen erfolgen.

3.2.6.4 Durchführung der ROS-Tests

3.2.6.4.1 Test: Induktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) auf Percoll-Kissen

In Triplikaten wurden 100 µL Percoll-Kissen (s. 3.2.6.3) mit jeder PMA-Konzentration (s.

3.2.6.2) je Vertiefungen einer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte (s. 3.1.1) vorgelegt. Auf

Materialen und Methoden

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jedes Percoll-Kissen wurden 50 µL der PMN-Suspension (6 x 10⁶ PMN/mL DMEM) vorsichtig überschichtet. Die abgedeckten Platten wurden für 45 Minuten bei 37°C und 5%

CO2 in Luft inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Abkühlung der Platte auf Eis bei 4°C für 20 Minuten im Dunkeln gestoppt.

3.2.6.4.2 Plastik-Test: ROS-Induktion auf Plastik ohne Percoll-Kissen

In jede Vertiefung einer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte (s. 3.1.1) wurden 25 µL der ersten DHR-Arbeitslösung (3 µg/mL, s. 3.2.6.2) und 25 µL der jeweiligen in 4facher Endkonzentration vorbereiteter PMA-Lösungen in PBS (s. 3.1.3) für den Plastik-Test (s.

3.2.6.3) vorgelegt. Anschließend wurden 50 µL der PMN-Suspension (6 x 10⁶ PMN/mL DMEM) zugegeben. Alle Ansätze wurden in Triplikaten durchgeführt. In der abgedeckten Platte folgte eine 45minütige Inkubation bei 37°C und 5% CO2 in Luft. Die Reaktion wurde durch Abkühlung der Platte auf Eis bei 4°C für 20 Minuten im Dunkeln gestoppt.

3.2.6.5 Durchflusszytometrische Auswertung der ROS-Produktion Vorbereitende Maßnahmen

Während des ROS-Tests wurden je FACS-Röhrchen (s. 3.1.1) 100 µL Sheath (s. 3.1.5) vorgelegt und bei 4°C auf Eis gekühlt.

Die To-Pro-3 Gebrauchslösung (1 µmol/L PBS, s. 3.1.5) wurde 10 Minuten vor der Messung dem Ansatz mit einer Endkonzentration von 0,1 µmol/L zugesetzt.

Messdurchführung

Für den Percoll-Test waren zusätzliche Einstellungen zu beachten:

1. Da das Percoll (wenig bei frischem, mehr bei altem) in der Leukozyteneinstellung hineinstrahlt, und damit die Anzahl der erfassten Zellen mindert (s. Abb. 3: Region 1), muss vor dem Messen des Percoll-Tests eine bestimmte Voreinstellung durchgeführt werden (lifegate, s. 3.2.2): man schneidet mit der Region 1 (R1) im Dotplot Fenster SSC/FSC Percoll heraus und gatet R1 not, damit nur eingesetzte PMN erfasst werden können.

Materialen und Methoden

Abb. 3: Notwendige Voreinstellung (lifegate) beim durchflusszytometrischen Messen nach dem Percoll-Test.

In der linken Abbildung (FSC/SSC) werden die morphologischen Eigenschaften der Zellen miteinander korreliert. Die Abszisse entspricht der Zellgröße und die Ordinate der Komplexität der Zelle. (PMN – neutrophilen Granulozyten; Ref.Zellen – Referenzzellen (bovine mononukleäre Zellen); Region 1 – Percoll Partikel).

Die rechte Abbildung (FSC/SSC) zeigt das Leukozytenbild ohne Percoll Partikel.

Abkürzungen: FSC, forward scatter, SSC, side scatter

2. Auch für den Percoll-Test war ein langsamer Messmodus erforderlich, um Zellverformung bei der schnellen Erfassung zu vermeiden (s. Abb.4).

Die Proben wurden unmittelbar vor der Messung aus der Mikrotiterplatte durch gründliches Pipettieren entnommen und in die vorbereiteten FACS-Röhrchen (s. oben) gegeben, gut durchgemischt und sofort, wenn nicht anders beschrieben, gemessen. Die Platte blieb dabei im Dunkeln und bei 4°C auf Eis stehen. Es wurden jeweils 10.000 Events pro Ansatz im Durchflusszytometer (s. 3.1.1) gemessen. Die Daten wurden dann mit Hilfe des Computerprogrammes WinMDI^© (TROTTER 1999) ausgewertet. Da in diesem Fall die eosinophilen Granulozyten nicht von den neutrophilen zu unterscheiden waren, mussten sie bei der Messung der mittleren Fluoreszenzintensität mit berücksichtigt werden. Der Mittelwert der drei Fluoreszenzintensitäten (Triplikate) der Granulozyten galt als Ergebnis der jeweiligen Probe.

Materialen und Methoden

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Langsamer Messmodus

Schneller Messmodus

Abb. 4: Zellverformung durch Percoll bei schnellem Messmodus im FASCCalibur^©.

Von drei gesunden Rindern wurden Triplikate à 3 x 10⁵ gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) entweder direkt in die Vertiefung (auf Plastik) oder auf ein zuvor in dieselbe Mikrotiterplatte eingefülltes Kissen aus 100 µL isotonem Percoll (s. 3.1.4) eingebracht. Die Zellen wurden für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO₂ in Luft inkubiert. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet. Es folgte die zellmorphologische Analyse im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit schnellem und langsamem Messmodus. Die Darstellung zeigt die Zellkomplexität (SSC) in Abhängigkeit von der Größe (FSC) der Zellen.

Abkürzungen: FSC, forward scatter, SSC, side scatter

Materialen und Methoden